CN115530126A - Bombella Apis在促进蜜蜂幼虫生长发育中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了Bombella Apis在促进蜜蜂幼虫生长发育中的应用。本发明首次发现B.apis可促进四环素处理后中华蜜蜂幼虫的生长发育。在低浓度四环素处理后添加B.apis，能使幼虫化蛹率、羽化率和存活率提升10‑20％，基本能够达到CK组的发育水平。而在高浓度四环素处理后添加B.apis，则是能使化蛹率0％提升到约20％，羽化率能达到50％左右。以上结果表明，B.apis能够提升四环素处理后的中华蜜蜂幼虫化蛹率、羽化率和存活率，B.apis可用于制备提高蜜蜂幼虫化蛹率、出房率和存活率的微生态制剂、饲料添加剂或饲料，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及Bombella Apis在促进蜜蜂幼虫生长发育中的应用。
背景技术
蜜蜂体内的微生物都与蜜蜂的生理活动密切相关，其中肠道微生物对其影响更为密切。蜜蜂肠道菌的功能丰富，一些微生物具有代谢难以降解的糖、花粉和碳水化合物的能力促进这些物质的消化吸收，增加宿主能量摄入，甚至提高蜜蜂对病毒虫害的抵抗能力。蜜蜂肠道微生物群系中有某类独特的细菌来帮助宿主消化食物，也会有各种细菌共同完成某项功能。因为肠道菌群的作用十分强大，所以便有许多研究在蜜蜂食物中添加肠道菌后再饲喂蜜蜂，探讨肠道菌的具体作用。在蜜蜂的生活环境喷洒含有Lactobacillu和Bifidobacterium的糖浆制剂，能增加蜜蜂肠道中Acetobacteraceae和Bifidobacteriumspp.的丰度，提高了蜜蜂的营养和保护能力。从蜜蜂肠道中分离得到的Lactobacilluskunkeei混合物能够增加肠道内乳酸杆菌的数量，提高幼虫的生存能力，并且降低感染美腐病Paenibacillus larvae的死亡率。即便是植物中的乳酸杆菌Lactobacillu plantarum也能减轻微孢子虫引起的蜜蜂肠道微生物群落的变化。
蜜蜂肠道中Alpha菌群主要有3类，分别是Alpha-1、Alpha-2.1和Alpha-2.2，分别对应Bartonella、Commensalibacter和Bombella属，它们一共占据肠道微生物总量的20％左右。B.apis(Bombella Apis)首次由Yun等人于2017年在韩国意大利蜂的中肠中分离鉴定命名(Ji-Hyun,Yun,Young J,et al.2017,67(7))。B.apis属于蜜蜂肠道九大菌群中的Alpha-2.2(Acetobacteraceae)醋杆菌科，革兰氏阴性，专性需氧菌。Alpha-2.2菌群一般只大量存在幼虫肠道、蜂王肠道、哺育蜂蜂粮和蜂王浆中，因此幼虫的获得很有可能来源于哺育蜂的饲喂。
四环素是一种广谱抗生素，其作用的机制是特异性地与细菌核糖体30S亚基的A位置结合，阻止氨基酰－tRNA在该位上的联结，从而抑制肽链的增长和影响细菌蛋白质的合成，适用于大多数革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及厌氧菌。四环素常用于治疗蜜蜂美洲幼虫腐烂病(American Foulbrood)，该病病原是P.larvae。蜜蜂摄入抗生素后将会减少肠道微生物的多样性，并且难以恢复到原来水平。此外，有研究发现P.larvae已产生抗性基因，如不加以节制，未来抗生素浓度和用量或许还会加重，蜜蜂的健康水平必定会持续下降。
目前，没有关于Bombella Apis在促进四环素处理后蜜蜂幼虫生长发育中的应用的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供菌株Bombella Apis的新用途，具体是提供Bombella Apis在促进蜜蜂幼虫生长发育中的应用。
本发明的第一个目的是提供Bombella Apis在促进蜜蜂幼虫生长发育中的应用。
优选的，是提供Bombella Apis在促进四环素处理后蜜蜂幼虫生长发育中的应用。
优选的，所述的蜜蜂为中华蜜蜂。
