KR20210155118A - 양봉꿀벌 밀위 유래 균주을 유효 성분으로 포함하는 세균 억제 및 벌의 생존 증가용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Enterococcus avium 또는 Burkholderia gladioli 균주 또는 그 균주의 생성물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물, Enterococcus avium 균주 또는 그 균주의 생성물을 유효성분으로 포함하는 벌의 생존율 증가용 조성물 및 그 방법에 관하 것으로, 본 발명의 균주를 벌의 군체에 적용시킨다면 벌을 건강하게 유지시키며 CCD로 인해 얻는 피해를 줄일 수 있을 것이다.

Description

양봉꿀벌 밀위 유래 균주을 유효 성분으로 포함하는 세균 억제 및 벌의 생존 증가용 조성물{A COMPOSITION FOR INHIBITING BACTERIA AND INCREASING SURVIVAL OF BEE COMPRISING MICROORGANISM FROM SOCIAL CROP OF Apis mellifera}

본 발명은 양봉꿀벌 밀위 유래 균주을 유효 성분으로 포함하는 세균 억제 및 벌의 생존 증가용 조성물에 관한 것이다.

Apis mellifera(양봉꿀벌)은 전세계에 가장 많이 길러지는 꿀벌 종류로 현재 남극을 제외한 모든 대륙에 분포하고 있다. 약 8000만~1억개의 상업적 군체가 존재하는데, 야생 군체도 비슷한 수가 존재할 것으로 예측된다. 꿀벌은 전세계적으로 2천억 달러의 시장가치를 지니며 전세계 꿀 유통량은 2017년 기준 190만 톤에 이른다. 꿀 이외에 밀랍, 화분, 프로폴리스 등 수많은 산물을 제공한다.

생태계에서 꿀벌은 핵심종의 역할을 하는데, 꿀을 채취하는 과정 중에 꿀벌의 체모에 꽃가루가 붙어 일벌이 여러 꽃으로 옮겨 다니며 꽃가루가 다른 꽃의 암술로 전해져 수분이 일어난다. 실제로 일부 지역에서는 88.89% 이상이 꿀벌에 수분을 의존하고, 평균적으로 약60% 이상의 식물이 꿀벌에 의존하는 것이 밝혀진 바 있다.

꿀벌 군체는 수십만 마리의 개체로 구성되어 있고, 개체 생산은 여왕벌이 담당한다. 여왕벌은 각 군체 당 한 마리만이 존재하고, 수정을 위한 정자 생산은 수천 마리의 수벌이 담당한다. 군체의 대다수는 일벌로 먹이 공급, 유체 관리, 벌집 보수 등 주요 기능을 담당한다.

A. mellifera 생태에 사회성이 큰 영향을 미치는데, 개체간 영양 교환 (trophallaxis) 은 사회성 유지에 중요한 역할을 한다. 일부 개체가 먹이를 찾아오고 나머지는 벌집 내에 다른 일을 수행하는 것을 통해 사회성 곤충은 큰 진화적 이득을 가진다. 벌의 신체 구조는 사회적으로 진화했는데, 이중 영양 교환에 특화된 신체 구조가 바로 밀위(social crop)이다. 밀위는 소화계의 가장 앞부분에 작은 저장공간으로 소화되지 않은 꿀을 저장한다. 저장한 꿀은 유충과 군체 내 다른 꿀벌에게 분배되거나 벌집 내로 옮겨져 저장된다. 밀위 꿀을 군체 내에서 공유하기 때문에 밀위의 상태가 중요하다. 한 개체의 밀위가 바이러스나 병균에 감염될 경우, 질병이 군체 내에서 빠르게 확산될 위험이 존재하기 때문이다.

21C에 들어 전 세계의 꿀벌이 별다른 이유 없이 개체수 감소를 보이고 있다. 이를 CCD (Colony Collapse Disorder)라고 한다. 벌에 기생하는 Varroa와 Acarapis 속의 응애로 인해 개체수가 감소한다고 초기에는 판단되었지만, 응애만으로는 설명할 수 없는 범위에서 CCD는 발생하고 있다. 미국 내에서 2018년에는 전년의 37.7%의 군체가 별다른 이유 없이 소멸했다 (Bee Informed Partnership, 2019). 학자들은 이 현상의 원인을 기생 해충, 농약의 축적, 신종 바이러스, 전자파, 면역력 결핍 등으로 예측하고 있지만, 현재 정확한 요인이 발견되지 않은 상태이다.

