CN117701707A - 一种同时检测α和β地中海贫血基因突变的引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测α和β地中海贫血基因突变的引物及方法。所述引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.16所示的序列；所述α和β地中海贫血基因突变包括：缺失型α地中海贫血基因突变、突变型α地中海贫血基因突变和突变型β地中海贫血基因突变。本发明检测方法覆盖的地贫突变类型更广更多，但所需要的引物对较少，适配样本类型较广，可适配抗凝静脉全血提取的基因组DNA或者胚胎植入前单细胞扩增产物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种同时检测α和β地中海贫血基因突变的引物及方法。
背景技术
地中海贫血(地贫)是我国南方地区高发的遗传性血液病，由于其严重的致残、致死后果对家庭及社会带来的沉重负担，在包括我国南方在内的东南亚地区、地中海地区、印度、中东、北非等该病的高发地区，地贫已经成为这些地区的公共卫生问题。因为缺少经济、有效的治疗手段，通过产前诊断避免重型地贫患儿的出生是目前国际上公认的首选预防措施。
地贫病因主要是由于珠蛋白基因发生缺陷导致相应的珠蛋白肽链合成减少或缺失，从而造成α和β珠蛋白肽链比例失衡而引起溶血性贫血。根据珠蛋白肽链合成受到抑制的类型，主要可以分为α-地中海贫血(α-地贫)和β-地中海贫血(β-地贫)2类。引发α-地中海贫血的突变主要是类α-珠蛋白基因簇的大片段缺失，此外，还有少量α-地中海贫血是由于α2或α1基因的点突变导致。目前己鉴定的α地贫缺失类型至少36种，东南亚缺失型(_SEA)、右侧缺失(α3.7)和左侧缺失(α4.2)是中国人最常见的3种缺失型。非缺失型α地贫点突变类型有30多种，在中国人群中最常见的Constant Spring(CS)、Quong Sze(QS)和Westmead(WS)，β-地中海贫血的分子基础是β-基因发生突变，使β-珠蛋白合成减少，多余的α-珠蛋白沉积在红细胞膜上，造成红细胞损坏，己知200种左右β珠蛋白基因的突变型，导致中国人群白地贫发生的突变基因有26种，β-32、β-29、βCap+1、βCap+41、βIntCD、βCD14-15、βCD19、β27/28、βIVS-I-1、βCD31、βCD41-42、βCD71–72、βIVS-II-5、β-30、β-28、βCap+8、βCap+40-43、βCD8-9、βCD17、βCD26、βCD30、βIVS-I-5、βCD37、βCD43、βCD95、βIVS-II-654等较为高发。
地中海贫血实验室诊断技术主要包括血液学筛查及基因检测两大类。前者简便经济，故常用于大规模普查以及基层卫生机构的筛查；后者虽然操作复杂且费用较贵，但却能够更加精准地诊断地中海贫血。基因检测方面，检测地中海贫血基因型的方法通常为Gap-PCR和PCR-RDB。Gap-PCR地贫诊断的原理是通过设计跨越断点式引物对样本进行扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，PCR-RDB法则需要完成扩增、杂交等过程方可完成分析。由于这两种方法检测条件和操作方法均不一致，须分开独立操作，而PCR-RDB操作繁琐，且扩增片段较短，容易产生PCR产物污染，前期所开发出的试剂盒的检测范围也有一定局限。
因此，亟需提供一种可实现单管多重PCR技术快速检测中国人群常见地贫突变基因的引物及方法。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种同时检测α和β地中海贫血基因突变的引物及方法，解决了现有技术检测的样本大多数为全血提取的基因组DNA或者其他样本类型来源的基因组DNA，未覆盖胚胎植入前的单细胞扩增产物，使用的引物对较多，且均需要设计探针进行检测，操作复杂，费用较高，分析结果较难判读等问题，本发明方法具有高度的灵敏性、稳定性、准确性和特异性。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种同时检测α和β地中海贫血基因突变的引物，所述引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.14所示的序列；所述α和β地中海贫血基因突变包括：缺失型α地中海贫血基因突变、突变型α地中海贫血基因突变和突变型β地中海贫血基因突变。
