CN115505022A

CN115505022A - 一种生物碱苷及其应用

Info

Publication number: CN115505022A
Application number: CN202210861175.6A
Authority: CN
Inventors: 张家祺; 张立超; 李玲; 胡诚
Original assignee: SHANGHAI HOSPITAL OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
Current assignee: SHANGHAI HOSPITAL OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
Priority date: 2022-07-22
Filing date: 2022-07-22
Publication date: 2022-12-23
Anticipated expiration: 2042-07-22
Also published as: CN115505022B

Abstract

本发明涉及一种生物碱苷，该生物碱苷对于人非小细胞肺癌细胞和人结直肠癌细胞的生长和转移均具有显著的抑制作用，可以应用于制备治疗或预防非小细胞肺癌和结直肠癌、以及治疗或预防非小细胞肺癌和结直肠癌转移的药物中，为临床治疗或预防非小细胞肺癌和结直肠癌提供了重要的指导意义。

Description

一种生物碱苷及其应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种生物碱苷及其应用。

背景技术

癌症是全球第2大死亡原因，2020年全球新发癌症例数达1929万，严重威胁着人类的生存和健康，转移是肿瘤历经多阶段恶性进展直至终末期后极具特征性改变的病理过程，它涉及一系列序贯发生的细胞恶性生物学改变。肿瘤转移是导致患者综合治疗效果差和生存预后不佳的最主要原因；大量数据表明，约90％以上肿瘤患者系死于远端靶器官转移。现有的治疗方法主要采用手术切除、化疗和放疗，但上述治疗方法均存在着毒副作用强、易复发等局限性。因此探索新的安全有效的抗肿瘤转移药物具有重要的临床意义。

根据最新的全球癌症调查报告显示，肺癌的新发病例占癌症新发病例第二位。非小细胞肺癌作为肺癌中最常见的一种类型，其发现已多处于中晚期，临床治疗主要以放化疗为主，虽已迎来分子靶向治疗及免疫疗法的新时代，但疗效差、复发率高、副作用大以及巨额的费用仍是抗癌进程中巨大的阻力。因此，寻找新药对非小细胞肺癌患者而言意义重大。

结直肠癌是一种恶性肿瘤，最新版全球肿瘤发病情况统计结果显示，其发病率排名第3，病死率位居第2，仅次于肺癌。在我国，结直肠癌的发病率也呈上升趋势，结直肠癌的发生受饮食、年龄、肠道微生物、炎症性肠病等多种因素影响。现阶段，手术切除辅以放化疗和生物疗法仍为结直肠癌主要治疗手段。虽然伴随早期肿瘤发现的增多及肿瘤筛查的推广，结直肠癌患者的5年生存率有所提高，但是仍有25％的患者在确诊时为Ⅳ期，并且有25％～50％的患者在确诊时为早期而后发展为转移性疾病。结直肠癌的一个显著特点是容易发生肝脏转移，据国外文献报告约有15％～25％的患者在检查出结直肠癌时，就已经发生了肝脏转移。转移性结肠癌患者的预后较差，一项基于美国人群的统计数据显示，其5年中位生存率仅有12.5％。因此，寻找治疗结直肠癌转移的药物有着重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物碱苷，该生物碱苷对于人非小细胞肺癌细胞和人结直肠癌细胞的生长及转移均具有显著的抑制作用，可以将其应用在用于预防或治疗非小细胞肺癌和结直肠癌的药物中。

具体的，本发明提供的一种生物碱苷，该生物碱苷的分子式如下式(1)所示：

该生物碱苷是从中药龙葵的生物碱中提取，属于甾体生物碱的胆甾烷衍生物。

经研究发现，所述式(1)中的生物碱苷，其对于人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9、人结直肠癌细胞SW480与DLD-1的生长和转移均具有显著的抑制作用，可以用于制备预防或治疗非小细胞肺癌和结直肠癌的药物中。

具体的，由所述式(1)中的生物碱苷制成的药物中，所述生物碱苷的含量为0.1-99.9％；同时，用于制备药物的原料还包括可药用载体和辅料。

优选的，所述可药用载体包括但不限于：软磷脂、硬脂酸铝、氧化铝、离子交换材料、自乳化药物传递系统、吐温或其他表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钠、氧化钠、锌盐、硅酸镁、饱和脂肪酸部分甘油酯混合物等。

所述辅料包括但不限于：如粘合剂(如微晶纤维素)、填充剂(如淀粉、葡萄糖、无水乳糖和乳糖珠粒)、崩解剂(如交联PVP、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素)、润滑剂(如硬脂酸镁)以及吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、赋形剂、稀释剂、润湿剂等。