밀위 내 저장된 꿀은 군체 전체가 공유하게 된다는 특성을 가지고 있어, 군체의 건강 유지에 중요한 역할을 할 수밖에 없다. 꽃에 축적된 약물 등의 환경 변화로 의해 밀위 내 변화가 일어났다면 군체에 치명적일 것이다. 벌에서 나타나는 세균성 질병은 Melissococcus plutoniu이 유충의 소화계에 감염되어 죽게 하는 European foulbrood가 대표적이다. 만약 밀위에 세균성 질병이 발생한다면 빠른 속도로 감염이 번지고, CCD와 같은 현상이 일어날 것이다.

[선행 특허 문헌]

대한민국 공개특허번호 제10-2017-0049992호

본 발명의 목적은 A. mellifera의 사회성에 큰 역할을 하는 밀위에 서식하는 세균과 벌의 건강의 상관관계를 알아보는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 Enterococcus avium 또는 Burkholderia gladioli 균주 또는 그 균주의 생성물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서,상기 조성물은 세균에 대한 항균 활성을 가지는 것이 바람직하고, 상기 세균은 대장균인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 Enterococcus avium 균주 또는 그 균주의 생성물을 유효성분으로 포함하는 벌의 생존율 증가용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 벌에 Enterococcus avium 균주 또는 그 균주의 생성물을 처리하여 벌의 생존율을 증가시키는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

양봉 농가를 넘어 사회적 이슈가 되고 있는 CCD가 밀위 내 저장되는 꿀의 공유적 특성으로 인해 일어나는 현상일 수 있다는 가정하에 꿀의 상태에 영향을 미치는 요인으로 밀위 내 세균의 작용을 꼽았다. 만약 밀위 내 세균의 불균형으로 인해 꿀이 변질 또는 외부 세균에 대한 감염이 일어난다면 영양교환(trophallaxis)을 통해 꿀을 섭취한 꿀벌의 건강에 악영향을 줄 것이고 이는 벌 집단 전체의 영향을 미칠 수 있다. 이것은 군체가 한번에 돌연사하는 CCD로 나타날 수 있다.

따라서 밀위 내 세균이 A. mellifera 건강에 큰 영향을 미친다는 것을 증명하고 밀위 내 건강을 유지하기 위한 방안을 찾기 위한 연구를 진행했다. 꿀벌에서 밀위를 분리하고 밀위 내 세균을 과당을 포함한 MRS Agar와 NA 배지에 나누어서 배양했다. 과당이 포함된 배지를 제작한 이유는 밀위가 꿀을 저장하는 장소로 밀위 세균도 과당이 있는 환경에서 성장이 잘될 것으로 생각했다. 집락 (colony)를 형태 (form), 융기 (elevation), 가장자리 (margin)를 기준으로 NA 12종, MRS agar에서 5종 총 17 종의 세균을 분리했다. 분리된 세균이 밀위에 존재하는 세균이지 알아보기 위해 꿀이 포함된 배지에서 세균 성장을 확인했고, 17종 모두 세균이 성장하는 것을 확인했다.

이 중6, 7, b, c, d, e 세균은 꿀의 유무에 큰 영향을 받지 않고 일정한 성장률을 보였다. 일정한 성장률을 보인 세균이 밀위 내 정상세균총을 형성하면서 다른 세균의 밀도와 수를 조절할 것이라는 가설을 세우고 다른 세균에 성장에 영향을 미치는지 확인하였다.

밀위 세균은 다른 세균의 성장과 대장균의 성장을 억제하였다. 따라서 밀위 내 세균의 밀도를 일부의 일정한 성장을 보이는 세균이 조절하며 대장균(E. coli)와 같이 외부에서 침입한 세균에 대한 방어작용도 한다는 것을 알 수 있었다. 특히 6, b, c, d, e 세균은 매우 강한 억제력을 보였다.

밀위 세균은 꿀의 당도 변화가 크지 않았고, 20% 이상의 고농도의 꿀에서 성장하지 않는다. 따라서 수분함량이 높은 꿀(nectar)이 저장된 밀위에 세균이 생존하지만, 벌집 내에서 수분함량이 줄어든 꿀에서는 서식할 수 없다. 따라서 이들 세균은 밀위 내에 세균의 수를 일정하게 유지하며 꿀의 상태를 신선하게 유지시킬 수 있다.

