CN114478685A - 一种吲哚二萜类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种吲哚二萜类化合物及其制备方法和应用。所述吲哚二萜类化合物的结构如式(1)所示。本发明的吲哚二萜类化合物是一类新化合物，其分离自微生物的发酵产物，且具有良好的抗癌活性。同时制备所述化合物的方法简单且重复性好，因此能够较好地应用在抗癌药物的制备中。

Description

一种吲哚二萜类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于天然药物技术领域，具体涉及一种吲哚二萜类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

吲哚二萜化合物是分自内生真菌的一类具环状二萜骨架和吲哚核的次生代谢产物，包括(paxilline-type)帕西林型吲哚二萜和(non-paxilline-type)非帕西林型吲哚二萜。该类化合物主要从青霉属、曲霉属、多节孢属、翘孢霉属、镰刀菌属、麦角菌属等真菌的次生代谢产物中获得。目前已从真菌的次生代谢产物中发现了100多个吲哚二萜类化合物，如可用于药理学上的高传导性钙激活钾通道的选择性阻断剂paxilline；导致动物神经紊乱的黄曲霉震颤毒素aflatrem；吲哚二萜类化合物也具有显著的抑菌、抗肿瘤、抗病毒、对昆虫的毒活性等多种生物活性。同时，对部分具备活性的吲哚二萜类化合物paspalinine、paspaline、nodulisporic acids等完成了化学合成。综上所述，吲哚二萜类化合物因其新颖、复杂的结构和显著的生物活性而日益受到广泛关注。

天然产物是筛选新型活性药物先导化合物的重要源泉之一。药用植物内生真菌与宿主长期共存，建立了一种特殊的相互关系，对植物的次级代谢产物的形成有重要影响作用，甚至能产生与宿主植物相同或相似的活性成分。其代谢产物种类不仅涵盖多种结构类型，且部分化学骨架独特且复杂，如萜类、聚酮类、生物碱类、细胞松驰素类、肽类、黄酮及类黄酮、酚类、多糖、香豆素类、萘醌类等，其中许多化合物具有显著的生物活性，如抗癌、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗乙酰胆碱酯酶、抗炎、调节血糖及免疫功能等活性。药用成分一般分布在植株的某一部分或某些组织中，但由于药用植物资源有限，加之需求量大导致的过分采挖，使得多数野生药用植物资源处于濒临灭绝的边缘。基于此，利用微生物生长繁殖快、易于大规模培养、生长周期短、造成污染少和代谢产物结构、生物活性的多样等优点使其成为寻找新活性天然产物的重要途径。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种新的吲哚二萜类化合物，该化合物分离自内生真菌Nb-19的发酵产物，且具有良好的抗癌活性。

为此，本发明第一方面提供了一种吲哚二萜类化合物，其结构如式(1)所示：

在本发明的一些实施方式中，所述吲哚二萜类化合物分离自微生物的发酵产物。

在本发明的另一些实施方式中，所述微生物为青霉菌Nb-19，其保藏编号为CGMCCNo.40009。

本发明中，内生真菌青霉菌(Penicillium sp.)Nb-19分自新鲜健康南板蓝根的叶片，南板蓝根为一年生栽培品，2019年1月采自云南省红河州金平县。结合分子生物学与形态学对菌株进行种属鉴定，Blast搜索结果显示该菌株序列与Penicillium Paxilli(登录号FJ884126)相似度达90％。

本发明第二方面提供了一种制备如本发明第一方面所述的吲哚二萜类化合物的方法，其包括以下步骤：

S1，将青霉菌Nb-19菌株活化后接种于培养基中进行发酵，获得发酵产物；

S2，采用有机溶剂对所述发酵产物进行浸提，获得粗浸膏；

S3，对所述粗浸膏进行色谱分离后，获得所述吲哚二萜类化合物。

在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，所述活化的方式为：将所述青霉菌Nb-19菌株接种于PDA固体斜面培养基上，置于23～25℃(如23℃)的恒温培养箱中培养3～4天。