本发明的第二个目的是提供Bombella Apis在制备提高蜜蜂幼虫化蛹率、出房率和存活率的微生态制剂中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种提高蜜蜂幼虫化蛹率、出房率和存活率的微生态制剂，其含有Bombella Apis。
本发明的第四个目的是提供Bombella Apis或包含Bombella Apis的微生态制剂在制备提高蜜蜂幼虫化蛹率、出房率和存活率的饲料或饲料添加剂中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种提高蜜蜂幼虫化蛹率、出房率和存活率的饲料或饲料添加剂，其含有Bombella Apis。
本发明公开了菌株Bombella Apis的新用途，该菌株Bombella Apis可促进四环素处理后中华蜜蜂幼虫的生长发育。本发明实验证明：在低浓度(100μg/mL)四环素处理后添加该Bombella Apis(105CFU/mL)，能使幼虫化蛹率、羽化率和存活率提升10-20％，基本能够达到CK组的发育水平。而在高浓度(200μg/mL)四环素处理后添加该Bombella Apis(105CFU/mL)，则是能使化蛹率0％提升到约20％，羽化率能达到50％左右。以上结果表明，Bombella Apis能够提升四环素处理后的中华蜜蜂幼虫化蛹率、羽化率和存活率，BombellaApis可用于制备提高蜜蜂幼虫化蛹率、出房率和存活率的微生态制剂、饲料添加剂或饲料，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是低浓度四环素处理后回接B.apis的中华蜜蜂幼虫化蛹率(Pupation)、出房率(Emergence)和存活率(Survival)，每组柱子从左到右分别是G-Ⅰ处理为：喂食无菌蜂粮的幼虫；G-Ⅱ处理为：喂食含有四环素100μg/mL无菌蜂粮的幼虫；G-Ⅲ处理为：48h内喂食含有四环素100μg/mL无菌蜂粮，48h后喂食含有B.apis(105CFU/mL)蜂粮的幼虫。
图2是蛹肠道微生物在不同平板的生长情况。A：MRS平板；B：LB平板；C：TSA平板。
图3是不同处理的新出房蜜蜂体重图，G-Ⅰ处理为：喂食无菌蜂粮的幼虫；G-Ⅱ处理为：喂食含有四环素100μg/mL无菌蜂粮的幼虫；G-Ⅲ处理为：48h内喂食含有四环素100μg/mL无菌蜂粮，48h后喂食含有B.apis(105CFU/mL)蜂粮的幼虫。
图4是高浓度四环素处理后回接B.apis的中华蜜蜂幼虫化蛹率(Pupation)、出房率(Emergence)和存活率(Survival)，每组柱子从左到右分别是G-Ⅰ处理为：喂食无菌蜂粮的幼虫；G-Ⅳ处理为：喂食含有四环素200μg/mL无菌蜂粮的幼虫；G-Ⅴ处理为：48h内喂食含有四环素200μg/mL无菌蜂粮，48h后喂食无菌蜂粮的幼虫；G-Ⅵ处理为：48h内喂食含有四环素200μg/mL无菌蜂粮，48h后喂食含有B.apis(105CFU/mL)蜂粮的幼虫。
图5是肠道B.apis的电泳检测图。M为2000Maker，“+”为阳性对照，泳道1-3为处理组，“-”为阴性对照。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1、实验材料
实验室饲养的中华蜜蜂幼虫(3龄)，菌株Bombella Apis(B.apis)。
2、蜂粮与培养基
(1)LB培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g和琼脂15g溶于1L无菌水，摇匀后高压蒸汽灭菌20min(121℃)。
(2)TSA培养基：取40g胰酪大豆胨琼脂培养基干粉，溶于1L无菌水，摇匀后高压蒸汽灭菌20min(121℃)。
(3)MRS培养基：取64.3g MRS培养基干粉，溶于1L无菌水，摇匀后高压蒸汽灭菌20min(121℃)。
(4)PDA培养基：取200g土豆添加1L无菌水煮30分钟后，使用纱布过滤后，舍弃滤渣，取滤液。补充少量无菌水到1L后，添加20g葡萄糖，15g琼脂搅拌均匀后高压蒸汽灭菌20min(121℃)。
(5)蜂粮：按质量分数计，取无菌水37％，D-果糖6％，D-葡萄糖6％，酵母提取物1％，溶解后0.22μm过滤，然后加入鲜蜂王浆50％。配好后分装在2mL离心管中，-20℃保存。