E. coli는 20% 이상의 꿀에도 성장을 보이며, 외부에 감염된 세균의 일부는 꿀에 서식할 수 있음을 보여준다. 그러나 밀위 세균은 외부세균의 감염을 막을 수 있는 물질을 분비해 꿀의 변질과 오염을 막는다는 것을 알 수 있었다. 밀위 세균 중 가장 효과적으로 세균 억제 효과를 보여준 b, c, e, 6, 7 균주에 대한 염기서열을 분석한 결과, b, c, e, 6 균주는 Enterococcus avium 로 동일한 종일 것이라는 결과가 나왔고, 7번 균주는 Burkholderia gladioli 계열로 밝혀졌다.

밀위 세균이 벌에 미치는 영향을 알기 위해 벌에게 세균과 상층액이 처리된 먹이를 주고 생존수를 확인했다. 특히 c, 6세균의 상층액을 섭취한 벌은 대조군에 비해 생존 기간이 2 배 가까이 증가했다.

세균이 꿀벌의 면역에 영향을 주었을 것으로 생각할 수 있다. 세균의 생성물은 항균 작용에 관여했을 것이다. 벌의 밀위는 꿀을 공유하는 장소로 벌의 면역과 벌의 군체가 건강하게 유지되기 위해 중요한 장소이다. 밀위에는 세균을 통한 면역작용이 일어나고 있으며, 밀위 내 세균의 균형은 꿀의 상태와 개체 단위의 벌, 그리고 벌 집단에 영향을 미칠 것임을 예상할 수 있다.

본 발명에서는 벌을 해부하여 밀위를 분리해 NA, MRS agar에 접종해 17종 세균을 분리하고, 꿀이 포함된 NB에서 성장을 확인하였을 때 일정한 성장을 유지한 세균 6종을 제외하고 나머지 세균은 과잉 증식했다. 배지 환경에 상관 없이 일정하게 성장한 세균에 의해 밀위 내 세균의 밀도가 조절된다는 가설을 세웠다. 세균 6종을 선별 후 세균의 생성물을 얻기 위해 세균 배지의 상층액을 필터했다. 상층액을 밀위 내 세균과 E. coli에 처리했을 때, 세균의 성장을 억제했다. E. coli성장 억제는 외부 감염 세균을 억제할 수 있음을 보여준다. 세균 6종은 꿀을 분해하여 사용을 하지만 꿀의 당도에 큰 변화를 주지 않았다. 꿀에서 밀위 세균 3종(세균 6, 7, 8)의 성장은 꿀의 농도가 20% 이상이 되면 세균의 성장이 억제되고, E. coli는 꿀 20%에도 성장한다. 세균3종과 상층액을 벌에게 급여해 생존율을 관찰했을 때, 세균 2종(세균 b, 6) 의 상층액을 섭취한 벌들이 가장 오랜 기간 생존했고, 대조군과 세균을 직접 섭취한 벌들이 가장 높은 사망률을 보였다. 염기서열을 분석하여 세균 4종(b, c, e, 6)은 E. avium으로 확인되었다.

본 발명은 밀위 세균 생성물이 다른 세균을 억제하다는 것과 실제로 밀위 내 세균이 유해균을 억제함으로써 벌의 건강을 유지시켜준다는 것을 보여주었다. 따라서 밀위에서 분리한 세균을 벌의 군체에 적용시킨다면 벌을 건강하게 유지시키며 CCD로 인해 얻는 피해를 줄일 수 있을 것이다.

