CN115508484A - 一种氯吲哚酰肼手性异构体的分离分析方法 - Google Patents

一种氯吲哚酰肼手性异构体的分离分析方法 Download PDF

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CN115508484A CN202211193602.4A CN202211193602A CN115508484A CN 115508484 A CN115508484 A CN 115508484A CN 202211193602 A CN202211193602 A CN 202211193602A CN 115508484 A CN115508484 A CN 115508484A
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Abstract

本发明涉及化工分析技术领域，具体涉及一种氯吲哚酰肼手性异构体的分离分析方法。包括如下步骤：(1)将正己烷、无水乙醇和二乙胺混合，得到流动相；(2)用无水乙醇作溶剂溶解待测样品；(3)采用高效液相色谱法对样品进行检测，检测波长为260‑300nm，色谱柱为纤维素类手性色谱柱，流速为0.5‑2mL/min，色谱柱温度为25‑45℃。本发明方法可将N’‑(4‑氯苯亚甲基)‑1‑甲基‑2,3,4,9‑四氢吡啶并[3,4‑b]吲哚‑3‑甲酰肼的四种手性异构体进行有效分离，专属性强，分离度好，各手性异构体含量检测准确度高；有助于对氯吲哚酰肼光学活性的进一步研究，对于实验质量控制具有重要意义。

Description

一种氯吲哚酰肼手性异构体的分离分析方法
技术领域
本发明涉及化工分析技术领域，具体涉及一种氯吲哚酰肼手性异构体的分离分析方法。
背景技术
随着立体化学的发展，手性药物的研究也备受关注，具有相同理化性质的农药手性异构体可能表现出截然不同的生物活性，在毒性、致畸、致癌等方面也可能表现出截然不同的性质。例如：精喹禾灵原药中的R异构体被植物吸收的速度和在植物体内的移动性较高，不仅发挥药效的速度快，而且药效较为稳定，不易受温度、湿度等环境条件的影响，但是其无效体S体则不具备除草活性。
氯吲哚酰肼由南开大学汪清民课题组采用β咔啉类生物碱合成，具有较高的抗烟草花叶病毒活性，现阶段由京博农化科技有限公司进行产业化开发。氯吲哚酰肼的IUPAC命名为N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼。
N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼共有四种构型，分别为(1S,3S)-N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼、(1R,3S)-N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼、(1R,3R)-N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼和(1S,3R)-N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼，其光学纯度直接影响产品的生物活性。
基于此，有必要提供一种氯吲哚酰肼手性异构体的分离分析方法。
发明内容
针对现有技术中氯吲哚酰肼手性异构体分析领域的技术空白，本发明提供一种氯吲哚酰肼手性异构体的分离分析方法，可将(1S,3S)-N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼、(1R,3S)-N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼、(1R,3R)-N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼和(1S,3R)-N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼四种立体异构体有效分离，专属性强，分离度好，各异构体含量检测准确度高，对于实验质量控制具有重要意义。
本发明技术方案如下：
一种氯吲哚酰肼手性异构体的分离分析方法，包括如下步骤：
(1)流动相配制：将正己烷、无水乙醇和二乙胺混合，得到流动相；
(2)供试品溶液的配制：用无水乙醇作溶剂溶解待测N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼样品，得到供试品溶液；
(3)检测：采用高效液相色谱法对样品进行检测，检测波长为260-300nm，色谱柱为纤维素类手性色谱柱，流速为0.5-2mL/min，色谱柱温度为25-45℃。
进一步的，步骤(1)正己烷、无水乙醇和二乙胺的体积比为(80-90)：(10-20)：(0.05-0.2)。
进一步的，步骤(1)正己烷、无水乙醇和二乙胺的体积比为85∶15∶0.1。
进一步的，步骤(2)配制的供试品溶液的浓度为0.4-10mg/mL。
进一步的，步骤(3)供试品溶液的进样量为0.1-10μL。
进一步的，步骤(3)检测波长为282nm，色谱柱流速为1.0mL/min，色谱柱温度为40℃，进样量5.0μL。
进一步的，步骤(3)色谱柱型号为LuxR 5μm i-Cellulose-5。
进一步的，步骤(3)色谱柱规格为250mm×4.6mm。
本发明的有益效果在于：
本发明采用纤维素类手性色谱柱，以正己烷、无水乙醇、二乙胺为流动相，可以将(1S,3S)-N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼、(1R,3S)-N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼、(1R,3R)-N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼和(1S,3R)-N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼四种立体异构体有效分离，效果显著优于常规流动相方案；