本发明检测方法覆盖的地贫突变类型更广更多，但所需要的引物对较少，适配样本类型较广，可适配抗凝静脉全血提取的基因组DNA或者胚胎植入前单细胞扩增产物。
SEQ ID NO.1：CCCCTCGCCAAGTCCACCC。
SEQ ID NO.2：CTGGCCAAACCATCACTTTTCATGAG。
SEQ ID NO.3：AAAGACCAGGAAGGGCCGGTG。
SEQ ID NO.4：CCCCTCGCCAAGTCCACCC。
SEQ ID NO.5：CTGGCCAAACCATCACTTTTCATGAG。
SEQ ID NO.6：TGCTGGAGTGGGACTTCTCTGACCTA。
SEQ ID NO.7：CCCAGTTTACCCATGTGGTGCCTC。
SEQ ID NO.8：CCCCGTTGGATCTTCTCATTTCCC。
SEQ ID NO.9：GGGGGCTTCGCAGGAACTCG。
SEQ ID NO.10：TTCACCCAGTACAGCGAGTCCTTCC。
SEQ ID NO.11：TCTTCTCTGCACAGCTCCTAAG。
SEQ ID NO.12：GGAGGAACGGCTACCGA。
SEQ ID NO.13：AACTCCTAAGCCAGTGCCAG。
SEQ ID NO.14：CCTAAGCCAGTGCCAGAAGAG。
SEQ ID NO.15：GGCAGAATCCAGATGCTCAA。
SEQ ID NO.16：GCAGAATCCAGATGCTCAAGG。
优选地，所述缺失型α地中海贫血基因突变包括-SEA、α3.7或α4.2中任意一种或至少两种的组合；
所述突变型α地中海贫血基因突变包括CS、QS或WS中任意一种或至少两种的组合；
所述突变型β地中海贫血基因突变包括β-32、β-29、βCap+1、βCap+41、βIntCD、βCD14-15、βCD19、β27/28、βIVS-I-1、βCD31、βCD41-42、βCD71–72、βIVS-II-5、β-30、β-28、βCap+8、βCap+40-43、βCD8-9、βCD17、βCD26、βCD30、βIVS-I-5、βCD37、βCD43、βCD95或βIVS-II-654中任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供了第一方面所述的同时检测α和β地中海贫血基因突变的引物在制备用于检测α和β地中海贫血基因突变的产品中的应用。
第三方面，本发明提供了一种同时检测α和β地中海贫血基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的同时检测α和β地中海贫血基因突变的引物。
第四方面，本发明提供了第一方面所述的同时检测α和β地中海贫血基因突变的引物在检测α和β地中海贫血基因突变中的应用。
第五方面，本发明提供了一种非疾病诊断和/或治疗为目的的检测α和β地中海贫血基因突变的方法，所述方法包括：
以待测样本的核酸为模板，利用第一方面所述的同时检测α和β地中海贫血基因突变的引物进行多重PCR扩增和测序，根据多重PCR扩增和测序结果进行判断。
优选地，所述待测样本包括全血基因组DNA和/或胚胎植入前单细胞扩增产物。
优选地，所述多重PCR扩增的体系中引物的终浓度为0.05-0.1μM。
上述0.05-0.1μM中的具体点值可以选择0.05μM、0.06μM、0.07μM、0.08μM、0.09μM、0.1μM等。
优选地，所述多重PCR扩增的扩增程序包括：
(1)93-95℃，2-5min预变性，(2)96-98℃，8-15sec变性；68-70℃，1-3min延伸；变性和延伸25-35个循环。
上述93-95℃中的具体点值可以选择93℃、94℃、95℃等。
上述1-3min中的具体点值可以选择1min、2min、3min等。
上述96-98℃中的具体点值可以选择96℃、97℃、98℃等。
上述8-15sec中的具体点值可以选择8sec、9sec、10sec、11sec、12sec、13sec、14sec、15sec等。
上述68-70℃中的具体点值可以选择68℃、69℃、70℃等。