도 1은 배지 제작과정,
도 2는 벌을 실험하기 위한 장치 준비,
도 3은 밀위의 세균을 분리하는 과정,
도 4는 밀위 세균의 순수 분리 배양,
도 5는 꿀이 포함된 배지를 제작 후 세균을 접종,
도 6은 밀위세균 배양액 중 상층액 분리 과정,
도 7은 밀위 세균의 상층액을 세균에 처리,
도 8은 밀위 세균의 산물이 E. coli에 처리 과정,
도 9는 당도계를 이용해 꿀의 당도변화 확인,
도 10은 분광광도계를 통한 흡광도 측정,
도 11은 서열 분석을 위한 세균준비와 Blast 검색,
도 12는 벌을 옮기는 과정,
도 13은 각설탕에 세균과 상층액 처리 과정,
도 14는 벌의 생존을 확인하기 위한 준비과정,
도 15는 NA와 MRS agar 배지에 밀위 세균을 RT와 30℃에 배양,
도 16은 30℃에 배양된 NA 의 세균 집락 (colony),
도 17은 30℃에서 배양된 MRS 의 세균의 집락 (colony),
도 18은 꿀이 포함된 NB 배지에 세균의 성장,
도 19는 꿀이 포함된 MRS 배지에서의 세균의 성장,
도 20은 세균1, 6, 7 세균의 생성물이 세균 성장에 미치는 영향,
도 21은 세균 b, c, d, e 세균의 생성물이 세균 성장에 미치는 영향,
도 22는 밀위 내 정상세균총의 생성물이 포함된 배지에서 E.coli의 성장,
도 23은 1-12 세균을 넣은 꿀 당도의 변화,
도 24는 a-e 세균에 의한 꿀 당도의 변화,
도 25는 꿀 농도에 따른 밀위 세균의 성장,
도 26은 꿀 농도에 따른 대장균 (E.coli)의 성장 및
도 27은 b, c, 6과 생성물 섭취에 따른 꿀벌의 생존수를 나타낸 그림.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: 배지 준비

Lactobacili MRS Broth (Difco) 27.5g, Nutrient Broth(Difco) 4g을 각각 삼각 플라스크에 넣고 증류수 500mL를 섞은 MRS broth와 Nutrient broth에 과당 10g을 첨가하여 2% 과당을 포함되도록 했다. Lactobacili MRS Agar (Difco) 35g과 Nutrient Agar (Difco) 11.5g을 각각 삼각 플라스크에 증류수 500mL와 과당 10g과 섞어 2%의 과당 함량이 되도록 준비했다. 삼각플라스크 입구를 알루미늄 호일로 밀봉하고 멸균 테이프가 부착했다. 121℃(259.8℉)에 15분 동안 autoclave로 살균했다. Agar를 포함하는 배지는 petri dish에 부어 굳혔고, broth는 conical tube로 옮겨 냉장보관했다.

실시예 2: A. mellifera 밀위 분리 및 세균 분리

앞은 유리이고, 3면은 철망으로 된 나무새장을 준비하고 새장의 철망을 전지가위로 잘랐다. 구멍이 뚫린 새장에 고무장갑을 끼워 넣고, 글루건을 이용하여 고정시켰다. 새장에 70% 에탄올이 든 플라스크와 증류수가 든 비커를 넣었다. 벌이 든 케이지에서 벌을 한 마리씩 꺼내 10초간 에탄올에 담가 살균하였다. 살균된 벌을 증류수에 담가 에탄올을 제거했다. 벌을 페트리디쉬에 올려 놓고 흉부를 고정시켰다. 침을 잡아당겨 독샘과 내장뿐 아니라 소화기 상단부에 있는 밀위를 분리했다. 벌 30마리에서 밀위를 채취하고 10mL의 증류수를 넣었다. vortex mixer를 이용해 밀위를 파쇄하여 꿀과 세균을 얻었다. 밀위액을 50㎕과 100㎕ 각각 MRS agar와 NB agar에 떨어뜨려 spreader를 사용해 도말했다. 배지를 4일 정도 상온과 30℃로 설정된 배양기를 이용해 배양했다. 세균이 배양된 배지로부터 세균의 콜로니 (colony)를 형태 (form), 융기 (elevation), 가장자리 (margin), 색 (color)를 기준으로 분류했다. 분류된 세균은 코니칼 튜브에 MRS broth 5mL과 NB 5mL를 넣은 상태에서 팁을 이용하여 순수 분리하여 30℃ 배양기에서 배양했다.

실시예 3: 꿀 포함된 배지에 밀위 세균 성장

MRS broth 27 mL와 꿀 3 mL를 함께 넣었고, NB 72mL와 꿀 8mL와 섞어 꿀 10%가 포함된 배지를 만들었다. 10% 꿀이 포함된 MRS broth, 10% 꿀이 포함된 NB, MRS broth, NB 각각 5mL에 순수 분리 배양된 세균 20㎕를 넣었다. 세균을 넣은 배지를 vortex mixer를 이용해 섞은 뒤 4일간 30℃로 설정된 배양기에 넣어 배양했다. 세균의 양을 확인하기 위해 분광광도계의 파장을 600nm로 맞추어 세균 배양액을 1mL씩 큐벳에 넣어 흡광도를 측정했다.