3、目的菌液浓度
(1)MRS液体培养基中添加活化后的目的菌株B.apis加入过夜培养12h。
(2)取10μL菌液滴在血球计数板的计数室中，盖上盖片，在显微镜下计数。
(3)使用25×16规格的计数板，记录四个角以及中间的中格的数目，重复观察2次，取平均值。
(4)目的菌液浓度(CFU/mL)＝观测总数×50000。
4、促进蜜蜂幼虫生长发育的肠道微生物筛选
(1)从冰箱中取出配置好的蜂粮至37℃水浴锅中预热，并添加30μL在紫外照射24h后带有人工王台的48孔板中。
(2)使用移虫针从巢脾中挑取3龄中华蜜蜂幼虫到含有温浴好的蜂粮的孔中，舍弃破裂的幼虫。孔板放置在35℃、80±5％RH的恒温培养箱中。
(3)对照组和处理组的处理如下：
组Ⅰ(对照组)：每天饲喂无菌蜂粮。
组Ⅱ(低浓度四环素)：每天饲喂含有四环素100μg/mL的无菌蜂粮。
组Ⅲ(低浓度四环素+B.apis)：前两天(48h)内饲喂含有四环素100μg/mL的无菌蜂粮，之后饲喂含有B.apis(105CFU/mL)的蜂粮。
组Ⅳ(高浓度四环素)：每天饲喂含有四环素200μg/mL的无菌蜂粮。
组Ⅴ(高浓度四环素+普通蜂粮)：前两天(48h)内饲喂含有四环素200μg/mL的无菌蜂粮，之后饲喂无菌蜂粮。
组Ⅵ(高浓度四环素+B.apis)：前两天(48h)内饲喂含有四环素200μg/mL的无菌蜂粮，之后饲喂含有B.apis(105CFU/mL)的蜂粮。
(4)将即将排出肠道的幼虫转移至紫外照射24h铺有无菌滤纸的48孔板中，放置在35℃、80±5％RH的恒温培养箱中。
(5)记录不同处理下幼虫的化蛹率、羽化率和存活率，称量出房后不同处理组蜜蜂的体重。
(6)取低浓度四环素+B.apis处理组的粉眼蛹研磨涂板于不同平板上(MRS、LB、TSA平板)，检测回接细菌是否仍存在于蛹期肠道。
(7)将高浓度四环素+B.apis处理组的15头(5×3＝15头)5龄幼虫解剖，取其肠道研磨后加入1mL无菌水，保存于-80℃。
(8)取(7)中100μL肠道研磨液提取DNA，按照DNA提取试剂盒说明进行，肠道细菌DNA的OD值检测合格后，进行PCR，引物序列如下表1，凝胶电泳检测PCR产物，并以饲喂无菌蜂粮处理组的5龄幼虫(5头)作为阴性对照。
表1.引物序列
5、数据分析
实验中所得到的实验数据使用SPSS 19.0进行单因素方差Tukey’s t test分析(P<0.05)。化蛹率、出房率和存活率为百分数，平方根反正弦处理后使用SPSS 19.0进行方差分析。数据结果使用Graphpad 8.3.0作图。
6、实验结果
6.1低浓度四环素处理幼虫
利用四环素处理48h后，再通过蜂粮中添加特定的细菌B.apis(105CFU/mL)处理48h，观察幼虫是否能恢复成原本的状态。结果发现回接细菌之后能一定程度上改善幼虫的发育状况。如表2和图1所示。
表2.幼虫化蛹率、出房率和存活率
注：化蛹率＝成蛹数/总数；出房率＝出房数/成蛹数；存活率＝出房数/总数。同列不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
表2和图1中的G-Ⅰ处理为：喂食无菌蜂粮的幼虫；G-Ⅱ处理为：喂食含有四环素100μg/mL无菌蜂粮的幼虫；G-Ⅲ处理为：48h内喂食含有四环素100μg/mL无菌蜂粮，48h后喂食含有B.apis(105CFU/mL)蜂粮的幼虫。
由表2和图1可知，在化蛹率方面，添加低浓度四环素稍微下降了幼虫的化蛹率，但并不显著。而在出房率和存活率上看，低浓度四环素还是会使幼虫的出房率显著下降，并且回接B.apis后幼虫出房率能基本恢复至原来水平(df＝2，6；F＝20.966；P<0.01，G-I vs G-Ⅱ，P＝0.002,G-Ⅱvs G-III，P＝0.009)。幼虫存活率G-Ⅰ和G-Ⅲ组也同样与G-Ⅱ组有显著差异。(df＝2，6；F＝16.142；P<0.01，G-I vs G-Ⅱ，P＝0.006,G-Ⅱvs G-III，P＝0.007)。
为了探究回接的细菌B.apis是否伴随着幼虫达到蛹期，才出现出房率和存活率的差异，接下来取回接细菌后的蛹进行研磨涂板，结果未能发现目的菌种B.apis或者其他菌株出现在蛹期的蜜蜂中(图2)。可见蛹期确实体内并无微生物存在。
