CN115501185A - 一种治疗骨肉瘤的复合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗骨肉瘤的复合物及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤：分别制备全反式维甲酸与脂质体的复合物、GA‑Fe复合物、骨肉瘤细胞膜脂质体；制备GA‑Fe复合物的水溶液；将全反式维甲酸与脂质体的复合物、骨肉瘤细胞膜脂质体混合均匀，超声处理得到杂化膜；通过GA‑Fe复合物的水溶液将杂化膜水化，超声处理，过滤，即得治疗骨肉瘤的复合物。通过上述制备方法制备的一种协同分化治疗和程序性铁死亡的治疗骨肉瘤的复合物，具有靶向骨肉瘤诱导分化治疗并加强铁死亡的治疗效果，为骨肉瘤治疗提供了新方向。
Description
技术领域
本发明属于骨肉瘤治疗药物技术领域，具体涉及一种治疗骨肉瘤的复合物及其制备方法。
背景技术
骨肉瘤是儿童和青少年期最常见的原发骨恶性肿瘤，年发病率约为3/100 万，男女发病率约为1.5∶1，大约80％～90％的骨肉瘤发生于四肢长管状骨干骺端，尤其是股骨远端、胫骨近端和肱骨近端。1970年以前，对于无转移的肢体骨肉瘤一般采取截肢手术治疗，其5年生存率不足20％。近20年，尽管国际诸多研究机构进行了大量的努力，但骨肉瘤生存率依然停滞不前。开发新的骨肉瘤治疗药物并引入新型的治疗理念和策略对于提高骨肉瘤的治疗及预后尤为重要。
发明内容
本发明提供了一种治疗骨肉瘤的复合物，通过构建特异性靶向骨肉瘤的兼具分化治疗和铁死亡治疗作用的复合药物体系，实现优异的骨肉瘤治疗效果；此外，本发明还提供了一种治疗骨肉瘤的复合物的制备方法。
本发明第一方面提供了一种治疗骨肉瘤的复合物的制备方法，包括以下步骤：
分别制备全反式维甲酸与脂质体的复合物、GA-Fe复合物、骨肉瘤细胞膜脂质体；
制备GA-Fe复合物的水溶液；
将全反式维甲酸与脂质体的复合物、骨肉瘤细胞膜脂质体混合均匀，超声处理得到杂化膜；
通过GA-Fe复合物的水溶液将杂化膜水化，超声处理，过滤，即得治疗骨肉瘤的复合物。
在本发明的一实施例中，所述全反式维甲酸与脂质体的复合物通过以下步骤制备而得：将全反式维甲酸与脂质体溶于氯仿中，旋转蒸发去除氯仿，即得全反式维甲酸与脂质体的复合物。
在本发明的一实施例中，所述脂质体为卵磷脂；全反式维甲酸与卵磷脂的质量比为1:(20～30)。
在本发明的一实施例中，所述GA-Fe复合物通过以下步骤制备而得：
将四水合氯化亚铁和聚乙烯吡咯烷酮加入至脱气去离子水中，搅拌混合均匀，得到混合液；
将没食子酸溶液逐滴加入至所述混合液中，在氮气气氛中进行搅拌，超滤浓缩，即得GA-Fe复合物。
在本发明的一实施例中，所述GA-Fe复合物制备过程中：
四水合氯化亚铁和聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1:(3～4)；
没食子酸溶液与混合液的质量比为1:(35～45)；
所述没食子酸溶液的浓度为10mg/mL；
超滤浓缩中，超滤的截留分子量为10000Da。
在本发明的一实施例中，所述骨肉瘤细胞膜脂质体通过以下步骤制备而得：
(1)、培养并收集骨肉瘤细胞，收集所得骨肉瘤细胞用磷酸盐缓冲液冲洗细胞3～5次；
(2)、冲洗所得骨肉瘤细胞用含有苯甲基磺酰氟的去离子水在冰上裂解细胞10～15分钟，然后在液氮中冷冻并解冻，重复3～5个循环，离心，即得骨肉瘤细胞膜脂质体。
在本发明的一实施例中，所述含有苯甲基磺酰氟的去离子水中，苯甲基磺酰氟的浓度为1mM。
在本发明的一实施例中，所述全反式维甲酸与脂质体的复合物、骨肉瘤细胞膜脂质体混合后，超声处理得到杂化膜；
其中，全反式维甲酸与脂质体的复合物、骨肉瘤细胞膜脂质体混合时，全反式维甲酸与脂质体的复合物、与骨肉瘤细胞膜脂质体中细胞膜蛋白的质量比为(20～25):1；
超声处理时间为10～15min，超声处理温度为37℃。