실시예 4: 밀위 세균의 생성물에 의한 세균 성장

1, 6, 7 및 b, c, d 세균에 대한 배양액을 2000rpm에서 10분간 원심분리했다. 20mL 주사기에 0.2μm 필터를 연결하고 세균 배양액을 걸러 상층액을 얻었다. 배지는 MRS broth와 NB 배지에 꿀을 넣어 10% 꿀이 포함된 배지를 만들었다. 꿀이 포함된 배지 5mL를 conical tube에 넣었다. 상층액을 분리한 세균을 제외한 나머지 세균을 50㎕씩 배지에 넣고 세균의 상층액도 50㎕ 처리했다. 꿀 10%의 NB배지에서 5mL과 세균 50㎕를 처리하여 상층액을 넣은 배지에서의 세균의 성장과 비교했다. 4일 동안 30℃ 배양기에서 배양 후 분광광도계의 파장 600nm에 두고 흡광도를 측정했다.

실시예 5: 밀위 세균의 생성물이 E. coli 의 성장에 미치는 영향

b, c, d, e, 1, 6, 7 세균의 상등액 100㎕을 microtube에 NB 900㎕와 혼합했다. E. coli (KTCT 1039) 10㎕을 넣고 vortex mixer로 혼합했다. 상층액을 넣은 것과 비교하기 위해 E. coli 10㎕와 NB 1mL를 넣어 배양한 것도 준비했다. 4일 동안 30℃ 배양기에 배양하고 분광광도계로 파장 600nm에서 흡광도를 측정했다.

실시예 6: 밀위 세균이 꿀 성분에 미치는 영향

꿀 3mL를 microtube에 넣고 1-12와 a-e의 세균을 10㎕씩 꿀에 첨가했다. 4일 동안 30℃ 배양기에 배양 후, 각 샘플을 증류수와 섞어 꿀의 농도가 20% 인 용액으로 희석했다. 희석한 샘플을 당도계를 사용하여 당도를 측정하여 세균을 넣지 않은 꿀과 비교했다.

실시예 7: 꿀의 농도에 따른 밀위 세균의 생장

NB 배지 20mL에 꿀을 2g, 4g, 8g, 16g을 넣어 10, 20, 40, 80%의 꿀을 포함하는 NB배지를 만들었다. 꿀 10% NB 배지에서 일정한 성장을 보여준 6, 7, 8번 세균 10㎕을 microtube에 넣고, 다양한 농도의 꿀을 포함한 NB 3mL을 첨가했다. 각 샘플은 4일 동안 30℃ 배양기에서 키웠다. 분광광도계를 사용시 세균을 넣지 않은 다양한 농도의 꿀을 포함하는 NB를 Blank로 사용하였다. 파장 600nm에서 세균에 대한 흡광도를 측정했다.

실시예 8: 꿀의 농도에 따른 대장균( E. coli ) 성장 변화

NB 10mL에 꿀을 100㎕, 500㎕, 1mL, 1.5mL, 2mL를 넣어 1, 5, 10, 15, 20%의 꿀이 포함된 NB을 만들었다. 다양한 농도의 꿀이 포함된 NB 1mL를 microtube에 넣고, E. coli (KTCT 1039) 10㎕을 추가했다. Vortex mixer를 이용해 각 샘플을 혼합하고, 4일 동안 30℃ 배양기에 배양했다. 분광광도계를 이용해 파장 600nm에서의 흡광도를 측정하여 꿀에 농도에 따른 E. coli의 성장을 관찰했다.

실시예 9: 밀위 세균에 대한 염기 서열 분석

6, 7세균은 NA 배지에 b, c, e 세균은 MRS agar에 loop을 이용해 배양했다. 세균이 배양된 배지를 Macrogen. Inc에 의뢰해 16s rRNA sequencing을 진행했다. Sequencing 결과를 바탕으로 Blast를 통해 서열이 일치하는 세균의 정보를 확인하고 가장 유사도가 높은 종 선별했다.