同时选择无水乙醇溶解样品，既可以增大样品的溶解度，使样品充分溶解，又由于采用流动相组分溶解，增大了样品与流动相之间的互溶性，减少了色谱中发生的溶剂效应，保持了样品的稳定性；
选择相应的进样体积(以5μL最佳)以及温度(以40℃最佳)的色谱柱柱温，提高了色谱峰的对称性以及良好的色谱峰面积和峰高。
本发明填补了现有技术中相应领域的技术空白，可以实现各异构体的良好分离，色谱峰形好，积分计算结果准确、重复性好，所得结果可信度高，特别适用于农药原药产品的质量控制，对保证产品的质量具有重要作用和现实意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1中N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼SS构型单体的高效液相色谱图。
图2是实施例1中N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼RS构型单体的高效液相色谱图。
图3是实施例1中N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼RR构型单体的高效液相色谱图。
图4是实施例1中N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼SR构型单体的高效液相色谱图。
图5是实施例2中N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼原药的高效液相色谱图。
图6是实施例3中N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼原药的高效液相色谱图。
图7是实施例4中N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼原药的高效液相色谱图。
图8是实施例5中N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼原药的高效液相色谱图。
图9是实施例6中N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼原药的高效液相色谱图。
图10是实施例7中N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼原药的高效液相色谱图。
图11是实施例8中N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼原药的高效液相色谱图。
图12是实施例9中N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼原药的高效液相色谱图。
图13是对比例1中N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼原药的高效液相色谱图。
图14是对比例2中N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼原药的高效液相色谱图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
下述实施例及对比例均使用岛津LC-20A高效液相色谱仪及LuxR 5μm i-Cellulose-5(250×4.6mm)手性色谱柱进行，在其他实施例中也可以使用岛津SPD-M20A、SIL-20A或DGU-20A3R或其他厂家、型号的高效液相色谱仪以及其他纤维素类手性色谱柱。
实施例1
分别对N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼的SR、SS、RS、RR构型单体进行测试，确定四种构型单体的出峰位置。
色谱分析条件如下：
流动相：体积比为85∶15∶0.1的正己烷、无水乙醇、二乙胺混合体系；
流速：1.0mL/min；
检测波长：282nm；
柱温：40℃；
进样体积：5.0μL。
测试步骤如下：
(1)准确称取(1S,3S)-N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼0.0216g，置于50mL容量瓶中，加40mL无水乙醇，振荡溶解后，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液1。
取5.0μL供试品溶液1注入高效液相色谱仪，在上述条件下进行色谱分析，记录色谱图，结果见图1。
(2)准确称取(1R,3S)-N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼0.0208g，置于50mL容量瓶中，加40mL无水乙醇，振荡溶解后，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液2。
取5.0μL供试品溶液2注入高效液相色谱仪，在上述条件下进行色谱分析，记录色谱图，结果见图2。
(3)准确称取(1R,3R)-N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼0.0221g，置于50mL容量瓶中，加40mL无水乙醇，振荡溶解后，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液3。
取5.0μL供试品溶液3注入高效液相色谱仪，在上述条件下进行色谱分析，记录色谱图，结果见图3。
(4)准确称取(1S,3R)-N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼0.0204g，置于50mL容量瓶中，加40mL无水乙醇，振荡溶解后，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液4。
取5.0μL供试品溶液4注入高效液相色谱仪，在上述条件下进行色谱分析，记录色谱图，结果见图4。
(5)通过对图1-图4的综合分析，确定SS构型的出峰位置为9.244min，RS构型的出峰位置为19.446min，RR构型的出峰位置为10.429min，SR构型的出峰位置为16.129min。
