CN115501224A - 马来酸依那普利叶酸片联合通心络在制备治疗高血压合并颈动脉硬化药物的应用 - Google Patents

马来酸依那普利叶酸片联合通心络在制备治疗高血压合并颈动脉硬化药物的应用 Download PDF

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袁丽霞
龚春
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Abstract

本发明公开了一种马来酸依那普利叶酸片联合通心络在制备治疗高血压合并颈动脉硬化药物的应用。本发明将马来酸依那普利叶酸片联合通心络使用，能够有效治疗高血压，并进一步对颈动脉血管起保护作用。

Description

马来酸依那普利叶酸片联合通心络在制备治疗高血压合并颈 动脉硬化药物的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种马来酸依那普利叶酸片联合通心络在制备治疗高血压合并颈动脉硬化药物的应用。
背景技术
心血管疾病仍然是各国发病率、死亡率的最主要病因，动脉硬化（AS）和高血压是心血管事件和死亡率的独立预测因子；随着老龄化相关的心血管功能障碍和疾病，所带来的负担持续增长；对新的治疗方法的渴望也在增加，本着这一思路，我们探索H型高血压合并颈动脉粥样硬化作些实验研究，为临床治疗H型高血压合并颈动脉粥样硬化病人提供实验依据。H型高血压伴有Hcy升高，Hcy是一种含巯基的氨基酸，由蛋氨酸在组织细胞中脱甲基生成。正常的血浆Hcy浓度不超过10umol/L，当其浓度超过此限度时被定义为高同型半胱氨酸血症(HHcy)，HHcy可引起动脉粥样硬化，导致心脑血管事件的一个危险因素。以基因及营养因素为主的多种原因均可导致血中Hcy水平增高。
马来酸依那普利叶酸片（依叶片）是临床上治疗高血压的药物，叶酸为Hcy转变为蛋氨酸提供甲基，又可以增加Hcy代谢过程中酶的活性，被认为是治疗高血压最有效的药物。通心络由人参、水蛭、全蝎、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、冰片所组成，以益气、活血、解痉、通络为大法，同样有降低血压、Hcy水平等作用，改善血管壁的厚度，在我国已广泛应用。通心络胶囊，是基于中医络病学说制定的通络干预的代表方剂。通心络胶囊的基础研究显示其药理作用机制具有多效性。目前有研究表明，通心络在降低血压方面发挥重要的作用。近二十年以来，通心络胶囊临床广泛运用于心脑血管疾病，包括心绞痛、动脉粥样硬化、高血压和脑梗塞等。
高脂血症是导致动脉粥样硬化，进而形成心脑血管事件的主要因素之一，近30年来，中国人群的血脂水平逐步升高，血脂异常患病率高达40.40%，年龄≥75岁老年人全因及心血管死亡率，以及动脉粥样硬化性心血管疾病风险显著增加。据临床资料显示，高血压患者患动脉粥样硬化较正常人患此病的高 3-4倍。
高血压与年龄、高血糖、高血脂、吸烟、肥胖及Hcy等有关，也与遗传和环境因素有关。近年来有报道，肠道菌群失调与高血压有关，越来越多的研究者致力于中医中药通过改善肠道菌群、调节高血压病相关危险因素进而调节血压。肠道菌群的丰富度与多样性是反映肠道菌群组成的重要参数。有研究报道，高血压患者肠道菌群的丰富度与多样性均降低。
本发明通过蛋氨酸作用于动物建立自发性高血压模型，成功建立H型高血压合并颈动脉硬化模型后给予依叶片和通心络胶囊干预。为H型高血压合并颈动脉硬化的防治提供新的理论依据，并为临床规范治疗H型高血压合并颈动脉硬化提供新的策略，因此提供了一种马来酸依那普利叶酸片联合通心络在制备治疗高血压合并颈动脉硬化药物的应用。
发明内容
本发明旨在解决临床迫切需要解决的问题和疾病的发病机理，根据蛋氨酸作用于动物建立自发性高血压模型，提供了马来酸依那普利叶酸片联合阿托伐他汀钙片在治疗高血压合并颈动脉硬化上的作用通心络在制备治疗高血压合并颈动脉硬化药物的应用。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
一种通心络在制备治疗高血压合并颈动脉硬化药物的应用，所述马来酸依那普利叶酸片与通心络的给药剂量之比为2：21。
优选的，所述高血压为H型高血压（高血压合并高同型半胱氨酸）。
本发明还提供了一种药物制剂，包括治疗有效量的马来酸依那普利叶酸片和通心络，以及药学上可接受的载体或辅料。
优选的，所述药物制剂为口服制剂或注射制剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
通过动物喂养蛋氨酸，动物血清中的Hcy、TC、TG均明显升高，HDL-C明显降低；GRP78、GRP94和Caspase-12表达升高；颈动脉变厚、且厚度增加、管腔狭窄、血压升高；组织病理检查有大量泡沫细胞、纤维组织增生；肠道菌群的丰富度与多样性下降。使用依叶片、通心络治疗后上述检查结果明显好转，两药联用优于单药应用，说明蛋氨酸可导致Hcy等升高、血管硬化、肠道菌群失调、血压升高，而药物应用后Hcy等下降、提高了肠道菌群丰富度与多样性、血压下降等。这些优势是通过抑制ERS等途径保护VSMC，改善血管结构达到降低血压之目的。