上述25-35个循环中的具体点值可以选择25个循环、26个循环、27个循环、28个循环、29个循环、30个循环、32个循环、35个循环等。
优选地，所述测序的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.26所示的序列中的任意一种或至少两种的组合。
SEQ ID NO.17：AAAGACCAGGAAGGGCCGGTG。
SEQ ID NO.18：CCCCTCGCCAAGTCCACCC。
SEQ ID NO.19：GAGAAGAGGGTCAGTGGGGC。
SEQ ID NO.20：TTATTTGCTTTTGTGAGTGCTGT。
SEQ ID NO.21：GGGGGCTTCGCAGGAACTCG。
SEQ ID NO.22：TTCACCCAGTACAGCGAGTCCTTCC。
SEQ ID NO.23：TCTTCTCTGCACAGCTCCTAAG。
SEQ ID NO.24：GGAGGAACGGCTACCGA。
SEQ ID NO.25：CCTAAGCCAGTGCCAGAAGAG。
SEQ ID NO.26：AACTCCTAAGCCAGTGCCAG。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明使用较少的引物对可实现单管多重PCR技术快速检测中国人群常见地贫突变基因，各引物的退火温度在同一个温度范围内，避免了不同退火温度引起的非特异性扩增和效率高低不等的现象，另外各引物兼容性好，无二聚体产生，各引物可同时一管检测，也可根据实际情况将缺失与突变分成2个引物pool分开检测，方便临床应用；
(2)本发明的引物对适配样本类型较广，可适配抗凝静脉全血提取的基因组DNA或者胚胎植入前单细胞扩增产物；
(3)本发明检测方法覆盖的地贫突变类型更广更多，但所需要的引物对较少；
(4)本发明试剂盒对检测位点的检测具有高度的灵敏性、稳定性、准确性和特异性，其中的引物具有良好的特异性及实验的可重复性。
附图说明
图1为一代测序结果图；
图2为一代测序结果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
为了可以更容易地理解本发明，首先定义某些术语。如本发明中所使用的，除非另外定义，否则本发明使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。本发明提及的所有专利和出版物均以引用的方式整体并入本发明。
术语“Gap-PCR”，指的是跨越断裂点聚合酶链反应；
术语“PCR-RDB”，指的是PCR反向斑点杂交法；
术语“ASO”，指的是等位基因特异性寡核苷酸探针。
实施例1
本实施例进行引物筛选。
本实施例设计的引物组合如下所示。
组合1：如表1所示。
组合2：与表1引物相比区别仅在于表1中的SEQ ID NO.13替换为SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15替换为SEQ ID NO.16。
组合3：与表1引物相比区别仅在于表1中的SEQ ID NO.9替换为SEQ ID NO.27，SEQID NO.10替换为SEQ ID NO.28。
SEQ ID NO.27：GGACGGAGCGATCTGGGCTCTGTG。
SEQ ID NO.28：CCCTCCCATGTGAAGGGGTCTGTAGTGTC。
组合4：与表1引物相比区别仅在于表1中的SEQ ID NO.3替换为SEQ ID NO.29，SEQID NO.6替换为SEQ ID NO.30。
SEQ ID NO.29：AGACCAGGTAGGGCCGGAC。
SEQ ID NO.30：AAAGCACTCTTGGGTCCAGGC。
组合5：与表1引物相比区别仅在于表1中的SEQ ID NO.7替换为SEQ ID NO.31，SEQID NO.8替换为SEQ ID NO.32。
SEQ ID NO.31：GGTTTACCCATGTGGTGCCAG。
SEQ ID NO.32：CCCGTTGGATCTTCTCATTTCAG。
组合6：与表1引物相比区别仅在于表1中的SEQ ID NO.2替换为SEQ ID NO.33，SEQID NO.6替换为SEQ ID NO.34。
SEQ ID NO.33：AAGTCCACCCCTTCCTTCCTCACC。
SEQ ID NO.34：TGACCTACCCACCACCCATA。