基于上述原料，该药物可按本领域的常规方法被制成药剂学上可接受的任意一种剂型，如胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂、注射液、霜剂、贴剂、软膏剂、喷雾剂等；其给药方式包括通过肠道或非肠道或局部途径给药等，例如口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、静脉、尿道、阴道等方式给药。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

经研究发现，本发明的生物碱苷对于人非小细胞肺癌细胞和人结直肠癌细胞的生长和转移均具有显著的抑制作用，可以应用于制备治疗或预防非小细胞肺癌和结直肠癌、以及治疗或预防非小细胞肺癌和结直肠癌转移的药物中，为临床治疗或预防非小细胞肺癌和结直肠癌提供了重要的指导意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为不同浓度的生物碱苷干预人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9后，对细胞活性的抑制作用的实验结果统计图；

图2为不同浓度的生物碱苷干预人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9的后细胞克隆形成的结晶紫染色图，以及不同浓度的生物碱苷干预人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9后，对细胞增殖能力的抑制作用的实验结果统计图；

图3是不同浓度的生物碱苷干预人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9后细胞进行小室迁移与侵袭形成的结晶紫染色图，以及不同浓度的生物碱苷干预人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9后，对细胞的小室迁移能力与侵袭能力的抑制作用的实验结果统计图。

图4是不同浓度的生物碱苷干预人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9后细胞的划痕迁移光镜图，以及不同浓度的生物碱苷干预人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9后，对细胞的划痕迁移活性的抑制作用的实验结果统计图。

图5是不同浓度的生物碱苷干预人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9后，小鼠转移瘤模型的荧光成像图；

图6是不同浓度的生物碱苷干预结人直肠癌细胞SW480与DLD-1后细胞进行小室迁移与侵袭形成的结晶紫染色图，以及不同浓度的生物碱苷干预人结直肠癌细胞SW480与DLD-1后对细胞的小室迁移能力与侵袭能力的抑制作用的实验结果统计图。

图7是不同浓度的生物碱苷干预结人直肠癌细胞SW480与DLD-1后细胞的划痕迁移光镜图，以及不同浓度的生物碱苷干预人结直肠癌细胞SW480与DLD-1后对细胞的划痕迁移活性的抑制作用的实验结果统计图。

具体实施方式

为了使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。

本发明提供的一种生物碱苷，该生物碱苷的分子式如下式(1)所示：

该生物碱苷是从中药龙葵的生物碱中提取，属于甾体生物碱的胆甾烷衍生物。研究发现，该生物碱苷对于引发非小细胞肺癌和结直肠癌的癌细胞的生长及转移均具有显著的抑制作用，具体作用于引发非小细胞肺癌的A549细胞与PC-9细胞、引发结直肠癌的SW480细胞与DLD-1细胞；可以将其应用在用于预防或治疗非小细胞肺癌和结直肠癌的药物中。

具体的，在本实施例中，由所述生物碱苷制备的药物中，生物碱苷的含量为0.1-99.9％；在该药物中，所述生物碱苷是唯一的活性成分，该药物中还含有可药用载体和辅料。

所述可药用载体包括但不限于：软磷脂、硬脂酸铝、氧化铝、离子交换材料、自乳化药物传递系统、吐温或其他表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钠、氧化钠、锌盐、硅酸镁、饱和脂肪酸部分甘油酯混合物等。

该药物可按本领域的常规方法被制成药剂学上可接受的任意一种剂型，如胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂、注射液、霜剂、贴剂、软膏剂、喷雾剂等；其给药方式包括通过肠道或非肠道或局部途径给药等，例如口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、静脉、尿道、阴道等方式给药。

实施例1

生物碱苷(式1)抑制人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9生长活性的实验。

1.1实验材料

人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9购自上海中国科学院生化细胞所。RPMI1640，胎牛血清，青霉素和链霉素购自美国Invitrogen公司。CCK-8试剂购自美国Sigma公司。

1.2实验方法

将人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9分别接种到含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基上，并置于37℃，5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养，用0.25％膜蛋白酶消化传代，取对数生长期的细胞用于实验。

取上述对数生长期的细胞制成细胞悬液(5×10⁴个/ml)，以5×10³个/孔的细胞浓度，将人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9分别接种到96孔板中，进行培养，待细胞贴壁生长状态良好时，弃原培养液，更换含2.5％血清的培养液，并在培养液中加入生物碱苷与细胞共孵24、36和48小时；而后在培养液中加入10μ1CCK8，置于培养箱内反应4小时后弃培养液，在加入100μ1DMSO充分溶解，最后在吸光度450nm处测定吸光值，用所得的吸光值再减去空白的吸光值。