在本发明的一实施例中，通过GA-Fe复合物的水溶液将杂化膜水化，超声处理10～15min，通过100nm聚碳酸酯膜挤压滤过8～12次，即得治疗骨肉瘤的复合物。
本发明第二方面提供了通过如上所述制备方法制备所得的治疗骨肉瘤的复合物。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明实施例提供了一种协同分化治疗和程序性铁死亡的治疗骨肉瘤的复合物，具有靶向骨肉瘤诱导分化治疗并加强铁死亡的治疗效果；其中，本发明中的用于治疗骨肉瘤的复合物在分化治疗有效上调细胞内活性氧的基础上，铁死亡诱导剂的引入会进一步上调细胞内的活性氧，使得细胞内结构不可逆的遭到破坏，最终引发肿瘤细胞的死亡，且这种层级递增式的上调活性氧要比各自治疗时候分别上调活性氧对肿瘤细胞的杀伤效果之和强很多。
2、本发明实施例通过构建特异性靶向骨肉瘤的兼具分化治疗和铁死亡治疗作用的复合药物体系，实现优异的骨肉瘤治疗效果。
3、本发明实施例提供的治疗骨肉瘤的复合物的制备方法，原料来源广泛，工艺简单、安全。
附图说明
图1为本发明实施例治疗骨肉瘤的复合物的合成示意图；
图2为本发明实施例治疗骨肉瘤的复合物的药效原理；
图3为实施例8中制备所得治疗骨肉瘤的复合物对骨肉瘤细胞143B的清除效果；
图4为实施例8中制备所得治疗骨肉瘤的复合物对骨肉瘤细胞HOS的清除效果。
具体实施方式
在本文中，由「一数值至另一数值」表示的范围，是一种避免在说明书中一一列举该范围中的所有数值的概要性表示方式。因此，某一特定数值范围的记载，涵盖该数值范围内的任意数值以及由该数值范围内的任意数值界定出的较小数值范围，如同在说明书中明文写出该任意数值和该较小数值范围一样。
在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。在多个从属权利要求的情况下，仅仅在替代方案中使用“或”引用一个以上的前述独立或从属权利要求。
除非另外指明，正如根据本公开所使用的，以下术语应理解为具有以下含义：
需要说明的是，本发明中所使用的科学和技术术语及其缩略语具有本领域技术人员通常理解的含义。以下列举了本发明中使用的部分术语和缩略语：
术语“治疗”在关于治疗例如病变或疾病使用时指的是减轻和/或消除该病变或疾病的一种或多种症状，和/或延迟该病变或疾病的一种或多种症状的进展和/或降低该病变或疾病的一种或多种症状的发病率或严重程度，和/或预防该病变或疾病。术语治疗可以指的是预防性治疗，其包括延迟病变或疾病的发作或预防病变或疾病的发作。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施提供了一种全反式维甲酸嵌合的脂质体，本实施例中的全反式维甲酸嵌合的脂质体通过以下步骤制备而得：将全反式维甲酸和卵磷脂(全反式维甲酸和卵磷脂的质量比为1:20)溶于氯仿中，旋转蒸发(旋转转速：50-150 rpm，温度为35-40℃)去除溶剂氯仿，待未见溶剂氯仿后继续旋转蒸发5分钟左右，即制得全反式维甲酸嵌合的脂质体。
实施例2
本实施提供了一种全反式维甲酸嵌合的脂质体，本实施例中的全反式维甲酸嵌合的脂质体通过以下步骤制备而得：将全反式维甲酸和卵磷脂(全反式维甲酸和卵磷脂的质量比为1:30)溶于氯仿中，旋转蒸发(旋转转速：50-150 rpm，温度为35-40℃)去除溶剂氯仿，待未见溶剂氯仿后继续旋转蒸发5分钟左右，即制得全反式维甲酸嵌合的脂质体。
实施例3
本实施提供了一种全反式维甲酸嵌合的脂质体，本实施例中的全反式维甲酸嵌合的脂质体通过以下步骤制备而得：将全反式维甲酸和卵磷脂(全反式维甲酸和卵磷脂的质量比为1:25)溶于氯仿中，旋转蒸发(旋转转速：50-150 rpm，温度为35-40℃)去除溶剂氯仿，待未见溶剂氯仿后继续旋转蒸发5分钟左右，即制得全反式维甲酸嵌合的脂质体。
实施例4