表1各引物组合扩增结果
| 引物组合 | 测序结果 |
| 组合1 | 无引物二聚体 |
| 组合2 | 无引物二聚体 |
| 组合3 | 单细胞扩增产物SEA缺失无结果 |
| 组合4 | 存在引物二聚体 |
| 组合5 | 存在引物二聚体 |
| 组合6 | 存在引物二聚体 |
实施例2
用于扩增待检样品中DNA的特异性引物的设计及PCR反应体系确定。
(1)引物设计
所有样本均来源自经常规Gap-PCR技术或测序技术确定基因型的DNA样本。设计表2所示的6对引物用于PCR扩增，6对引物组合置于同一个反应管中进行多重PCR，同时扩增α-地贫和β地贫基因。
表2
(2)多重PCR反应体系的确定
通过大量的实验对比，控制PCR buffer的浓度、引物浓度和KOD酶的浓度可以做到α-地贫基因和β-地贫基因同时高效率扩增，特异性好。最终确定最优的PCR反应体系见表3，PCR反应液19.5，DNA加样量5.5μL，总反应体积为25μL。引物终浓度见表4。
表3
表4
| 序列编号 | 引物终浓度(μM) |
| SEQ ID NO.1 | 0.05 |
| SEQ ID NO.3 | 0.1 |
| SEQ ID NO.2 | 0.05 |
| SEQ ID NO.6 | 0.05 |
| SEQ ID NO.7 | 0.05 |
| SEQ ID NO.8 | 0.05 |
| SEQ ID NO.9 | 0.05 |
| SEQ ID NO.10 | 0.05 |
| SEQ ID NO.11 | 0.05 |
| SEQ ID NO.12 | 0.05 |
| SEQ ID NO.13 | 0.05 |
| SEQ ID NO.15 | 0.05 |
(3)多重PCR扩增程序的确定
经过大量实验对比优化，控制退火温度和退火时间可以做到特异性好，扩增效率高，最终确定的最佳扩增程序见表5。
表5
PCR产物纯化后，使用测序引物进行测序。测序用Big DyeTMTerminator v3.0Reaction Cycle sequencing Kit在DNA全自动测序仪(3500，美国ABI)上进行。用FinchTV软件打开测序结果文件，进行序列分析，综合检测结果判读基因型。
测序引物如表6所示。
表6
| 序列编号 | 序列名称 | 序列(5’-3’) |
| SEQ ID NO.17 | α2-SF | AAAGACCAGGAAGGGCCGGTG |
| SEQ ID NO.18 | α2-SR | CCCCTCGCCAAGTCCACCC |
| SEQ ID NO.19 | 3.7-SF | GAGAAGAGGGTCAGTGGGGC |
| SEQ ID NO.20 | 4.2-SF | TTATTTGCTTTTGTGAGTGCTGT |
| SEQ ID NO.21 | SEA-SF | GGGGGCTTCGCAGGAACTCG |
| SEQ ID NO.22 | SEA-SR | TTCACCCAGTACAGCGAGTCCTTCC |
| SEQ ID NO.23 | α-SF | TCTTCTCTGCACAGCTCCTAAG |
| SEQ ID NO.24 | α-SR | GGAGGAACGGCTACCGA |
| SEQ ID NO.25 | β-SF | CCTAAGCCAGTGCCAGAAGAG |
| SEQ ID NO.26 | β-SR | AACTCCTAAGCCAGTGCCAG |
检测结果如图1和图2所示。由结果可见，本发明所述试剂盒可区分各种常见基因型；且检测的所有样本的基因型与其经常规Gap-PCR技术和PCR-RDB技术确定的基因型相同，说明本发明所述试剂盒在对已知基因型样本的检测时具有很好的准确性。
实施例3
本实施例与实施例2的区别仅在于引物浓度均为0.02μL。
结果：基因型为αα/αα,βIVS-II-654/βN；αα/αα,βCD26/βN；αα/αα,βCD37/βN；αα/αα,β-28/βN；αα/αα,βCD41-42/βN；αα/αα,βCD17/βN；αα/αα,βIVS-I-1/βN；αα/αα,βCD71-72/βN；--SEA/αα,βN/βN；-α4.2/αα,βN/βN样本均可出现正确的测序结果。
实施例4
本实施例与实施例2的区别仅在于引物浓度均为0.1μL。