细胞抑制率的计算公式如下：

As：实验孔(含细胞的培养基、CCK-8溶液和药物溶液)

Ac：对照孔(含细胞的培养基和CCK-8溶液)

Ab：空白孔(CCK-8溶液)

抑制率＝[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100％

1.3实验结果

结果如图1所示，分别采用浓度为8,16,32和64μM的生物碱苷处理人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9后，人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9的生物活性显著下降；由此可以得出，本发明的生物碱苷对人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9的生长活性具有显著的抑制作用，且该抑制作用具有浓度依赖性，生物碱苷的浓度越高，其对于人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9的生长活性的抑制作用越好。

实施例2

生物碱苷(式1)抑制人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9增殖能力的实验。

实验2.1

实验材料

人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9购自上海中国科学院生化细胞所。RPMI1640，胎牛血清，青霉素和链霉素购自美国Invitrogen公司。结晶紫试剂购自美国Sigma公司。

2.2实验方法

将人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9分别接种在含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基上，并置于37℃，5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养，用0.25％膜蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，于6孔板培养板中接种1,000个细胞/孔。继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3天进行换液并观察细胞状态；克隆完成后，在显微镜下对细胞进行拍照，然后PBS洗涤1次，每孔加入1mL4％多聚甲醛固定30-60min，PBS洗涤1次；而后每孔加入结晶紫染液1ml，染细胞10-20min；PBS洗涤细胞数次，并于显微镜下计数。

2.3实验结果

结果如图2所示，分别采用16和32μM的生物碱苷处理人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9后，人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9的细胞增殖能力明显下降；由此可以得出，本发明的生物碱苷对人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9的细胞增殖能力具有显著的抑制作用，且该抑制作用具有浓度依赖性，生物碱苷的浓度越高，其对于人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9的细胞增殖能力的抑制作用越好。

实施例3

生物碱苷(式1)抑制人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9小室迁移与侵袭实验。

3.1实验材料

3.2实验方法

将处于对数生长期的人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9(5×10⁴个细胞/孔)接种于小室(8μm孔径)上室中，并加入生物碱苷。上室无血清，下室10％血清。生物碱苷与细胞作用于24小时后，取出小室，弃培养基，用棉签轻轻地擦去上室中未迁移的细胞，将其固定在甲醇中，用结晶紫染色，并于显微镜下计数。

3.3实验结果

结果如图3所示，分别采用16和32μM的生物碱苷处理人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9 24小时后，人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9的小室迁移能力与侵袭能力明显下降；由此可得出，本发明的生物碱苷对人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9的小室迁移能力与侵袭能力具有显著的抑制作用，能够有效的抑制人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9转移扩散；且该抑制作用具有浓度依赖性，生物碱苷的浓度越高，其对于人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9的小室迁移能力与侵袭能力的抑制作用越好。

实施例4

生物碱苷(式1)抑制人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9划痕迁移实验。

4.1实验材料

人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9购自上海中国科学院生化细胞所。RPMI1640，胎牛血清，青霉素和链霉素购自美国Invitrogen公司。

4.2实验方法

将人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9细胞于对数生长期接种于12孔板(1×10⁵个细胞/孔)中，等细胞单层长满后，用100μL枪头划痕，同时加入不同浓度的生物碱苷，于24小时后观察，并在显微镜下成像。

4.3实验结果

结果如图4所示，分别采用浓度为16和32μM的生物碱苷处理人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9，24小时后，人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9的划痕迁移活性明显下降；由此可知，本发明的生物碱苷对于人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9的划痕迁移活性具有显著的抑制作用，可以有效的抑制人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9进行扩散迁移；且结果显示，该抑制作用具有浓度依赖性，生物碱苷的浓度越高，其对于人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9的抑制作用越好。

实施例5

生物碱苷(式1)抑制小鼠体内人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9转移的实验。

5.1实验材料

人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9购自上海中国科学院生化细胞所。RPMI1640，胎牛血清，青霉素和链霉素购自美国Invitrogen公司。裸鼠购自于上海斯莱克实验动物有限公司。

5.2实验方法

将人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9接种在含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基上，并置于37℃，5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养，用0.25％膜蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