上述结果表明，在本发明色谱分析条件下，N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼的四种手性异构体实现良好的基线分离。
实施例2
色谱分析条件如下：
流动相：体积比为85∶15∶0.1的正己烷、无水乙醇、二乙胺混合体系；
流速：1.0mL/min；
检测波长：282nm；
柱温：40℃；
进样体积：5.0μL。
测试步骤如下：
(1)准确称取N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼原药0.0509g，置于50mL容量瓶中，加40mL无水乙醇，振荡溶解后，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液5。
取5.0μL供试品溶液5注入高效液相色谱仪，在上述条件下进行色谱分离分析，记录色谱图，结果见图5。
(2)对比分析图1-图5，保留时间为9.238min、10.488min、16.204min和19.429min的色谱峰分别为SS构型、RR构型、SR构型以及RS构型的色谱峰。
可以看出，本实施例中四种异构体可以实现良好的基线分离。
实施例3
色谱分析条件如下：
流动相：体积比为80∶20∶0.1的正己烷、无水乙醇、二乙胺混合体系；
流速：1.0mL/min；
检测波长：282nm；
柱温：40℃；
进样体积：5.0μL。
测试步骤如下：
(1)准确称取N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼原药0.0516g，置于50mL容量瓶中，加40mL无水乙醇，振荡溶解后，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液6。
取5.0μL供试品溶液6注入高效液相色谱仪，在上述条件下进行色谱分离分析，记录色谱图，结果见图6。
(2)对比分析图1-图4和图6，保留时间为6.617min、7.463min、10.804min和12.754min的色谱峰分别为SS构型、RR构型、SR构型以及RS构型的色谱峰，此时色谱分析时间缩减较多，基线分离效果略差于实施例2。
实施例4
色谱分析条件如下：
流动相：体积比为90∶10∶0.1的正己烷、无水乙醇、二乙胺混合体系；
流速：1.0mL/min；
检测波长：282nm；
柱温：40℃；
进样体积：5.0μL。
测试步骤如下：
(1)准确称取N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼原药0.0499g，置于50mL容量瓶中，加40mL无水乙醇，振荡溶解后，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液7。
取5.0μL供试品溶液7注入高效液相色谱仪，在上述条件下进行色谱分离分析，记录色谱图，结果见图7。
(2)对比分析图1-图4和图7，保留时间为15.813min、18.763min、29.764min和35.597min的色谱峰分别为SS构型、RR构型、SR构型以及RS构型的色谱峰，此时基线分离效果较好，但分离时间略长于实施例2。
实施例5
色谱分析条件如下：
流动相：体积比为85∶15∶0.1的正己烷、无水乙醇、二乙胺混合体系；
流速：0.5mL/min；
检测波长：282nm；
柱温：40℃；
进样体积：5.0μL。
测试步骤如下：
(1)准确称取N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼原药0.0503g，置于50mL容量瓶中，加40mL无水乙醇，振荡溶解后，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液8。
取5.0μL供试品溶液8注入高效液相色谱仪，在上述条件下进行色谱分离分析，记录色谱图，结果见图8。
(2)对比分析图1-图4和图8，保留时间为13.363min、15.063min、23.913min和28.151min的色谱峰分别为SS构型、RR构型、SR构型以及RS构型的色谱峰，此时可以达到良好的基线分离，但分离时间长于实施例2。
实施例6
色谱分析条件如下：
流动相：体积比为85∶15∶0.1的正己烷、无水乙醇、二乙胺混合体系；
流速：2.0mL/min；
检测波长：282nm；
柱温：40℃；
进样体积：5.0μL。
测试步骤如下：
(1)准确称取N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼原药0.0503g，置于50mL容量瓶中，加40mL无水乙醇，振荡溶解后，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液9。
取5.0μL供试品溶液9注入高效液相色谱仪，在上述条件下进行色谱分离分析，记录色谱图，结果见图9。
(2)对比分析图1-图4和图9，保留时间为7.306min、8.271min、13.079min和13.988min的色谱峰分别为SS构型、RR构型、SR构型以及RS构型的色谱峰，此时色谱分析时间缩减，基线分离效果略差于实施例2。
实施例7
色谱分析条件如下：
流动相：体积比为85∶15∶0.1的正己烷、无水乙醇、二乙胺混合体系；
流速：1.0mL/min；
检测波长：282nm；
柱温：25℃；
进样体积：5.0μL。
测试步骤如下：
(1)准确称取N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼原药0.0522g，置于50mL容量瓶中，加40mL无水乙醇，振荡溶解后，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液10。
取5.0μL供试品溶液10注入高效液相色谱仪，在上述条件下进行色谱分离分析，记录色谱图，结果见图10。
(2)对比分析图1-图4和图10，保留时间为10.629min、11.921min、18.885min和22.338min的色谱峰分别为SS构型、RR构型、SR构型以及RS构型的色谱峰，此时可以达到良好的基线分离。
实施例8
色谱分析条件如下：
流动相：体积比为85∶15∶0.1的正己烷、无水乙醇、二乙胺混合体系；
流速：1.0mL/min；
检测波长：282nm；
柱温：45℃；
进样体积：5.0μL。