结果：基因型为αα/αα,βIVS-II-654/βN；αα/αα,βCD26/βN；αα/αα,βCD37/βN；αα/αα,β-28/βN；αα/αα,βCD41-42/βN；αα/αα,βCD17/βN；αα/αα,βIVS-I-1/βN；αα/αα,βCD71-72/βN；--SEA/αα,βN/βN；-α4.2/αα,βN/βN样本均可出现正确的测序结果。
实施例5
本实施例与实施例2的区别仅在于扩增程序为延伸温度为65℃,2min。
结果：基因型为αα/αα,βIVS-II-654/βN；αα/αα,βCD26/βN；αα/αα,βCD37/βN；αα/αα,β-28/βN；αα/αα,βCD41-42/βN；αα/αα,βCD17/βN；αα/αα,βIVS-I-1/βN；αα/αα,βCD71-72/βN；--SEA/αα,βN/βN；-α4.2/αα,βN/βN样本均出现引物二聚体。
实施例6
本实施例与实施例2的区别仅在于扩增程序为延伸温度70℃，2min。
结果和实施例2结果一致。
综上所述，本发明检测方法覆盖的地贫突变类型更广更多，但所需要的引物对较少，适配样本类型较广，可适配抗凝静脉全血提取的基因组DNA或者胚胎植入前单细胞扩增产物。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种同时检测α和β地中海贫血基因突变的引物，其特征在于，所述引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.16所示的序列；所述α和β地中海贫血基因突变包括：缺失型α地中海贫血基因突变、突变型α地中海贫血基因突变和突变型β地中海贫血基因突变。
2.根据权利要求1所述的同时检测α和β地中海贫血基因突变的引物其特征在于，所述缺失型α地中海贫血基因突变包括-SEA、α3.7或α4.2中任意一种或至少两种的组合；
所述突变型α地中海贫血基因突变包括CS、QS或WS中任意一种或至少两种的组合；
所述突变型β地中海贫血基因突变包括β-32、β-29、βCap+1、βCap+41、βIntCD、βCD14-15、βCD19、β27/28、βIVS-I-1、βCD31、βCD41-42、βCD71–72、βIVS-II-5、β-30、β-28、βCap+8、βCap+40-43、βCD8-9、βCD17、βCD26、βCD30、βIVS-I-5、βCD37、βCD43、βCD95或βIVS-II-654中任意一种或至少两种的组合。
3.权利要求1或2所述的同时检测α和β地中海贫血基因突变的引物在制备用于检测α和β地中海贫血基因突变的产品中的应用。
4.一种同时检测α和β地中海贫血基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的同时检测α和β地中海贫血基因突变的引物。
5.权利要求1或2所述的同时检测α和β地中海贫血基因突变的引物在检测α和β地中海贫血基因突变中的应用。
6.一种非疾病诊断和/或治疗为目的的检测α和β地中海贫血基因突变的方法，其特征在于，所述方法包括：
以待测样本的核酸为模板，利用权利要求1或2所述的同时检测α和β地中海贫血基因突变的引物进行多重PCR扩增和测序，根据多重PCR扩增和测序结果进行判断。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括全血基因组DNA和/或胚胎植入前单细胞扩增产物。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述多重PCR扩增的体系中引物的终浓度为0.05-0.1μM。
9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，所述多重PCR扩增的扩增程序包括：
(1)93-95℃，2-5min预变性，(2)96-98℃，8-15sec变性；68-70℃，1-3min延伸；变性和延伸25-35个循环。
10.根据权利要求6-9任一项所述的方法，其特征在于，所述测序的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.26所示的序列中的任意一种或至少两种的组合。
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