采用对数生长期的人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9，进行裸鼠尾静脉接种构建小鼠荷瘤模型(n＝5)，随机分组。对照组隔天腹腔注射空白溶剂，实验组隔天口服灌胃5或10mg/kg的生物碱苷；使用小动物活体成像系统检测GFP表达，发射波长为520nm，激发波长为480nm，曝光时间为1s，连续观察5周。

5.3实验结果

结果如图5所示，分别采用浓度为5mg/kg、10mg/kg的生物碱苷口服灌胃裸鼠后，裸鼠体内的肿瘤荧光强度减弱，由此可以说明，本发明的生物碱苷能够有效的抑制小鼠体内人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9的转移能力。

实施例6

生物碱苷(式1)抑制人结直肠癌细胞SW480与DLD-1小室迁移能力与侵袭能力实验。

6.1实验材料

人结直肠癌细胞SW480与DLD-1购自上海中国科学院生化细胞所。RPMI1640，胎牛血清，青霉素和链霉素购自美国Invitrogen公司。结晶紫试剂购自美国Sigma公司。

6.2实验方法

将人结直肠癌细胞SW480与DLD-1分别接种在含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基，并置于37℃，5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养，用0.25％膜蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

将处于对数期的人结直肠癌细胞SW480与DLD-1(5×10⁴个细胞/孔)接种于小室(8μm孔径)上室中，并加入生物碱苷。上室无血清，下室10％血清。生物碱苷与细胞作用于24小时后，取出小室，弃培养基，用棉签轻轻地擦去上室未迁移的细胞，固定甲醇中，用结晶紫染色，并于显微镜下计数。

6.3实验结果

结果如图6所示，分别采用浓度为16和32μM的生物碱苷处理人结直肠癌细胞SW480与DLD-1后，人结直肠癌细胞SW480与DLD-1的小室迁移能力与侵袭能力明显下降，由此可以说明，本发明的生物碱苷对于人结直肠癌细胞SW480与DLD-1的小室迁移能力与侵袭能力具有显著的抑制作用，可以有效的抑制人结直肠癌细胞SW480与DLD-1进行扩散迁移；且随生物碱苷浓度的增加，其对人结直肠癌细胞SW480与DLD-1的小室迁移能力与侵袭能力的抑制作用越好。

实施例7

生物碱苷(式1)抑制人结直肠癌细胞SW480与DLD-1后细胞划痕迁移实验。

7.1实验材料

人结直肠癌细胞SW480与DLD-1购自上海中国科学院生化细胞所。RPMI1640，胎牛血清，青霉素和链霉素购自美国Invitrogen公司。

7.2实验方法

将人结直肠癌细胞SW480与DLD-1分别接种在含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基上，并置于37℃，5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养，用0.25％膜蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

人结直肠癌细胞SW480与DLD-1细胞于对数生长期接种于12孔板(1×10⁵个细胞/孔)中，等细胞单层长满后，用100μL枪头划痕，同时加入不同浓度的生物碱苷，于24小时后观察，并在显微镜下成像。

7.3实验结果

结果如图7所示，分别采用浓度为16和32μM的生物碱苷处理人结直肠癌细胞SW480与DLD-1后，人结直肠癌细胞SW480与DLD-1的划痕迁移活性明显下降，由此可以说明，本发明的生物碱苷可以有效的抑制人结直肠癌细胞SW480与DLD-1进行扩散迁移。

结合上述实施例1至实施例7的结果可知，本发明的生物碱苷对于非小细胞肺癌细胞和人结直肠癌细胞的生长和转移均具有显著的抑制作用，可以将其应用于制备治疗或预防非小细胞肺癌和结直肠癌、以及治疗或预防非小细胞肺癌和结直肠癌转移的药物中。

所述对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。

Claims

1.一种生物碱苷，其特征在于：该生物碱苷的分子式如下式(1)所示：

2.如权利要求1所述的生物碱苷在制备用于预防或治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。

3.如权利要求1所述的生物碱苷在制备用于预防或治疗非小细胞肺癌转移的药物中的应用。

4.根据权利要求2或3所述应用，其特征在于：所述生物碱苷作用于人非小细胞肺癌细胞A549与PC-9。

5.如权利要求1所述的生物碱苷在制备用于预防或治疗结直肠癌的药物中的应用。

6.如权利要求1所述的生物碱苷在制备用于预防或治疗结直肠癌转移的药物中的应用。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述生物碱苷作用于人结直肠癌细胞SW480与DLD-1。

8.根据权利要求2或3或5或6任意一项所述的应用，其特征在于：由所述生物碱苷制成的药物中，所述生物碱苷的含量为0.1-99.9％。