总之，本发明将依叶片联合通心络使用，能够有效治疗高血压，并进一步对颈动脉血管起保护作用。
附图说明：
图1为本发明各组动物颈动脉厚度与血压结果；
图2为本发明各组动物血浆Hcy和血清 TG、TC、HDL-C的含量；
图3为本发明各组大鼠颈动脉组织HE染色结果；
图4为本发明各组动物GRP94、Caspase-12和GRP78表达结果；
图5为本发明各组动物肠道菌群多样性分析图；
图6为本发明各组动物肠道菌群结构比较。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
本实施例提供了一种马来酸依那普利叶酸片联合通心络在制备治疗高血压合并颈动脉硬化药物的应用，具体如下。
一、材料与仪器
1、实验动物：SHR大鼠（雄性，49-55天），北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK（京），2016-8006]。
2、实验试剂与仪器：依叶片（马来酸依那普利10mg/叶酸0.8mg/片批号20180701中国深圳奥萨制药有限公司）；通心络胶囊（0.26g/粒批号S-160901石家庄以岭药业股份有限公司）；蛋氨酸颗粒（批号CP29181013张家港市曙光生物制品厂）；Trizon Reagent（100mlCW0580S，CWBIO 康为世纪中国北京）；Ultrapure RNA 超纯RNA提取试剂盒（1盒CW0581M，CWBIO 康为世纪中国北京）；HiFiScriptcDNA第一链合成试剂盒（1盒CW2569M，CWBIO 康为世纪中国北京）；UltraSYBR Mixture（1只CW0957M，CWBIO 康为世纪中国北京）；超敏发光液（100ml RJ239676，美国赛默飞）；Mouse Monoclonal Anti-GAPDH( 1只 1ml TA-08，中国北京中杉金桥，1/2000)；辣根酶标记山羊抗鼠IgG（H+L）(1只1ml ZB-2305，中国北京中杉金桥，1/2000)；Rabbit Polyclonal Anti-GRP78 BIP(100ul ab21685美国Abcam，1/1000）；Mouse Monoclonal Anti-GRP94（100ul ab2791，美国Abcam，1/5000）；Rabbit PolyclonalAnti-caspase-12(100ul ab62484，美国Abcam，1/1000）；辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）(100ul ZB-2301，中国北京中杉金桥，1/2000)；大鼠Hcy试剂盒（一盒MM-0293R1，中国江苏酶免）；T-CHO试剂盒（A111-1，南京建成）；TG试剂盒（A110-1，南京建成中国江苏）；超高分辨率小动物彩色多普勒超声实时影像系统(Vevo®2100超高分辨率小动物彩色多普勒超声实时影像系统，VisualSonics Inc.)；；荧光PCR仪[CFX Connect™实时，伯乐生命医学产品（上海）有限公司美国]；蛋白垂直电泳仪（DYY-6C，北京市六一仪器厂北京）；超高灵敏度化学发光成像系统[ChemiDocTM XRS+，伯乐生命医学产品（上海）有限公司美国]；多功能酶标仪（S/N502000011，TECAN美国）；荧光显微镜(CKX53，OLYMPUS日本)；无创尾动脉血压测量分析系统（ZS-Z，北京众实迪创科技发展有限公司北京）。
二、实验方法
本发明通过蛋氨酸喂养大鼠，采用依叶片和通心络单独或联合喂养大鼠8周后，检测各组血压和颈动脉厚度，ELISA检测各组同型半胱氨酸(Hcy)的浓度，生化检测各组甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的含量，HE染色观察各组颈动脉结构，荧光定量PCR和Western blot检测各组葡萄糖调节蛋白94（GRP94）、半胱氨酸门冬氨酸特异性蛋白激酶12（Caspase-12）和葡萄糖调节蛋白78（GRP78）表达；16S rDNA高通量检测各组菌群多样性及丰度。
1、动物实验分组：
将30只大鼠随机分为五个组，正常对照组（Control）、蛋氨酸颗粒组（Model）、蛋氨酸颗粒+依叶片组（EFA）、蛋氨酸颗粒+通心络组（TXL）、蛋氨酸颗粒+依叶片+通心络组（EFA+TXL），每组各6只。Control组大鼠经标准饲料喂养同时给予双蒸水灌胃8周，剂量为1ml/200g；Model组大鼠经2%蛋氨酸颗粒饲料喂养同时给予双蒸水灌胃8周，剂量为1ml/200g；EFA组大鼠经2%蛋氨酸颗粒饲料喂养同时给予浓度为4mg/ml的依叶片溶液灌胃8周，剂量为1ml/200g；TXL组大鼠经2%蛋氨酸颗粒饲料喂养同时给予浓度为42mg/ml的通心络溶液灌胃8周，剂量为1ml/200g；EFA+TXL组大鼠经2%蛋氨酸颗粒饲料喂养同时给予浓度为4mg/ml的依叶片溶液和浓度为42mg/ml的通心络溶液灌胃8周，剂量均为1ml/200g。
