CN115558692B - 一种制备富含鹅肌肽和谷胱甘肽的金枪鱼肽的方法 - Google Patents

一种制备富含鹅肌肽和谷胱甘肽的金枪鱼肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备富含鹅肌肽和谷胱甘肽的金枪鱼肽的方法，属于活性肽制备技术领域。该方法包括以下步骤：在60～70℃条件下进行两次水提天然活性肽、用中性蛋白酶酶解肉渣并添加风味蛋白酶、灭活、离心、合并料液、两次板框压滤料液、经1级活性炭纤维膜在35℃条件下进行脱腥脱色、负压浓缩、瞬时喷雾干燥。本发明的有益之处在于：发酵时间短，适合工业化生产，制备得到的金枪鱼肽富含鹅肌肽和谷胱甘肽。

Description

一种制备富含鹅肌肽和谷胱甘肽的金枪鱼肽的方法
技术领域
本发明涉及一种制备金枪鱼肽的方法，具体涉及一种制备富含鹅肌肽和谷胱甘肽的金枪鱼肽的方法，属于活性肽制备技术领域。
背景技术
金枪鱼是一种大型远洋性重要商品食用鱼，含有丰富的营养成分，尤其是优质蛋白和营养素，作为一种营养、健康的现代食品备受推崇，被欧美等发达国家所青睐，其健康功效包括：
1、低脂肪、低热量，有益于保持身材和减肥；
2、含有DHA，可以提高记忆力、增强脑细胞活力，提高视力，预防近视的形成等；
3、含有生物活性成分，可以缓解压力，起到护肝、养肝、降血压、降血脂、降胆固醇的作用，预防心脑血管疾病；
4、含有丰富的氨基酸和多种微量元素，可以促进人体的新陈代谢，促进蛋白质、铁等营养素的吸收，补铁，预防贫血。
随着人们对海洋生物的探索，金枪鱼除了被作为美食之外，还被发现可以从其肉质中提取活性肽。
金枪鱼肽是从金枪鱼肉中提取、精制而成的金枪鱼来源肽。金枪鱼肽中含有的活性物质主要是鹅肌肽。鹅肌肽存在于金枪鱼的肌肉中，是2种氨基酸（β-丙氨酸、甲基组氨酸）结合而成的肽（β-丙氨酰-1-甲基 L-组氨酸，Anserine），是一种高度稳定的水溶性二肽，在低pH值（<3.0）下可保持完整。
金枪鱼一生能够持续不断游泳的原因之一是其肌肉中含有较多的鹅肌肽。金枪鱼在高强度持续运动时，肌肉以糖酵解为主要供能方式，会产生大量乳酸，由于鹅肌肽含咪唑基，所以在生理pH7左右具有明显的缓冲作用，可缓解疲劳。另外，金枪鱼在高强度的持续运动时，还会产生大量的自由基，机体产生氧化应激，进而导致肌细胞损失、肌张力下降，产生疲劳。鹅肌肽分子构象呈弯曲的“钳子”状，可将自由基包埋于其分子腔中形成稳定的复合物，从而清除自由基，进而抗疲劳。
目前，金枪鱼肽的提取方法主要是：酶解结合离心和醇沉，得到肽的粗提取物。然而，该方法得到的金枪鱼肽纯度不理想，往往伴随腥味，增加了后续处理难度，影响市场价值。
为了解决上述方法存在的问题，中国专利申请CN111418700A提供了一种优化的金枪鱼肽提取方法，具体的：向金枪鱼中加入复合蛋白酶（例如：木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、其他菌株发酵所得到的中性或酸性蛋白酶）及产蛋白酶的微生物（例如：热带假丝酵母菌），同时进行发酵和酶解（能够有效消除异味，显著降低金枪鱼肽分子量，降低后续纯化难度），得到吸收液，吸收液经树脂纯化制备得到金枪鱼肽。采用该方法提取得到的金枪鱼肽属于小分子肽，纯度较高、没有异味，后续加工难度低，是一种高经济价值产品。然而，该方法由于对金枪鱼匀浆液直接进行发酵和酶解（30℃条件下发酵酶解72h），发酵和酶解过程时间较长，一方面使得生产周期变长，时间成本和人力成本增加，不适合工业化生产，另一方面使得肌肉中更多的还原型谷胱甘肽（在溶液中不太稳定）被氧化，从而造成还原型谷胱甘肽损失。此外，该方法由于向金枪鱼匀浆液中接种了产蛋白酶的微生物——热带假丝酵母菌，虽然可以有效消除金枪鱼肽的苦腥味，但该热带假丝酵母菌发酵产生的蛋白外切酶会损坏鹅肌肽和谷胱甘肽的结构，使得鹅肌肽和谷胱甘肽的活性下降。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供一种发酵时间短、适合工业化生产且可制备出富含鹅肌肽和谷胱甘肽的金枪鱼肽的方法。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种制备富含鹅肌肽和谷胱甘肽的金枪鱼肽的方法，包括以下步骤：