除了化蛹率等发育的因素，体重也是一个观察蜜蜂健康状况的因素。因此称量了所有成功出房的蜜蜂体重，结果发现G-Ⅰ、G-Ⅱ和G-Ⅲ三个处理组出房的蜜蜂体重差异不大(图3)。基本蜜蜂的体重都在60-80mg左右，新出房的蜜蜂体重或许跟幼虫时期的食物营养因素相关。
6.2高浓度四环素处理幼虫
根据低浓度的四环素处理幼虫的实验结果，重复进行一次高浓度四环素处理幼虫实验。结果表明，经过高浓度抗生素处理后的幼虫无法化蛹，但回接B.apis后，都显著提高了幼虫的化蛹率、出房率和存活率(表3和图4)。
表3.幼虫化蛹率、出房率和存活率
注：同列不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
表3和图4中的G-Ⅰ处理为：喂食无菌蜂粮的幼虫；G-Ⅳ处理为：喂食含有四环素200μg/mL无菌蜂粮的幼虫；G-Ⅴ处理为：48h内喂食含有四环素200μg/mL无菌蜂粮，48h后喂食无菌蜂粮的幼虫；G-Ⅵ处理为：48h内喂食含有四环素200μg/mL无菌蜂粮，48h后喂食含有B.apis(105CFU/mL)蜂粮的幼虫。
由表3和图4可知，高浓度抗生素处理后的幼虫全部在化蛹前死亡，无法成功度过蛹期。同时设立的高浓度抗生素处理48h后回补无菌蜂粮的对照组也同样是全部死亡，无法成蛹。在四环素处理后添加B.apis菌，能够使约20％的蜜蜂幼虫顺利化蛹，虽然远远达不到无四环素处理的79.16％，但也效果显著(df＝2,6；F＝176.321；P<0.001，G-Ⅳ(G-Ⅴ)vs G-Ⅵ，P<0.001；G-Ⅰvs G-Ⅵ，P<0.001)；化蛹的幼虫有将近一半的概率能顺利出房(df＝2，6；F＝96.366；P<0.001,G-Ⅳ(G-Ⅴ)vs G-Ⅵ，P<0.001；G-Ⅰvs G-Ⅵ，P＝0.02)。由于化蛹率过于低，最后的存活率也仅为10.42％，远不及G-Ⅰ组62.50％的存活率(df＝2，6；F＝236.683；P<0.001,G-Ⅳ(G-Ⅴ)vs G-Ⅵ，P＝0.001；G-Ⅰvs G-Ⅵ，P<0.001)。
高浓度的四环素与低浓度的四环素处理相比，同样是添加了B.apis化蛹率和出房率也有明显的差异。低浓度的四环素处理回接B.apis后的化蛹率、出房率和存活率分别为72.90％，87.07％和63.54％，而经过高浓度四环素处理后仅为20.83％，50.00％和10.42％。可见高浓度的四环素对蜜蜂幼虫的影响是更大的，即便是回接细菌之后也无法恢复至原来的正常水平。高浓度的四环素会致死中蜂幼虫，但在四环素处理48h后添加B.apis菌，能够让幼虫的化蛹率从0％上升至20.83％。说明B.apis对幼虫的生长发育具有重要作用。
接下来通过解剖预蛹幼虫肠道，提取肠道微生物DNA，通过PCR验证回接的细菌B.apis确实存在于预蛹幼虫肠道。B.apis的PCR产物为833bp，电泳结果符合预测，如图5所示。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.Bombella Apis在促进蜜蜂幼虫生长发育中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，是在促进四环素处理后蜜蜂幼虫生长发育中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的蜜蜂为中华蜜蜂。
4.Bombella Apis在制备提高蜜蜂幼虫化蛹率、出房率和存活率的微生态制剂中的应用。
5.一种提高蜜蜂幼虫化蛹率、出房率和存活率的微生态制剂，其特征在于，含有Bombella Apis。
6.Bombella Apis或包含Bombella Apis的微生态制剂在制备提高蜜蜂幼虫化蛹率、出房率和存活率的饲料或饲料添加剂中的应用。
7.一种提高蜜蜂幼虫化蛹率、出房率和存活率的饲料或饲料添加剂，其特征在于，含有Bombella Apis。
8.根据权利要求4或6所述的应用，其特征在于，所述的蜜蜂为中华蜜蜂。
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