测试步骤如下：
(1)准确称取N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼原药0.0522g，置于50mL容量瓶中，加40mL无水乙醇，振荡溶解后，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液11。
取5.0μL供试品溶液11注入高效液相色谱仪，在上述条件下进行色谱分离分析，记录色谱图，结果见图11。
(2)对比分析图1-图4和图11，保留时间为8.459min、9.496min、14.576min和17.594min的色谱峰分别为SS构型、RR构型、SR构型以及RS构型的色谱峰，此时可以达到良好的基线分离。
实施例9
色谱分析条件如下：
流动相：体积比为85∶15∶0.1的正己烷、无水乙醇、二乙胺混合体系；
流速：1.0mL/min；
检测波长：260nm；
柱温：40℃；
进样体积：10.0μL。
测试步骤如下：
(1)准确称取N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼原药0.0552g，置于50mL容量瓶中，加40mL无水乙醇，振荡溶解后，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液12。
取5.0μL供试品溶液12注入高效液相色谱仪，在上述条件下进行色谱分离分析，记录色谱图，结果见图12。
(2)对比分析图1-图4和图12，保留时间为9.580min、10.421min、16.129min和19.813min的色谱峰分别为SS构型、RR构型、SR构型以及RS构型的色谱峰，此时可以达到良好的基线分离。
对比例1
色谱分析条件如下：
流动相：体积比为85∶15∶0.1的正己烷、异丙醇、二乙胺混合体系；
流速：1.0mL/min；
检测波长：282nm；
柱温：40℃；
进样体积：5.0μL。
测试步骤如下：
(1)准确称取N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼原药0.0526g，置于50mL容量瓶中，加40mL无水乙醇，振荡溶解后，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液13。
取5.0μL供试品溶液13注入高效液相色谱仪，在上述条件下进行色谱分离分析，记录色谱图，结果见图13。
(2)对比分析图1-图4和图13，N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼四种手性异构体只出现两个色谱峰，说明有机改性剂更换为异丙醇后，四种手性异构体的分离度下降，且峰型变差，不利于N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼四种手性异构体的分离。
对比例2
色谱分析条件如下：
流动相：体积比为85∶15∶0.15的正己烷、正丙醇、二乙胺混合体系；
流速：1.0mL/min；
检测波长：282nm；
柱温：40℃；
进样体积：5.0μL。
测试步骤如下：
(1)准确称取N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼原药0.0531g，置于50mL容量瓶中，加40mL无水乙醇，振荡溶解后，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液14。
取5.0μL供试品溶液14注入高效液相色谱仪，在上述条件下进行色谱分离分析，记录色谱图，结果见图14。
(2)对比分析图1-图4和图14，RS异构体与SR异构体相较于实施例2-9中分离度变差，说明有机改性剂更换为正丙醇后，SR构型与RS构型、SS构型与RR构型分离度下降，且峰型变差，不利于N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼四种手性异构体的分离。
由以上实施例及对比例可以看出，流动相的选择对N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼四种手性异构体的分离至关重要，本发明所提供的氯吲哚酰肼手性异构体的分离分析方法准确性高，专属性强，可操作性好，可以广泛的应用到氯吲哚酰肼手性异构体的分析检测中。
尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种氯吲哚酰肼手性异构体的分离分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)流动相配制：将正己烷、无水乙醇和二乙胺混合，得到流动相；
(2)供试品溶液的配制：用无水乙醇作溶剂溶解待测N’-(4-氯苯亚甲基)-1-甲基-2,3,4,9-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚-3-甲酰肼样品，得到供试品溶液；
(3)检测：采用高效液相色谱法对样品进行检测，检测波长为260-300nm，色谱柱为纤维素类手性色谱柱，流速为0.5-2mL/min，色谱柱温度为25-45℃。
2.如权利要求1所述的分离分析方法，其特征在于，步骤(1)正己烷、无水乙醇和二乙胺的体积比为(80-90)：(10-20)：(0.05-0.2)。
3.如权利要求1所述的分离分析方法，其特征在于，步骤(1)正己烷、无水乙醇和二乙胺的体积比为85∶15∶0.1。
4.如权利要求1所述的分离分析方法，其特征在于，步骤(2)配制的供试品溶液的浓度为0.4-10mg/mL。
5.如权利要求1所述的分离分析方法，其特征在于，步骤(3)供试品溶液的进样量为0.1-10μL。
6.如权利要求1所述的分离分析方法，其特征在于，步骤(3)检测波长为282nm，色谱柱流速为1.0mL/min，色谱柱温度为40℃，进样量5.0μL。
7.如权利要求1所述的分离分析方法，其特征在于，步骤(3)色谱柱型号为LuxR 5μmi-Cellulose-5。
8.如权利要求7所述的分离分析方法，其特征在于，步骤(3)色谱柱规格为250mm×4.6mm。
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