Step1：将金枪鱼用高压匀浆机搅碎均质，将匀浆液倒入酶解罐中并与蒸馏水混合，于60～70℃搅拌30min后自然沉降，得到上清料液1；将酶解罐中的肉渣与蒸馏水混合，于60～70℃搅拌20min后自然沉降，得到上清料液2；将上清料液1和上清料液2混合得到料液3；
Step2：向装有肉渣的酶解罐中加入蒸馏水，升温至50～60℃，加入中性蛋白酶搅拌酶解3h，最后加入风味蛋白酶，得到料液4；
Step3：将料液4加热灭活，得到料液5；
Step4：将料液5离心，得到料液6；
Step5：将料液3和料液6混合，得到料液7；
Step6：将料液7泵入到装有助滤剂的板框压滤机内，压滤料液7，得到料液8；
Step7：将料液8泵入到装有助滤剂的板框压滤机内，压滤料液8，得到料液9；
Step8：将料液9经微孔孔径为1nm的活性炭纤维膜进行脱腥脱色处理，得到料液10；
Step9：将料液10泵入到单效蒸发器内于50℃、负压0.1MPa条件下进行负压浓缩，得到料液11；
Step10：将料液11快速升温到90℃，然后泵入到干燥塔中进行瞬时喷雾干燥，得到金枪鱼肽粉。
优选的，在Step2中，中性蛋白酶的添加量为肉渣质量的1～3‰，风味蛋白酶的添加量为肉渣质量的0.5～1‰。
优选的，在Step3中，灭活温度为85～90℃，保持时间8～10min。
优选的，在Step4中，选用卧式螺旋沉降离心机进行离心，转速调至4800r/min，生产能力调至0.8m3/h。
优选的，在Step6中，所述助滤剂选用ZX616#硅藻土。
优选的，在Step7中，所述助滤剂选用SX821#硅藻土。
优选的，在Step8中，对料液9进行脱腥脱色处理的方法具体为：将料液9的温度升高至35℃，然后泵入到不锈钢骨架的活性炭纤维膜脱色装置中，经活性炭纤维膜对料液9进行脱腥脱色处理，脱色效率为2.5m3/h，得到料液10。
优选的，在Step9中，进行负压浓缩时，每20min排放蒸发冷凝水，去除料液10 90%以上的水分。
优选的，在Step10中，于140～155℃条件下进行瞬时喷雾干燥。
本发明的有益之处在于：
（1）通过对金枪鱼原料进行两次水提，实现了天然活性肽的最大化提取；
（2）通过使用1级活性炭纤维膜，既实现了有针对性的脱腥脱色，又最大限度地减少了鹅肌肽和谷胱甘肽的损失；
（3）制备得到的金枪鱼肽粉呈白色，颗粒细腻且均匀，粒径在100～150目范围内，无腥味和苦味，鹅肌肽含量达10.27%，还原型谷胱甘肽含量达6.51%。
附图说明
图1是鹅肌肽标品的高效液相色谱图；
图2是还原型谷胱甘肽标品的高效液相色谱图；
图3是实施例1制备得到的金枪鱼肽粉的高效液相色谱图；
图4是实施例2制备得到的金枪鱼肽粉的高效液相色谱图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
实施例1
Step1：水提天然活性肽
用清水清洗金枪鱼，去除内脏及泥沙，用高压匀浆机搅碎均质，得到匀浆液。
将匀浆液倒入装有蒸馏水的酶解罐中，匀浆液与蒸馏水的质量比为1：1，将酶解罐内的水温度升至60℃，不停地搅拌30min，自然沉降，将上清料液1泵入到储存罐内，备用。
继续向装有肉渣的酶解罐中加入同上面相同量的蒸馏水，将酶解罐内的水温度升至60℃，不停地搅拌20min，自然沉降，将上清料液2泵入到装有上清料液1的储存罐内，上清料液2与上清料液1混合得到料液3，备用。