本实施例提供了一种GA-Fe复合物，本实施例中的GA-Fe复合物通过以下步骤制备而得：
将四水合氯化亚铁和聚乙烯吡咯烷酮按照23:80的质量比混合，得到混合物，将混合加入到脱气去离子水(脱气去离子水与混合物的质量比为40:41) 中，在20-25℃的温度下充分搅拌(搅拌速率：100-200rpm)5分钟，得到混合液；
将没食子酸(GA)溶液(10mg·mL-1)，以50-70滴/分钟的速度加入到混合液中(没食子酸(GA)溶液与混合液的质量比为1：41)，保持温度在 20-25℃，在氮气气氛中继续搅拌(搅拌速率：100-200rpm)24小时，最后对所得混合物超滤浓缩，超滤的截留分子量为10kDa，浓缩后即制得GA-Fe 复合物，将其保存在4℃冰箱中以备后续使用。
实施例5
本实施例提供了一种GA-Fe复合物，本实施例中的GA-Fe复合物通过以下步骤制备而得：
将四水合氯化亚铁和聚乙烯吡咯烷酮按照1:4的质量比混合，得到混合物，将混合加入到脱气去离子水(脱气去离子水与混合物的质量比为40:41)中，在20-25℃的温度下充分搅拌(搅拌速率：100-200rpm)10分钟，得到混合液；
将没食子酸(GA)溶液(10mg·mL-1)，以50-70滴/分钟的速度加入到混合液中(没食子酸(GA)溶液与混合液的质量比为1：35)，保持温度在 20-25℃，在氮气气氛中继续搅拌(搅拌速率：100-200rpm)24小时，最后对所得混合物超滤浓缩，超滤的截留分子量为10kDa，浓缩后即制得GA-Fe 复合物，将其保存在4℃冰箱中以备后续使用。
实施例6
本实施例提供了一种GA-Fe复合物，本实施例中的GA-Fe复合物通过以下步骤制备而得：
将四水合氯化亚铁和聚乙烯吡咯烷酮按照1:3的质量比混合，得到混合物，将混合加入到脱气去离子水(脱气去离子水与混合物的质量比为40:41)中，在20-25℃的温度下充分搅拌(100-200rpm)15分钟，得到混合液；
将没食子酸(GA)溶液(10mg·mL-1)，以50-70滴/分钟的速度加入到混合液中(没食子酸(GA)溶液与混合液的质量比为1：45)，保持温度在 20-25℃，在氮气气氛中继续搅拌(搅拌速率：100-200rpm)24小时，最后对所得混合物超滤浓缩，超滤的截留分子量为10kDa，浓缩后即制得GA-Fe 复合物，将其保存在4℃冰箱中以备后续使用。
实施例7
本实施例提供了一种骨肉瘤细胞膜脂质体，所述骨肉瘤细胞膜脂质体通过以下步骤制备而得：培养并收集骨肉瘤细胞，之后用磷酸盐缓冲液冲洗细胞3-5次，用去离子水(含有1mM苯甲基磺酰氟)在冰上裂解细胞10-15分钟，然后在液氮中冷冻并解冻，重复3-5个循环，之后于4℃，14000g离心 30-35分钟，即制得骨肉瘤细胞膜脂质体。
实施例8
本实施例提供了一种治疗骨肉瘤的复合物，所述治疗骨肉瘤的复合物通过以下制备方法制备而得：将实施例1中制备所得全反式维甲酸嵌合的脂质体与实施例7中制备所得骨肉瘤细胞膜脂质体混合(全反式维甲酸嵌合的脂质体与骨肉瘤细胞膜脂质体中细胞膜蛋白的质量比为22：1)，37℃超声处理 10-15min，促进脂质体的融合，得到杂化膜；
用GA-Fe(450-550μg·mL-1)的去离子水溶液将杂化膜水化，超声10-15 min,将混合物通过100nm聚碳酸酯膜挤压滤过8-12次，即得到骨肉瘤靶向诱导分化治疗并加强铁死亡疗效的脂质体，即本实施例中的治疗骨肉瘤的复合物。
试验例
本试验例对实施例8中制备所得用于治疗骨肉瘤的复合物对骨肉瘤细胞 143B和HOS的清除效果进行验证。
实验材料：
对照组：磷酸盐缓冲液
分化治疗组：杂化膜；
铁死亡治疗组：负载GA-Fe的骨肉瘤细胞膜脂质体；
分化+铁死亡治疗组：负载GA-Fe的杂化膜(实施例8中制备所得用于治疗骨肉瘤的复合物)；
细胞毒性实验步骤：
1.每孔加入100微升4000-5000个143B或者HOS细胞。按照实验需要，进行培养并给予相应的材料刺激24小时。