실시예 10: 밀위 세균과 생성물이 벌 생존에 미치는 영향

A. mellifera를 10마리씩 7개의 실험군을 만들었다. 봉침용 벌을 키우는 플라스틱 통에 벌을 넣고 각 그룹에는 2개의 1cmx1cmx1cm 각설탕이 제공되었다. 대조군은 아무것도 처리하지 않은 각설탕을 제공했다. 각설탕에는 각각 20㎕의 세균 b, c, 6과 세균 b, c, 6의 상등액 20㎕을 처리했다. 그리고 각 벌통의 아래에는 petri dish에 증류수 20mL 정도를 넣고 휴지를 이용해 물을 벌들이 섭취할 수 있게 하였고, 벌통 안에 종이를 접어 벌들이 모여서 체온을 유지할 수 있는 공간을 만들 수 있게 하였다. 벌들은 어둡고 안정된 환경에 보관하여 생존한 벌의 수를 매일 17일 동안 확인했다.

상기 실시예의 결과를 하기에 기재한다

밀위 내 세균 분리 및 분류

A. mellifera 밀위에 서식하는 세균을 분리하고 분류하기 위해 벌의 소화기관을 분리하고 밀위을 모아 2%의 과당을 가진 MRS agar와 NB agar에 접종 후 상온과 30℃에서 배양하여 세균 성장에 적당한 온도 조건을 확인했다. 상온과 30℃에 배양했을 때 밀위 세균은 상온보다 30℃에서 세균이 성장하는 것을 확인 할 수 있었다. NA 에서 다양한 세균의 집락(colony)가 관찰되었다. Lactobacillus에 대한 선택 배지인 MRS agar에 자란 세균은 유산균의 일종일 것으로 예측되는 세균의 집락이 나타났다(도 15).

NA에 배양된 세균의 집락을 형태, 고도, 가장자리, 색깔로 분류했다. 12종의 세균이 발견되었다. 형태 (form)은 원형 (circular), 반점 (punctiform), 불규칙 (irregular)으로 분류되고, 반점 (punctiform), 불규칙(irregular)가 가장 많았다. 융기 (elevation)는 돔형 (pulvinate), 볼록형 (convex), 올라옴 (raised)가 관찰되고, 볼록형 (convex)이 가장 많았다. 가장자리 (Margin)는 매끈형 (entire), 물결형 (Undulate) 두 가지로 나타났고, 이 중 매끈형 (entire)가 가장 많았다. 색은 흰색 (white)과 노란 크림색 (creamy yellow)을 가진 집락이 관찰되었고, 대부분 흰색 (white)을 나타내었다(도 16).

표 1은 NA에서 콜로니의 분류

MRS 배지에서는 5종의 세균이 관찰되었다. 형태 (form)은 섬유상 (Filamentous)과 반점형 (punctiform)이 나타났으며 이 중 반점형 (punctiform)이 많았다. 융기는 돔형 (pulvinate)이 많았고, 가장자리는 매끈형 (Entire)이 많았다. 색은 백색이었다(도 17).

표 2는 MRS 아가에서 콜로니의 분류

꿀이 포함된 배지에서의 밀위 세균의 성장

앞선 실험에서 분리한 밀위 세균이 꿀이 포함된 배지에서 어떤 성장을 보이는지 확인하기 위해 10% 꿀이 포함된 NB, 10% 꿀이 포함된 MRS Broth에 세균을 배양하여 성장에 따른 세균의 변화를 확인했다.

밀위 세균은 NB보다 꿀이 포함된 NB에서 1, 6, 7 세균을 제외하고 높은 성장률을 나타내었다. 1, 7은 다른 세균에 비해 꿀이 포함된 배지에서 세균의 양의 증가가 크지 않았고, 특히 6 세균은 세균의 성장이 0.1 이상 감소하는 것을 볼 수 있었다. 그리고 12종 세균 모두 꿀에서 성장이 가능하며, 9종 세균은 급격히 증가하였고, 3종은 일정한 세균의 양이 유지된다고 볼 수 있다(도 18).

MRS에서는 2배 가량 증가한 a 세균을 제외한 b, c, d, e 세균은 오히려 약간의 감소를 나타냈지만, 꿀이 없는 조건과 별 차이를 보이지 않았다. 이를 통해 1, 6, 7 과 b, c, d, e는 꿀의 유무와 상관 없이 일정한 세균의 수가 유지되는 것으로 보인다(도 19).

