CN115505023A - 一种米曲霉菌来源的吲哚二萜衍生物、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种米曲霉菌来源的吲哚二萜衍生物、制备方法及其应用。所述吲哚二萜衍生物能有效抑制恶性疟原虫氯喹敏感株P.f.3D7，表明该化合物具有优异的疟原虫抑制活性，适用于制备成为抗疟疾药物，为疟疾的治疗提供了一种新的药物材料来源。

Description

一种米曲霉菌来源的吲哚二萜衍生物、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于微生物制药技术领域。更具体地，涉及一种米曲霉菌来源的吲哚二萜衍生物、制备方法及其应用。

背景技术

疟疾是疟原虫感染导致的一种寄生虫病，寄生于人体的疟原虫共有四种，即间日疟原虫、三日疟原虫、恶性疟原虫和卵形疟原虫，在我国主要是间日疟原虫和恶性疟原虫，其它两种少见。疟疾主要表现为周期性寒颤、发热和出汗热退，长期多次发作后会引起贫血和脾肿大，传染源为疟疾患者和疟疾带虫者，传播途径主要包括按蚊的叮咬、血液传播和母婴传播等。疟疾的病死率因感染的虫种不同而差异较大，间日疟、三日疟和卵形疟病死率很低，而恶性疟的病死率较高。婴幼儿感染、延误诊治和耐多种抗疟药感染的病死率较高，且可出现偏瘫、失语、斜视、失明和精神异常等多种后遗症，因此，疟疾的治疗，尤其是恶性疟的治疗，显得尤为重要。

目前常用的抗疟疾药物主要为青蒿素类药物和喹啉类药物，但逐渐产生的耐药性限制了疟疾治疗的进一步发展，因此，寻找更多种类的抗疟疾药物对于疟疾患者而言具有相当的必要性。

吲哚二萜类化合物是分自内生真菌的一类具环状二萜骨架和吲哚核的次生代谢产物，具有显著的抑菌、抗肿瘤、抗病毒等多种生物活性，如现有技术公开了一种具有抗感染以及抗结核活性的吲哚二萜类化合物，但目前尚未见具有抗疟疾活性的吲哚二萜类化合物。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种米曲霉菌来源的吲哚二萜衍生物，以发挥优异的抗疟疾作用。

本发明的第二目的是提供一株米曲霉菌(Aspergillus oryzae)AstCB菌株。

本发明的第三目的是提供上述吲哚二萜衍生物的制备方法。

本发明的第四目的是提供上述吲哚二萜衍生物在制备抗疟疾药物中的应用。

本发明的第五目的是提供上述米曲霉菌AstCB菌株的发酵液在制备抗疟疾药物中的应用。

本发明的第六目的是提供一种抗疟疾药物。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种米曲霉菌来源的吲哚二萜衍生物，具有如下式(Ⅰ)所示的化学结构：

其中，R₁为C(CH₃)₂CH＝CH₂，R₂为H；

或者R₁为H，R₂为C(CH₃)₂CH＝CH₂。

本发明的吲哚二萜衍生物具有6/5/5/6/6/6的基本骨架，虽与传统抗疟疾药物(如青蒿素类、喹啉类等)有着极大的差别，但仍能有效抑制恶性疟原虫氯喹敏感株P.f.3D7，表明该化合物具有优异的疟原虫抑制活性，适用于制备成为抗疟疾药物，为疟疾的治疗提供了一种新的药物材料来源。

本发明还提供了一株米曲霉菌(Aspergillus oryzae)AstCB菌株，所述米曲霉菌AstCB菌株于2022年4月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼），保藏编号为GDMCC No：62412。