在本发明的另一些实施方式中，步骤S1中，所述发酵培养基为大米培养基。

本发明中，所述大米培养基包括大米和水。所述大米培养基的制备方法可以为：80g大米中加入100mL水，于121℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌30min。

在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，所述发酵的条件为：温度为25～28℃，时间为30～40天，恒温静置培养。

在本发明的一些具体实施方式中，步骤S1中，所述发酵的条件为：温度为28℃，时间为30天，恒温静置培养。

在本发明的一些实施方式中，步骤S2中，所述有机溶剂选自石油醚、乙酸乙酯和甲醇中的至少一种。

在本发明的一些具体实施方式中，所述发酵产物依次分别采用石油醚、乙酸乙酯和甲醇浸泡超声进行浸提，浸提物合并后获得所述粗浸膏。

在本发明的另一些具体实施方式中，所述浸提可以重复进行2～4次，优选为3次。

在本发明的一些具体实施方式中，所述有机溶剂的用量可以为发酵产物体积的1～5倍。

在本发明的一些实施方式中，步骤S3中，所述色谱包括硅胶柱色谱和半制备液相色谱。

在本发明的一些具体实施方式中，所述步骤S3具体可以包括以下步骤：

(1)用甲醇将所述粗浸膏溶解后，采用硅胶柱色谱进行梯度洗脱；流动相以二氯甲烷-甲醇的体积比分别为100:1，80:1，60:1，40:1，20:1，10:1，5:1，2:1进行柱层析，经TLC板合并，得到9个组分，即Fr.1～Fr.9；

(2)采用硅胶柱色谱对组分Fr.5进行梯度洗脱；流动相以二氯甲烷-甲醇的体积比分别为60:1，40:1，20:1，10:1，5:1进行柱层析，得到4个组分，即Fr.5-1～Fr.5-4；

(3)采用半制备液相色谱对组分Fr.5-2进行进一步的纯化；以流动相为体积比20:80的乙腈/水，流速为3mL/min，收集保留时间为11.5min的组分，得到所述的吲哚二萜类化合物。

本发明第三方面提供了一种如本发明第一方面所述的吲哚二萜类化合物或其药学上可接受的盐，或者第二方面所述方法制备的吲哚二萜类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗癌药物中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述抗癌药物还包括含药学上可接受的载体或赋形剂。

在本发明的另一些实施方式中，所述抗癌药物所针对的癌细胞系选自HepG2、SW480和H22中的至少一种。

本发明的有益效果为：本发明的吲哚二萜类化合物是一类新化合物，其分离自微生物的发酵产物，且具有良好的抗癌活性。同时制备所述化合物的方法简单且重复性好，因此能够较好地应用在抗癌药物的制备中。