鹅肌肽和谷胱甘肽都是以游离的形式存在于肌肉组织中，都具有良好的水溶性。其中，鹅肌肽具有高热稳定性，可承受120℃高温20min，因此对水提温度不敏感；谷胱甘肽以还原型和氧化型两种形式存在，肌肉组织中约99%的谷胱甘肽是以还原型的形式存在，还原型谷胱甘肽具有活性官能团巯基（-SH），易被氧化脱氢，通过巯基氧化态-还原态的转化可作为可逆的供氢体，从而清除体内自由基，还原型谷胱甘肽在溶液中不太稳定，沸水煮1h就会有一部分转化为氧化型谷胱甘肽，因此水提温度不宜过高、水提时间不宜过长。经试验，水提温度控制在60～70℃、水提时间控制在10～30min比较合适。
蛋白质的酶解过程一般时间较长并且灭酶所需的温度较高，还原型谷胱甘肽在溶液中不太稳定，易氧化，难免造成损失。另外，酶解过程中蛋白质中的一些疏水性氨基酸暴露出来，给产品带来苦腥味等不良风味，因此在工业化生产肽产品时，会添加风味蛋白酶等外切酶将蛋白质末端疏水性氨基酸切除进行脱苦、脱腥，外切酶的使用会对鹅肌肽和谷胱甘肽带来很大损失。本发明在对金枪鱼匀浆液进行酶解之前，先对金枪鱼匀浆液进行了两次水提，这样可以最大化地将金枪鱼肌肉组织中的天然活性肽提取出来，减少最终产品中鹅肌肽和谷胱甘肽的损失，提高最终产品中鹅肌肽和谷胱甘肽的含量。
Step2：酶解
向装有肉渣的酶解罐中加入肉渣3倍体积量的蒸馏水，自然pH值，将水温升至50℃，然后加入肉渣质量1‰的中性蛋白酶，搅拌酶解3h，最后加入肉渣质量0.5‰的风味蛋白酶，得到料液4。
Step3：灭活
将料液4加热至85℃，保持8min，得到料液5。
Step4：离心
将料液5泵入到LW-220型卧式螺旋沉降离心机内，调节转速至4800r/min，调节生产能力至0.8m3/h，离心料液5，得到料液6。
Step5：混合料液
将料液3和料液6混合，得到料液7。
Step6：一次板框压滤
将料液7泵入到装有ZX616#硅藻土（助滤剂）的板框压滤机内，压滤料液7，得到料液8。
ZX616#硅藻土具有中粗的微孔结构，不仅能使金枪鱼肽料液获得较好的流速比，而且还能滤除金枪鱼肽料液中微细的悬浮物。
Step7：二次板框压滤
将料液8泵入到装有SX821#硅藻土（助滤剂）的板框压滤机内，压滤料液8，得到料液9。
SX821#硅藻土具有较细的微孔结构，其可以使压滤后的金枪鱼肽料液澄清透明。
Step8：活性炭纤维膜脱腥脱色
将料液9的温度升高至35℃，然后泵入到不锈钢骨架的活性炭纤维膜脱色装置中，活性炭纤维膜的微孔孔径为1nm，经活性炭纤维膜（对料液9进行脱腥脱色处理，脱色效率为2.5m3/h，得到料液10，用蒸汽对活性炭纤维膜进行解吸附再生。
随着鱼体新鲜度的降低，鱼体内的氧化三甲胺在微生物及酶的作用下被降解，产生三甲胺和二甲胺，这两种物质使得鱼的腥味增强。相对于淡水鱼而言，海水鱼中的氧化三甲胺的含量明显高，因此海水鱼的腥味更加强烈。
血红素是铁卟啉化合物，是血红蛋白和肌红蛋白的辅基，金枪鱼鱼肉显红色，主要原因是其血红素含量高。
三甲胺的分子量为59u，二甲胺的分子量为45u；活性炭纤维无大孔，活性炭纤维丝束的空间起大孔作用，对气相小分子物质具有很好的吸附作用，吸附速度快且吸附量高；料液9中的三甲胺、二甲胺等小分子不良风味成分，直接被吸附于活性炭纤维丝束中。活性炭纤维的微孔孔径与吸附质的粒径相匹配，两者的分子才会有效吸引，形成范德华力，具有吸附效果。粉末活性碳的孔径分布是宽正态曲线型，广谱吸附，几乎没有选择性；而活性碳纤维的孔径分布是分段的窄正态曲线型，窄谱吸附，选择性强。血红素的分子量为652u，鹅肌肽的分子量为240u，谷胱甘肽的分子量为307u；选用微孔孔径为1nm的活性炭纤维膜，主要吸附血红素等500-1000u的物质，既能实现有针对性的对料液9进行脱腥脱色，又能最大限度地减少料液10中鹅肌肽和谷胱甘肽的损失。
另外，脱腥脱色温度以35℃左右为最佳。如果脱腥脱色温度过高，会导致分子热运动加剧，造成吸附剂与吸附质之间形成的范德华力被挣开，达不到脱腥脱色效果。