此外，本发明还提供了上述吲哚二萜衍生物的制备方法，由上述米曲霉菌AstCB菌株发酵即得。

优选地，所述制备方法包括如下步骤：

S1.将所述米曲霉菌AstCB菌株接入种子培养基中进行培养，得到种子培养液；

S2.将S1所得种子培养液接入发酵培养基中进行培养，得到发酵产物；

S3.将S2所得发酵产物依次进行过滤、提取、浓缩、硅胶柱层析、纯化，即得到所述吲哚二萜衍生物。

优选地，S1所述种子培养基中，葡萄糖与马铃薯汁的质量体积比为8～32g： 250～800mL。

进一步优选地，马铃薯汁的制备为：向马铃薯中加水、加热至沸腾，熬制成马铃薯汁；其中，马铃薯与水的质量比为1.8～2.2：3，最优选为2：3。

优选地，S1所述培养为摇床培养，具体为在20～30℃、80～300rpm下摇床培养48～200h。

优选地，S2所述发酵培养基为：每0.5L～1.5L水中含有糖类10～50g、可溶性淀粉10～50g、海盐1.5～50g、蛋白胨2～20g。

进一步优选地，所述糖类包括但不限于葡萄糖。

进一步优选地，所述可溶性淀粉包括但不限于马铃薯淀粉。

优选地，S2所述培养为静置培养，具体为在20～30℃下静置培养20～60 天。

优选地，S3所述提取为用甲醇提取。

优选地，S3所述硅胶柱层析：以石油醚-乙酸乙酯为流动相进行梯度洗脱。

进一步优选地，所述流动相中，石油醚在洗脱过程中体积分数变化为： 70％→60％→50％→40％→30％→20％→10％→0％；乙酸乙酯在洗脱过程中体积分数变化为：30％→40％→50％→60％→70％→80％→90％→100％。

其中，每个梯度的洗脱液使用的体积为样品体积的29～31倍，最优选为30 倍。

优选地，S3所述纯化为柱层析纯化或高效液相色谱纯化。

本发明所述吲哚二萜衍生物具有疟原虫抑制活性，能用于制备抗疟疾药物，为疟疾的治疗提供了一种新的药物材料来源，因此，上述吲哚二萜衍生物在制备抗疟疾药物中的应用应在本发明的保护范围之内。且所述米曲霉菌AstCB菌株的发酵液因可发酵得到上述吲哚二萜衍生物，故其在制备抗疟疾药物中的应用，以及含有上述吲哚二萜衍生物或上述米曲霉菌AstCB菌株的发酵液的抗疟疾药物也应在本发明的保护范围之内。

优选地，所述抗疟疾为抗疟原虫。

进一步优选地，所述疟原虫为恶性疟原虫氯喹敏感株。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明的吲哚二萜衍生物能有效抑制恶性疟原虫氯喹敏感株P.f.3D7，表明该化合物具有优异的疟原虫抑制活性，适用于制备成为抗疟疾药物，为疟疾的治疗提供了一种新的药物材料来源。

2.本发明所用模式真菌(A.oryzae)代谢产物背景干净，且异源表达的基因较为单一，因此Aspergillus oryzae AstCB可在模式真菌内表达，代谢产物提取的方法简单，使得吲哚二萜衍生物来源丰富、成本低廉。

附图说明

图1为实施例1的电泳图。

图2为吲哚二萜衍生物1的单晶结构。

图3为吲哚二萜衍生物1和吲哚二萜衍生物2的实测ECD比较图，其中， Expt.ECDof 1代表吲哚二萜衍生物1实测ECD比较结果，Expt.ECD of 2代表吲哚二萜衍生物2实测ECD比较结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1米曲霉菌(Aspergillus oryzae)AstCB菌株的获得

S1.在马铃薯葡萄糖肉汤中培养Talaromyces wortmannii ATCC 26942(购自 美国典型培养物保藏中心ATCC)，从T.wortmannii ATCC 26942的基因组DNA 中扩增获得astB(扩增所用引物为Infusion-astB-F： TCGAGCTCGGTACCCATGATCGACTCTTTGTCGTT，Infusion-astB-R： CTACTACAGATCCCCCACACAATTACTCAGTGACT)和astC(扩增所用引物 为astC-EcoRI-F：CCGGAATTCATGGCTTCTCTAGAGGTATT；astC-EcoRI-R： CCGGAATTCAAGTCTACTTCACATGCAAC)，按试剂说明书配制反应体系， 用T4 DNA连接酶或