밀위 세균의 생성 물질이 세균 성장에 미치는 영향

밀위 세균 중 일정한 성장을 나타낸 세균이 정상세균총으로 생각되었다. 정상세균총이 각 기관에서의 특정 물질을 만들고 세균의 밀도와 면역에 작용한다는 사실을 바탕으로 꿀의 유무와 상관없이 독립적인 성장을 나타낸 세균의 생성 물질을 이용해 밀위 내 다른 세균의 성장에 미치는 영향을 확인했다. 1, 6, 7, b, c, d, e 밀위 세균의 생성물질은 세균이 배양된 배지 내 존재하기 때문에 배양액의 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액을 세균에 처리한 후 성장을 확인했다. 1, 6, 7 세균의 생성물질은 세균의 성장을 억제하는 것을 볼 수 있었다. 1 세균은 2, 4, 8, 10, 11, 12 세균에 대한 성장억제를 나타내었고, 6, 7 세균은 2, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 12 모든 세균에 성장이 억제되었다. 6 세균에 의한 성장 억제 효과가 7 세균 보다 성장 억제 효과가 큰 것을 볼 수 있었다(도 20).

b, c, d, e 세균을 밀위 세균에 처리 시, b, c, d, e 세균이 MRS broth에 배양되었기 때문에 MRS broth에서의 밀위 세균의 성장을 확인했다. MRS broth에서 5번을 제외하고 나머지 세균 모두 성장이 증가한 것을 보였다. b, c, d, e 세균은 2, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 12에 대해 성장을 거의 0에 가깝게 억제시켰다. 꿀이 포함된 배지에서 독립적인 성장을 보여준 세균은 다른 세균의 성장을 억제하는 물질이 존재하는 것을 알 수 있었다(도 21).

밀위 세균이 생성 물질이 E. coli 성장에 미치는 영향

밀위 세균의 생성물질이 외부에서 침입한 세균에도 작용하는지 알아보기 위해 대장균 (E. coli, KTCT 1039)과 상층액을 함께 첨가해 배양 후 세균 양의 변화를 통해 성장에 미치는 영향을 확인했다.

대장균(E. coli) 성장은 7 세균은 거의 억제하지 못했고, 6 세균은 20%밖에 감소시켰고, 1 세균은 50% 이상 감소시켰음을 볼 수 있었다. b, c, d, e 세균은 84% 이상 감소시킴으로 모두 비슷한 비율로 대장균(E. coli)의 성장을 억제하는 것을 확인했다. 따라서 밀위 세균은 외부 세균을 방어하는 능력이 있음을 알 수 있다(도 22)

밀위 세균이 꿀에 미치는 영향

밀위의 중요한 역할은 꿀을 보관하고 이를 벌들이 공유하여 사용하는 것으로 밀위 내 꿀의 상태는 벌의 상태를 좌우 할 수 있다. 따라서 밀위 세균이 꿀에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해 세균에 의한 꿀의 당도 변화를 확인했다. 꿀을 이용한 세균의 대사가 활발하다면 당도의 변화는 클 것이라고 가정했다. 꿀의 당도 변화가 작을수록 꿀에 미치는 영향은 적은 것으로 생각했다. 순수한 꿀에 각 세균을 배양하고, 같은 비율로 희석하여 당도 변화를 측정했다. 모든 세균이 당도를 조금씩 낮추는 것을 볼 수 있다. 과당이 분해되면서 당도가 떨어진 것으로 보이는데, 특히 2, 3 세균이 당도를 많이 감소시켰음을 볼 수 있었다. 10, 12 세균도 2.8 brix 이상 떨어뜨렸다(도 23).

a, b, c, d, e 세균도 당도에 변화는 있지만 23 brix 이하로 감소시키는 종은 없었다. 따라서 세균은 대부분 꿀을 활용한 대사과정을 통해 에너지를 얻고 있으나 꿀을 활용하는 정도는 차이를 보였다(도 24).

꿀의 농도에 따른 밀위 세균의 성장

꿀은 항균력을 가지는데, 꿀의 농도에 따라 밀위 세균의 생존에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해 다양한 농도의 꿀을 포함하는 NB 배지에 세균의 성장을 관찰했다. 10%의 꿀이 포함된 NB에는 세균이 모두 생존했다. 그러나 20%부터는 거의 0에 가까운 수치의 성장을 보여주었다. 그 이상에서도 0이라는 수치를 보여 고농도에서는 각 종이 생존할 수 없다는 결론을 내렸다. 밀위 내에는 꽃에서 추출한 수분함량이 높은 꿀(nectar)이 존재하기 때문에 각 세균이 생존할 수 있지만, 벌들에 의해 수분이 제거된 꿀에서는 서식할 수 없다는 것을 알 수 있다(도 25).