2、荧光定量PCR
各组进行RNA的提取，提取RNA后根据逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板，在荧光定量PCR仪上进行检测，以GAPDH为内参，计算出各组测GRP94、Caspase-12和GRP78表达情况。
操作体系：
RNase Free dH20 9.5ul
cDNA/DNA 1ul
上游引物 1ul
下游引物 1ul
2xULtraSYBR Mixture 12.5ul
反应程序，三步法：
步骤温度时间
预变性 95℃ 10min
变性 95℃ 10s
退火 54.3℃ 30s
延伸 72℃30s
循环 40次
融解曲线分析温度时间
95℃ 15s
54.3℃ 1min
95℃ 15s
54.3℃ 15s
54.3℃ 15s
引物如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
3、Western blot
取各组样本加入相应的裂解液，4℃裂解30 min，在10000 rpm/min离心10 min，小心吸取上清，即得总蛋白。利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。蛋白变性、上样、电泳1-2 h，湿法转膜30-50 min。4℃孵育一抗溶液过夜；室温孵育二抗1-2h。在膜上滴加ECL曝光液，曝光。用“Quantity one”软件分析各抗体条带灰度值。
4、血压测定
打开无创血压测量仪开启预热，大鼠置于固定筒内露出尾部，将大鼠尾部通过加压套插入至接近尾根部，同时鼠尾穿过脉搏传感器，使鼠尾尾动脉刚好处于脉搏传感器的“脉搏信号传感片”上方，并调节鼠尾压迫片使传感片紧贴鼠尾下方的尾动脉，待大鼠脉搏稳定后进行血压测量。
、超声检测
药物干预8周后，采用超高分辨率小动物彩色多普勒超声实时影像系统，频率为15MHZ，检测各组大鼠颈动脉厚度，每组3只。超声检测前先用脱毛膏脱去颈部毛发，打开超声检测仪，用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠并将大鼠固定于平板操作台上，在脱毛部位及探头涂上耦合剂，移动探头找到颈动脉采集数据。
6、ELISA 检测
分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40μL，然后再加待测样品 10μL（样品最终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。每孔加入酶标试剂 100μL，空白孔除外。用封板膜封板后置 37 ℃温育 60 min。将 20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 20 倍稀释后备用。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 s后弃去，如此重复 5 次，拍干。每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色 15 min。每孔加终止液 50μL，终止反应。以空白孔调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终止液后 15 min以内进行。
7、生化检测
按照相应生化试剂盒进行检测。
8、HE染色
取出组织流水冲洗数小时，经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min（至透明为止）。放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50-60分钟。石蜡包埋，切片。将石蜡切片进行烤片，然后脱蜡，水化。将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色3min，盐酸乙醇分化液分化15s，稍水洗，返蓝液返蓝15s，流水冲洗，伊红染色3min，流水冲洗，脱水，透明，封片，镜检。
9、16SrDNA 高通量测序
上机测序前，需要先对文库在Agilent Bioanalyzer上进行质检，采用AgilentHigh Sensitivity DNA Kit。合格的文库有且只有单一的峰，且无接头。之后，采用Quant-iTPicoGreendsDNA Assay Kit在PromegaQuantiFluor荧光定量系统上对文库进行定量，合格的文库浓度应在2nM以上。将合格的各上机测序文库（Index序列不可重复）梯度稀释后，根据所需测序量按相应比例混合，并经NaOH变性为单链进行上机测序；使用MiSeq测序仪进行2×300bp的双端测序，相应试剂为MiSeq Reagent Kit V3 (600 cycles)。
10、统计学分析