金枪鱼肽料液脱腥脱色前（料液9）呈红褐色，腥味较重，经微孔孔径为1nm的活性炭纤维膜脱腥脱色后（料液10），料液澄清透明，呈金黄色，腥味全无。
Step9：负压浓缩
将料液10泵入到单效蒸发器内，于50℃、负压0.1MPa条件下进行负压浓缩，每20min排放蒸发冷凝水，去除料液10 90%以上的水分，得到料液11。
Step10：瞬时喷雾干燥
将料液11快速升温到90℃，然后泵入到干燥塔中，于140℃条件下进行瞬时喷雾干燥形成干粉，得到金枪鱼肽粉。产品得率18.67%。
本实施例制备得到的金枪鱼肽粉呈白色，颗粒细腻且均匀，粒径在100～150目范围内，无腥味和苦味。
经检测，本实施例制备得到的金枪鱼肽粉的水分含量为1.1%。还原型谷胱甘肽在高水分条件下并不容易保存，所以要尽可能降低金枪鱼肽粉的水分含量，使还原型谷胱甘肽能稳定保存。
将本实施例制备得到的金枪鱼肽粉用蒸馏水溶解，制成质量浓度为1%的金枪鱼肽溶液，该金枪鱼肽溶液澄清透明，呈淡淡的黄色，无腥味和苦味。
经检测，鹅肌肽标品的高效液相色谱图见图1，还原型谷胱甘肽标品的高效液相色谱图见图2，本实施例制备得到的金枪鱼肽粉的高效液相色谱图见图3。由图1、图2和图3可知，高效液相色谱法可以将实施例制备得到的金枪鱼肽粉中的鹅肌肽和还原型谷胱甘肽分离出来，且分离出来的鹅肌肽和还原型谷胱甘肽与标品的出峰时间基本一致。
经计算，本实施例制备得到的金枪鱼肽粉中的鹅肌肽的含量为10.27%（经高效液相色谱检测得到的鹅肌肽标品的回归直线方程为：Y=39.07749X-241.50544，R2=0.9989095），还原型谷胱甘肽的含量为6.51%（经高效液相色谱检测得到的还原型谷胱甘肽标品的回归直线方程为：Y=15.4073X-113.156754，R2=0.9994143）。
可见，本实施例制备得到的金枪鱼肽粉富含鹅肌肽和还原型谷胱甘肽。
实施例2
Step1：水提天然活性肽
用清水清洗金枪鱼，去除内脏及泥沙，用高压匀浆机搅碎均质，得到匀浆液。
将匀浆液倒入装有蒸馏水的酶解罐中，匀浆液与蒸馏水的质量比为1：2，将酶解罐内的水温度升至70℃，不停地搅拌30min，自然沉降，将上清料液1泵入到储存罐内，备用。
继续向装有肉渣的酶解罐中加入同上面相同量的蒸馏水，将酶解罐内的水温度升至70℃，不停地搅拌20min，自然沉降，将上清料液2泵入到装有料液1的储存罐内，得到料液3，备用。
Step2：酶解
向装有肉渣的酶解罐中加入肉渣3倍体积量的蒸馏水，自然pH值，将水温升至60℃，然后加入肉渣质量3‰的中性蛋白酶，搅拌酶解4h，最后加入肉渣质量1‰的风味蛋白酶，得到料液4。
Step3：灭活
将料液4加热至90℃，保持10min，得到料液5。
Step4：离心
将料液5泵入到LW-220型卧式螺旋沉降离心机内，调节转速至4800r/min，调节生产能力至0.8m3/h，离心料液5，得到料液6。
Step5：混合料液
将料液3和料液6混合，得到料液7。
Step6：一次板框压滤
将料液7泵入到装有ZX616#硅藻土的板框压滤机内，压滤料液7，得到料液8。
Step7：二次板框压滤
将料液8泵入到装有SX821#硅藻土的板框压滤机内，压滤料液8，得到料液9。
Step8：活性炭纤维膜脱腥脱色
将料液9的温度升高至35℃，然后泵入到不锈钢骨架的活性炭纤维膜脱色装置中，活性炭纤维膜的微孔孔径为1nm，经活性炭纤维膜对料液9进行脱腥脱色处理，脱色效率为2.5m3/h，得到料液10，用蒸汽对活性炭纤维膜进行解吸附再生。
Step9：负压浓缩
将料液10泵入到单效蒸发器内，于50℃、负压0.1MPa条件下进行负压浓缩，每20min排放蒸发冷凝水，去除料液10 90%以上的水分，得到料液11。
Step10：瞬时喷雾干燥
将料液11快速升温到90℃，然后泵入到干燥塔中，于155℃条件下进行瞬时喷雾干燥形成干粉，得到金枪鱼肽粉。产品得率18.14%。