附图说明

下面将结合附图对本发明作进一步说明。

图1为式(1)所述的吲哚二萜类化合物的实验和计算拟合的ECD谱。

图2为式(1)所述的吲哚二萜类化合物的¹H-NMR谱(500MHz,CDCl₃)。

图3为式(1)所述的吲哚二萜类化合物的¹³C-NMR谱(125MHz,CDCl₃)。

图4为式(1)所述的吲哚二萜类化合物的DEPT谱(CDCl₃)。

图5为式(1)所述的吲哚二萜类化合物的¹H-¹H COSY谱(CDCl₃)。

图6为式(1)所述的吲哚二萜类化合物的HSQC谱(CDCl₃)。

图7为式(1)所述的吲哚二萜类化合物的HMBC谱(CDCl₃)。

图8为式(1)所述的吲哚二萜类化合物的ROESY谱(CDCl₃)。

图9为式(1)所述的吲哚二萜类化合物的HR-ESI MS谱。

图10为式(1)所述的吲哚二萜类化合物的ECD谱图。

图11为式(1)所述的吲哚二萜类化合物的UV谱图。

菌种保藏

分类命名：青霉菌(Penicillium sp.)；菌株编号：Nb-19

保藏机构：中国科学院微生物研究所

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2021.12.16

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.40009

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。

下述实施例中采用的试剂耗材和仪器如下所示：

(1)试剂耗材：甲醇、二氯甲烷、石油醚、无水乙醇、二甲基亚砜、乙酸乙酯均为分析纯，购于昆明仁科商贸有限公司；色谱级甲醇和乙腈、蔗糖、琼脂粉、茴香醛、卡那霉素、氨苄青霉素、链霉素、GF₂₅₄硅胶板、RMI1640完全培养基、胎牛血清、DMEM培养基、真菌基因组DNA快速抽提试剂盒、岛津C₁₈反相制备柱(5μm；10×250mm)均购于上海泰坦科技股份有限公司；CCK-8试剂购于上海碧云天生物科技有限公司；小鼠肝癌细胞H22细胞、人肝癌细胞HepG2和人结肠癌细胞SW480均购于武汉普诺赛生命科技有限公司；实验室用水均为超纯水。

(2)仪器：Bruker AM-500型核磁共振仪(德国布鲁克公司)；Agilent G6230 TOF质谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；Jasco P-1020全自动数字旋光仪(日本分光株式会社)；岛津UV-2401PC紫外分光光度计(日本岛津有限公司)；Chirascan全自动圆二色谱仪(英国应用光物理公司)；IRAffinity-1S傅里叶红外光谱仪(日本岛津有限公司)；半制备高效液相色谱仪(2535四元梯度模块-2707自动进样器-2998光电二极管阵列检测器)(日本岛津有限公司)；SpectraMax i3多功能酶标仪(美国美谷分子仪器有限公司)；SW-CJ-1FD超净工作台(上海新苗医疗器械制造有限公司)；MLS-37811L-PC高压蒸汽灭菌锅(松下健康医疗器械上海有限公司)；HZP-92恒温培养摇床、HDPN-II-150电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械有限公司)；R-210旋转蒸发仪(德国步琦有限公司)。

实施例1：式(1)所示的吲哚二萜类化合物的制备

(1)菌株Penicillium sp.Nb-19的发酵培养：将菌株接种到PDA固体斜面培养基上，置于23℃恒温培养箱中培养3～4天。取适量已活化好的菌株Penicillium sp.Nb-19接种到装有80g培养基(大米培养基：80g大米中加入100mL水，于121℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌30min)的500mL锥形瓶中，在28℃条件下静置培养30天，获得发酵产物。

(2)浸提：将发酵产物依次分别用石油醚、乙酸乙酯和甲醇三种有机溶剂浸泡超声20min进行浸提，其中有机溶剂的用量为发酵产物体积的1.5倍，重复三次。分别将过滤液合并后减压浓缩，得三份粗提物。采用薄层色谱和分析液相对粗提物进行成分分析，成分组成基本一致，将其合并后得粗浸膏，共21g。

(3)分离：用甲醇将粗浸膏溶解后，先经硅胶柱色谱进行梯度洗脱，以二氯甲烷-甲醇的体积比分别为100:1，80:1，60:1，40:1，20:1，10:1，5:1，2:1进行柱层析，经TLC板合并，得到9个组分，即Fr.1～Fr.9。组分Fr.5经硅胶柱色谱进行梯度洗脱，以二氯甲烷-甲醇的体积比分别为60:1，40:1，20:1，10:1，5:1进行柱层析，得到4个组分，即Fr.5-1～Fr.5-4。组分Fr.5-2经半制备液相色谱梯度洗脱25min，以流动相为体积比20:80的乙腈/水，流速为3mL/min，收集保留时间为11.5min的组分，得到所述的吲哚二萜类化合物(3.5mg)，其结构如下所示：

所获得的化合物的理化常数如下：

所得化合物为白色粉末，根据HR-ESIMS m/z 472.2470[M+Na]⁺，计算值为472.2464，确定该化合物的分子式为C₂₈H₃₅NO₄，不饱和度为12。¹³C-NMR谱显示，化合物中存在1个羰基碳、10个季碳、8个次甲基、5个亚甲基和5个甲基(含1个甲氧基)。¹H-NMR谱显示化合物中含有一个甲氧基、一个羟基、一个亚氨基，加上4个特殊的芳香质子信号(δ_H 7.46、δ_H7.33、δ_H 7.12、δ_H 7.10)，表明化合物含有1,2-二取代苯的吲哚部分。进一步通过分析该化合物的二维谱图确定了其平面结构。¹H-NMR(500MHz)和¹³C-NMR(125MHz)数据见表1。