꿀의 농도에 따른 E. coli 의 성장 변화

꿀의 항균 효과가 대장균 (E. coli)에도 나타나는지 확인하기 위해 다양한 농도의 꿀이 포함된 배지에서 대장균 (E. coli)을 배양하고 성장을 관찰했다. 5%에서 10%사이에 0.13의 흡광도 증가를 제외하면 전체적으로 꿀의 농도와 성장률은 반비례 관계에 있음을 알 수 있었다. 20%의 꿀이 포함된 배지에서도 대장균 (E. coli)은 세균 양이 감소하긴 했지만 0.3 이상의 성장을 볼 수 있었다. 따라서 밀위 세균은 꿀에 영향을 주지 않지만 많은 외부로부터 감염되는 세균이 꿀의 상태를 변화시킴으로 벌에 치명적으로 작용할 수 있음을 예측할 수 있었다(도 26).

밀위 세균에 대한 염기 서열 분석

밀위 세균인 6, 7, b, c, e 에 대한 염기서열을 분석하였다. 16srRNA의 염기서열을 분석하고 blast를 통해 알아냈다. Enterococcus avium 임을 알 수 있었다. Lactobacillus 계열로 젖산을 생성하는 기능을 하는 세균이다. E. avium은 조류에서 흔히 발견되며, 드물게 인간에게 병원균으로써 검출되는 경우가 있다. 7 세균은 Burkholderia gladioli pv. Gladioli는 흔히 식물의 구근에서 corm scab을 일으키는 병균으로 알려져 있다.

표 3은 16s rRNA 염기서열 분석을 나타낸 표

벌 생존에 밀위 세균이 미치는 영향

벌의 건강은 면역 작용과 관련이 있는데, 특히 밀위는 벌이 꿀을 공유하며 나누어 먹는데 중요하게 작용하는 기관으로 밀위 내 꿀의 상태는 벌 전체 집단에 영향을 줄 수 있다. 밀위 세균은 꿀의 상태는 신선하고 외부 세균이 감염을 막는데 중요하게 작용함으로 벌의 면역을 높이는데 작용한다고 할 수 있다.

따라서 세균과 세균의 생성물을 먹이에 처리 후 벌의 생존기간을 확인함으로 세균과 생성물이 면역에 미치는 영향을 확인하고자 했다. A. mellifera를 한 그룹당 10마리씩 넣고 7 그룹을 만들고 각 그룹에 각설탕을 제공했다. 대조군은 순수한 각설탕, 나머지에는 b, c, 6의 상등액과 세균을 처리하고 17일간 각 그룹의 생존한 벌의 수를 세었다.

대조군과 b 균주를 섭취한 그룹이 가장 먼저 전멸했다. 그리고 b의 상등액과 c, 6번 균주를 섭취한 그룹이 다음으로 가장 빠른 속도로 사망했다. 나머지 그룹들도 대부분 13일 이내에 전멸했다. 그러나 c, 6 균주의 상층액을 섭취한 그룹은 눈에 띄는 생존률을 보였다. 두 그룹 모두 10일차에 60%의 생존률을 보였고, 실제로 전멸하는데 까지 각각 16, 17일이라는 매우 긴 시간이 소요됐다.

이 결과를 통해 각 세균의 생성물이 꿀벌의 건강에 영향을 주는 것을 확인할 수 있었다. 특히 b 균주를 제외하면 대조군보다 긴 시간 동안 생존을 한 것을 토대로 각 종과 그 상등액이 꿀벌의 밀위 내에서 꿀벌에 이로운 작용을 한다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 세균이 직접 작용하는 것보다 그 부산물이 꿀벌에게 더 이롭게 작용한다는 것을 알 수 있었다(도 27).

Claims (5)

1. Enterococcus avium 또는 Burkholderia gladioli 균주 또는 그 균주의 생성물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물.
2. 제1항에 있어서,상기 조성물은 세균에 대한 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
3. 제2항에 있어서,상기 세균은 대장균인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
4. Enterococcus avium 균주 또는 그 균주의 생성물을 유효성분으로 포함하는 벌의 생존율 증가용 조성물.
5. 벌에 Enterococcus avium 균주 또는 그 균주의 생성물을 처리하여 벌의 생존율을 증가시키는 방법.
   

Images