II One Step Cloning Kit(Vazyme，南京，中国) 将astB和astC插入线性化载体pTAex3(宝生物工程(大连)有限公司)，以分别 产生pTAex3-astB和pTAex3-astC，再将包含从重组pTAex3质粒(pTAex3-astB和pTAex3-astC)扩增得到的启动子和终止子的DNA片段克隆到XbaI消化的 pAdeA载体(宝生物工程(大连)有限公司)中，得到重组质粒pAdeA-astB；引物 为Inf-pAdeA-Parm-F：GCAGGTCGACTCTAGACGACTCCAATCTTCAAGAGC， Inf-pTAex3-Tamy-R1：AACGCGCTCGCGAGCAAGTACCATACAGTACCGCG； Inf-pTAex3-Parm-F1：GCTCGCGAGCGCGTTCCACTGCATCATCAGTCTAG， Inf-pAdeA-Tamy-R：TAGTAGATCCTCTAGAGTAAGATACATGAGCTTCGG。

S2.将100μL亲本菌株【四重营养缺陷型宿主A.oryzae NSAR1(niaD-、 sC-、ΔargB、adeA-)，来自暨南大学】的孢子悬浮液接种在10mL DPY培养基 (2wt％糊精、1wt％多聚蛋白胨、0.5wt％酵母提取物、0.05wt％MgSO₄·7H₂O、 0.5wt％KH₂PO₄)中，于28℃培养箱中培养2天后，将培养液转移到100mL新的DPY培养基中，于28℃培养箱中生长1天后收获菌丝体，并使用Yatalase酶系统(1wt％Yatalase，0.6M(NH₄)₂SO₄，50mM马来酸，pH 5.5)在30℃下去除细胞壁3h，收集获得的原生质体并用溶液2(1.2M山梨糖醇、50mM CaCl₂·2H₂O、 35mMNaCl、10mM Tris-HCl，pH 7.5)洗涤后，再用溶液2调节至原生质体的浓度为1.0×10⁷个/mL，得到原生质体悬浮液。

S3.将10μg重组质粒(pAdeA-astB)和200μL原生质体悬浮液轻轻混合并置于冰上30min，再加入1.35mL PEG溶液(60wt％PEG4000，50mM CaCl₂·2H₂O，10mM Tris-HCl，pH7.5)，25℃下放置20min后，加入7mL溶液2，并以1500rpm的转速离心10min，离心所得沉淀在200μL溶液2中重悬，铺于选择性培养基(0.2wt％NH₄Cl、0.1wt％(NH₄)₂SO₄、0.05wt％KCl、0.05wt％NaCl、0.1wt％KH₂PO₄、0.05wt％MgSO₄·7H₂O、0.002wt％FeSO₄·7H₂O、 2wt％葡萄糖、1.2M山梨糖醇、1wt％琼脂、2wt％糊精、1wt％多聚蛋白胨、 0.5wt％酵母提取物)上，铺完后再覆盖一层选择性培养基，在28℃孵育4天后，获得转化子Aspergillus oryzae AstCB并通过PCR确认(电泳图如图1所示，其中，泳道1：Marker；泳道2：从米曲霉宿主中扩增出的astB；泳道3：从pAdeA-astB 扩增出的astB；泳道4：从含有pTAex3-astC和pAdeA-astB的转化子中扩增出的 astB)，其中，PCR所用引物为astB-F：ATGATCGACTCTTTGTCGTT，astB-R：TCAGTGACTTTGATCCGGAT，astC-F：ATGGCTTCTCTAGAGGTATT，astC-R：AAGTCTACTTCACATGCAAC。