所获得的化合物的实验和计算拟合的ECD谱、¹H-NMR谱、¹³C-NMR谱、DEPT谱、¹H-¹HCOSY谱、HSQC谱、HMBC谱、ROESY谱、HR-ESI MS谱、ECD谱图和UV谱图分别如图1-11所示。

表1

实施例2：式(1)所示的吲哚二萜类化合物对癌细胞的细胞毒活性

小鼠肝癌细胞H22的细胞毒性实验操作如下：H22细胞于在RPMI1640完全培养基中(含有10％的胎牛血清和1％的双抗)悬浮培养，培养条件为37℃，5％CO₂，饱和湿度。取生长状态良好的细胞，1500r/min离心收集细胞，再加入无血清培养基制成细胞悬液。计数细胞密度后稀释为5×10³/mL，接种在96孔板上，每孔50μL，再加入含有式(1)所示的吲哚二萜类化合物的母液使用培养基稀释后每孔加入50μL，使药物终浓度分别为100μM，50μM，25μM，12.5μM，6.25μM和3.12μM，每个浓度设置3个复孔。空白对照孔加入等体积药物赋形剂。药物作用24h后，再每孔加入10μL CCK-8，在37℃下孵育4h，最后用酶标仪测定各孔在450nm波长下的吸光度。

HepG2和SW480细胞使用高糖DMEM培养基培养，取处于对数生长期的肿瘤细胞，加无血清培养基调整细胞浓度为3×10⁵/mL，接种于96孔培养板，每孔200μL。37℃、5％CO₂培养12h，吸出培养基，加入药物，浓度和组别设置同上。药物作用24h后，再每孔加入10μL CCK-8，在37℃下孵育4h，最后用酶标仪测定各孔在450nm波长下的吸光度。

细胞存活率％＝(给药孔吸光度/空白对照孔吸光度)×100％。以细胞存活率与药物浓度对数进行线性回归拟合计算IC₅₀值，结果见表2。

表2

从表2可知，本发明的式(1)所示的吲哚二萜类化合物对小鼠肝癌细胞H22细胞、人肝癌细胞HepG2和人结肠癌细胞SW480均具有较好的细胞毒活性，且制备方法简单，因此能够应用到制备相应癌症的抗癌药物中。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (10)

1.一种吲哚二萜类化合物，其结构如式(1)所示：

2.根据权利要求1所述的吲哚二萜类化合物，其特征在于，所述吲哚二萜类化合物分离自微生物的发酵产物。

3.根据权利要求2所述的吲哚二萜类化合物，其特征在于，所述微生物为青霉菌Nb-19，其保藏编号为CGMCC No.40009。

4.一种制备如权利要求1-3中任意一项所述的吲哚二萜类化合物的方法，其包括以下步骤：

S1，将青霉菌Nb-19菌株活化后接种于培养基中进行发酵，获得发酵产物；

S2，采用有机溶剂对所述发酵产物进行浸提，获得粗浸膏；

S3，对所述粗浸膏进行色谱分离后，获得所述吲哚二萜类化合物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述发酵培养基为大米培养基；和/或所述发酵的条件为：温度为25～28℃，时间为30～40天，恒温静置培养。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述有机溶剂选自石油醚、乙酸乙酯和甲醇中的至少一种。

7.根据权利要求4-6中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤S3中，所述色谱包括硅胶柱色谱和半制备液相色谱。

8.一种如权利要求1-3中任意一项所述的吲哚二萜类化合物或其药学上可接受的盐，或者权利要求4-7中任意一项所述方法制备的吲哚二萜类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗癌药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗癌药物还包括含药学上可接受的载体或赋形剂。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述抗癌药物所针对的癌细胞系选自HepG2、SW480和H22中的至少一种。

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