所有数据均采用SPSS 19.0进行统计分析，经单因素方差分析显著性差异，以P＜0.05作为显著性差异。
三、实验结果
1、各组动物颈动脉厚度与血压结果
如附图1所示，与Control组相比，Model组的颈动脉厚度与血压表达明显升高，差异具有统计学意义（*P＜0.05）；与Model组相比，EFA组、TXL组和EFA+TXL组的颈动脉厚度与血压明显下降，其中EFA+TXL组下降的更加明显，差异具有统计学意义（#P＜0.05）。
、各组动物血浆Hcy和血清 TG、TC、HDL-C的含量
如附图2所示，与Control组相比，Model组的Hcy、TG、TC的含量明显升高，HDL-C的含量明显下降，差异具有统计学意义（*P＜0.05）；与Model组相比，EFA组、TXL组和EFA+TXL组的Hcy、TG、TC的含量明显下降，HDL-C的含量明显升高，其中EFA+TXL组更加明显，差异具有统计学意义（#P＜0.05）。
、各组大鼠颈动脉组织HE染色结果
如附图3所示，正常Control组的颈动脉管壁结构正常，未见泡沫细胞和粥样斑块形成；Model组颈总动脉管腔狭窄，管壁内膜增厚，大量泡沫细胞和纤维细胞增生；EFA组、TXL组和EFA+TXL组颈动脉管壁趋于正常，未见泡沫细胞和粥样斑块形成。
、各组动物GRP94、Caspase-12和GRP78表达结果
如附图4所示，与Control组相比，Model组的GRP94、Caspase-12和GRP78表达明显升高，差异具有统计学意义（*P＜0.05）；与Model组相比，EFA组、TXL组和EFA+TXL组的GRP94、Caspase-12和GRP78表达明显下降，差异具有统计学意义（#P＜0.05）。
、各组动物肠道菌群多样性分析
如附图5所示，本实验通过Simpson、Chao1、ACE和Shannon指数来分析菌群的丰度与多样性，Simpson和Shannon指数与菌群多样性成正比，Chao1和ACE指数与菌群丰度成正比，与正常Control组相比，Model组的Simpson、Chao1、ACE和Shannon指数都明显下降，差异具有统计学意义P＜0.05）；与Model组相比，EFA组、TXL组和EFA+TXL组的Simpson、Chao1、ACE和Shannon指数都明显升高，差异具有统计学意义P＜0.05）。这结果说明Model组菌群多样性与丰度较Control组均降低，对EFA组、TXL组和EFA+TXL组菌群多样性与丰度较Model组均有提升。
各组动物肠道菌群分类组成分析
如附图6所示，在属水平，与正常Control组相比，Model组的Unclassified_ Clostridiales、Unclassified_Ruminococcaceae和Oscillospira的丰度下降，差异具有统计学意义*P＜0.05）；与Model组相比，EFA组、TXL组和EFA+TXL组的Unclassified_ Clostridiales、Unclassified_Ruminococcaceae和Oscillospira丰度升高，差异具有统计学意义#P＜0.05）。
最后应说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种马来酸依那普利叶酸片联合通心络在制备治疗高血压合并颈动脉硬化药物的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述马来酸依那普利叶酸片与通心络的给药剂量之比为2：21。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述高血压为H型高血压。
4.一种药物制剂，其特征在于：包括治疗有效量的马来酸依那普利叶酸片和通心络，以及药学上可接受的载体或辅料。
5.根据权利要求4所述的药物制剂，其特征在于：所述药物制剂为口服制剂或注射制剂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP0884054A2 (en) * 1997-05-13 1998-12-16 Vita-Invest, S.A. Fixed-dose association of an angiotensin-converting enzyme inhibitor and of a calcium channel antagonist for the treatment of cardiovascular illnesses
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黄剑锋等: "马来酸依那普利叶酸片联合通心络对蛋氨酸诱导大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的影响", 中国中西医结合杂志, vol. 42, no. 3, pages 327 - 333 *

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