S4.米曲霉菌(Aspergillus oryzae)AstCB菌株于2022年4月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)（地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼），保藏编号为GDMCC No：62412，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2米曲霉菌来源的吲哚二萜衍生物的获得

S1.种子培养

S1-1.配制种子培养基：将马铃薯汁1500mL(将质量比为2：3的马铃薯和水加热至沸腾，熬制成马铃薯汁)、葡萄糖60g混合，平均分装于5个500mL 锥形瓶，121℃下灭菌30min；

S1-2.将米曲霉菌AstCB菌株接入种子培养基中，在28℃、200rpm下摇床培养72h，得到种子培养液；

S2.发酵培养

S2-1.配制发酵培养基：将马铃薯淀粉20g、海盐20g、葡萄糖20g、蛋白胨 10g溶于自来水1L中，121℃下灭菌30min；

S2-2.将S1所得种子培养液10mL接入装有发酵培养基的锥形瓶中，在25℃下静置培养30天，得到发酵产物；

S3.产物提纯

将S2所得发酵产物过滤得到菌体，菌体用甲醇浸泡3次(每次24h)后，在 45℃下减压浓缩得到甲醇粗提物，将甲醇粗提物经硅胶柱层析(以石油醚-乙酸乙酯为流动相进行梯度洗脱，所述流动相中，石油醚在洗脱过程中体积分数变化为：70％→60％→50％→40％→30％→20％→10％→0％；乙酸乙酯在洗脱过程中体积分数变化为：30％→40％→50％→60％→70％→80％→90％→100％；其中，每个梯度的洗脱液使用的体积为样品体积的30倍)进行分离，收集洗脱液，分成8组分，将第4～6组分合并，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析(以体积比为1：1的甲醇和二氯甲烷为洗脱剂进行洗脱)，再以OD-H正相高效液相色谱技术进行纯化，即得到吲哚二萜衍生物1和吲哚二萜衍生物2。

实施例3吲哚二萜衍生物1和吲哚二萜衍生物2的结构测定

综合核磁共振波谱解析、质谱信息、单晶测试以及ECD比较对吲哚二萜衍生物1和吲哚二萜衍生物2分别进行结构测试解析，得到的结果为：

(1)吲哚二萜衍生物1：C₃₂H₄₁NO₃，HRESI-MS：m/z 488.3180[M+H]⁺(理论值488.3159)。

吲哚二萜衍生物1的NMR数据如表1所示，单晶结构如图2所示。

表1吲哚二萜衍生物1的NMR数据(100MHz/400MHz，TMS，ppm)

(2)吲哚二萜衍生物2：C₃₂H₄₁NO₃，HRESI-MS：m/z 488.3152[M+H]⁺(理论值488.3159)。

吲哚二萜衍生物2的NMR数据如表2所示。

表2吲哚二萜衍生物2的NMR数据(100MHz/400MHz，TMS，ppm)

吲哚二萜衍生物1和吲哚二萜衍生物2的实测ECD比较如图3所示。

因此，基于结构测试的结果，可以确定吲哚二萜衍生物1和吲哚二萜衍生物 2的结构式如下式(Ⅰ)所示：

其中，吲哚二萜衍生物1：R₁为C(CH₃)₂CH＝CH₂，R₂为H；

吲哚二萜衍生物2：R₁为H，R₂为C(CH₃)₂CH＝CH₂。

实施例4吲哚二萜衍生物的抗疟疾活性

首先将恶性疟原虫氯喹敏感株P.f.3D7(来自广东省科学院动物研究所)复苏培养，传代后进行镜检，测定红细胞内恶性疟原虫的感染率，将感染率在3％以上且大部分疟原虫处于环状体时期的进行同步化。

计算铺板所需虫血的总体积，按照加入的虫血标准为0.5％感染率，2％红细胞压积(红细胞体积比)，100μL/孔培养体系配制，其中药物与虫血比例为1： 100v/v，DMSO占终体积的0.1％。