本实施例制备得到的金枪鱼肽粉也呈白色，颗粒细腻且均匀，粒径在100～150目范围内，无腥味和苦味。
经检测，本实施例制备得到的金枪鱼肽粉的水分含量为1.1%。
将本实施例制备得到的金枪鱼肽粉用蒸馏水溶解，制成质量浓度为1%的金枪鱼肽溶液，该金枪鱼肽溶液澄清透明，呈淡淡的黄色，无腥味和苦味。
本实施例制备得到的金枪鱼肽粉的高效液相色谱图见图4。经计算，本实施例制备得到的金枪鱼肽粉中的鹅肌肽的含量为10.14%（经高效液相色谱检测得到的鹅肌肽标品的回归直线方程为：Y=39.07749X-241.50544，R2=0.9989095），还原型谷胱甘肽的含量为6.43%（经高效液相色谱检测得到的还原型谷胱甘肽标品的回归直线方程为：Y=15.4073X-113.156754，R2=0.9994143）。
可见，本实施例制备得到的金枪鱼肽粉富含鹅肌肽和还原型谷胱甘肽。
需要说明的是，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种制备富含鹅肌肽和谷胱甘肽的金枪鱼肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1：将金枪鱼用高压匀浆机搅碎均质，将匀浆液倒入酶解罐中并与蒸馏水混合，于60～70℃搅拌30min后自然沉降，得到上清料液1；将酶解罐中的肉渣与蒸馏水混合，于60～70℃搅拌20min后自然沉降，得到上清料液2；将上清料液1和上清料液2混合得到料液3；
Step2：向装有肉渣的酶解罐中加入蒸馏水，升温至50～60℃，加入中性蛋白酶搅拌酶解3h，最后加入风味蛋白酶，得到料液4，其中，中性蛋白酶的添加量为肉渣质量的1～3‰，风味蛋白酶的添加量为肉渣质量的0.5～1‰；
Step3：将料液4加热灭活，得到料液5；
Step4：将料液5离心，得到料液6；
Step5：将料液3和料液6混合，得到料液7；
Step6：将料液7倒入到装有助滤剂的板框压滤机内，压滤料液7，得到料液8；
Step7：将料液8倒入到装有助滤剂的板框压滤机内，压滤料液8，得到料液9；
Step8：将料液9经微孔孔径为1nm的活性炭纤维膜进行脱腥脱色处理，得到料液10；
Step9：将料液10泵入到单效蒸发器内于50℃、负压0.1MPa条件下进行负压浓缩，得到料液11；
Step10：将料液11快速升温到90℃，然后泵入到干燥塔中进行瞬时喷雾干燥，得到金枪鱼肽粉。
2.根据权利要求1所述的制备富含鹅肌肽和谷胱甘肽的金枪鱼肽的方法，其特征在于，在Step3中，灭活温度为85～90℃，保持时间8～10min。
3.根据权利要求1所述的制备富含鹅肌肽和谷胱甘肽的金枪鱼肽的方法，其特征在于，在Step4中，选用卧式螺旋沉降离心机进行离心，转速调至4800r/min，生产能力调至0.8m3/h。
4.根据权利要求1所述的制备富含鹅肌肽和谷胱甘肽的金枪鱼肽的方法，其特征在于，在Step6中，所述助滤剂选用ZX616#硅藻土。
5.根据权利要求1所述的制备富含鹅肌肽和谷胱甘肽的金枪鱼肽的方法，其特征在于，在Step7中，所述助滤剂选用SX821#硅藻土。
6.根据权利要求1所述的制备富含鹅肌肽和谷胱甘肽的金枪鱼肽的方法，其特征在于，在Step8中，对料液9进行脱腥脱色处理的方法具体为：将料液9的温度升高至35℃，然后泵入到不锈钢骨架的活性炭纤维膜脱色装置中，经活性炭纤维膜对料液9进行脱腥脱色处理，脱色效率为2.5m3/h，得到料液10。
7.根据权利要求1所述的制备富含鹅肌肽和谷胱甘肽的金枪鱼肽的方法，其特征在于，在Step9中，进行负压浓缩时，每20min排放蒸发冷凝水，去除料液10 90%以上的水分。
8.根据权利要求1所述的制备富含鹅肌肽和谷胱甘肽的金枪鱼肽的方法，其特征在于，在Step10中，于140～155℃条件下进行瞬时喷雾干燥。
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