给药组1：将吲哚二萜衍生物1(用DMSO溶解和稀释使得加入96孔板后的终浓度分别为200、150、100、50、25、10、7.5、5、2.5、0.5、0.05μM)，于37℃培养箱(3％CO₂、3％O₂和94％N₂)培养72h后，将检测液(每毫升Lysis Buffer中加入0.2μL Sybrgreen1)倒入加药槽中，从培养箱中取出96孔板，用单道8孔移液排枪按100μL/孔的体积加入检测液，37℃下培养，待红细胞裂解后，置于酶标仪(激发光波长为485nM，发射光波长为535nM)上检测OD值，按公式

计算抑制率，再利用graphpad软件拟合化合物的EC₅₀曲线，判断化合物的抗恶性疟原虫氯喹敏感株活性，结果如表3所示。

给药组2：将给药组1中的吲哚二萜衍生物1替换为吲哚二萜衍生物2。

阳性对照组1：将给药组1中的吲哚二萜衍生物1替换为青蒿素。

阳性对照组2：将给药组1中的吲哚二萜衍生物1替换为氯喹。

阴性对照组：将给药组1中的吲哚二萜衍生物1替换为DMSO。

空白组：将给药组1中的吲哚二萜衍生物1替换为虫血。

给药组1、给药组2、阳性对照组1、阳性对照组2、阴性对照组、空白组均设置3个平行样。

表3抗恶性疟原虫氯喹敏感株活性结果

组别	P.f.3D7(EC<sub>50</sub>)
		给药组1	0.84μM
给药组2	1.26μM
		阳性对照组1	13.41nM
阳性对照组2	10.56nM
		阴性对照组	-
空白组	-

由表3可知，吲哚二萜衍生物1和吲哚二萜衍生物2的EC₅₀在2μM以内，能有效抑制恶性疟原虫氯喹敏感株P.f.3D7，表明本发明所述吲哚二萜衍生物具有优异的疟原虫抑制活性，适用于制备成为抗疟疾药物，为疟疾的治疗提供了一种新的药物材料来源。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种米曲霉菌来源的吲哚二萜衍生物，其特征在于，所述吲哚二萜衍生物具有如下式(Ⅰ)所示的化学结构：

其中，R₁为C(CH₃)₂CH＝CH₂，R₂为H；

或者R₁为H，R₂为C(CH₃)₂CH＝CH₂。

2.一株米曲霉菌(Aspergillus oryzae)AstCB菌株，其特征在于，所述米曲霉菌AstCB菌株于2022年4月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62412。

3.权利要求1所述吲哚二萜衍生物的制备方法，其特征在于，由权利要求2所述米曲霉菌AstCB菌株发酵即得。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.将权利要求2所述米曲霉菌AstCB菌株接入种子培养基中进行培养，得到种子培养液；

S2.将S1所得种子培养液接入发酵培养基中进行培养，得到发酵产物；

S3.将S2所得发酵产物依次进行过滤、提取、浓缩、硅胶柱层析、纯化，即得到所述吲哚二萜衍生物。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，S1所述种子培养基中，葡萄糖与马铃薯汁的质量体积比为8～32g：250～800mL。

6.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，S2所述发酵培养基为：每0.5L～1.5L水中含有糖类10～50g、可溶性淀粉10～50g、海盐1.5～50g、蛋白胨2～20g。

7.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，S3所述硅胶柱层析：以石油醚和乙酸乙酯为流动相进行梯度洗脱。

8.权利要求1所述吲哚二萜衍生物在制备抗疟疾药物中的应用。

9.权利要求2所述米曲霉菌AstCB菌株的发酵液在制备抗疟疾药物中的应用。

10.一种抗疟疾药物，其特征在于，含有权利要求1所述吲哚二萜衍生物或权利要求2所述米曲霉菌AstCB菌株的发酵液。

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