2.每孔加入10微升CCK-8溶液。用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。
3.在细胞培养箱内继续孵育2-3小时。
4.在450nm测定吸光度。
结果如图3和图4所示。由图3和图4可知，本发明提供的用于治疗骨肉瘤的复合物具有优异的清除骨肉瘤细胞143B和HOS的效果，体现出“1+1 ＞2”的疗效；单纯的分化疗法的结果之一就是细胞内的活性氧会上升，细胞内活性氧的上升会破坏细胞内的结构，影响细胞的正常功能；铁死亡则是通过上调细胞内的活性氧，诱导脂质过氧化从而达到杀伤肿瘤的目的；本发明中的用于治疗骨肉瘤的复合物在分化治疗有效上调细胞内活性氧的基础上，铁死亡诱导剂的引入会进一步上调细胞内的活性氧，使得细胞内结构不可逆的遭到破坏，最终引发肿瘤细胞的死亡，且这种层级递增式的上调活性氧要比各自治疗时候分别上调活性氧对肿瘤细胞的杀伤效果之和强很多。
以上公开的仅为本发明优选实施例。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属领域技术人员能很好地利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
在本发明及上述实施例的教导下，本领域技术人员很容易预见到，本发明所列举或例举的各原料或其等同替换物、各加工方法或其等同替换物都能实现本发明，以及各原料和加工方法的参数上下限取值、区间值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。
Claims (10)
1.一种治疗骨肉瘤的复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
分别制备全反式维甲酸与脂质体的复合物、GA-Fe复合物、骨肉瘤细胞膜脂质体；
制备GA-Fe复合物的水溶液；
将全反式维甲酸与脂质体的复合物、骨肉瘤细胞膜脂质体混合均匀，超声处理得到杂化膜；
通过GA-Fe复合物的水溶液将杂化膜水化，超声处理，过滤，即得治疗骨肉瘤的复合物。
2.根据权利要求1所述的治疗骨肉瘤的复合物的制备方法，其特征在于，所述全反式维甲酸与脂质体的复合物通过以下步骤制备而得：将全反式维甲酸与脂质体溶于氯仿中，旋转蒸发去除氯仿，即得全反式维甲酸与脂质体的复合物。
3.根据权利要求2所述的治疗骨肉瘤的复合物的制备方法，其特征在于，所述脂质体为卵磷脂；全反式维甲酸与卵磷脂的质量比为1:(20～30)。
4.根据权利要求1所述的治疗骨肉瘤的复合物的制备方法，其特征在于，所述GA-Fe复合物通过以下步骤制备而得：
将四水合氯化亚铁和聚乙烯吡咯烷酮加入至脱气去离子水中，搅拌混合均匀，得到混合液；
将没食子酸溶液逐滴加入至所述混合液中，在氮气气氛中进行搅拌，超滤浓缩，即得GA-Fe复合物。
5.根据权利要求4所述的治疗骨肉瘤的复合物的制备方法，其特征在于，所述GA-Fe复合物制备过程中：
四水合氯化亚铁和聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1:(3～4)；
没食子酸溶液与混合液的质量比为1:(35～45)；
所述没食子酸溶液的浓度为10mg/mL；
超滤浓缩中，超滤的截留分子量为10000Da。
6.根据权利要求1所述的治疗骨肉瘤的复合物的制备方法，其特征在于，所述骨肉瘤细胞膜脂质体通过以下步骤制备而得：
(1)、培养并收集骨肉瘤细胞，收集所得骨肉瘤细胞用磷酸盐缓冲液冲洗细胞3～5次；
(2)、冲洗所得骨肉瘤细胞用含有苯甲基磺酰氟的去离子水在冰上裂解细胞10～15分钟，然后在液氮中冷冻并解冻，重复3～5个循环，离心，即得骨肉瘤细胞膜脂质体。
7.根据权利要求6所述的治疗骨肉瘤的复合物的制备方法，其特征在于，所述含有苯甲基磺酰氟的去离子水中，苯甲基磺酰氟的浓度为1mM。
8.根据权利要求1所述的治疗骨肉瘤的复合物的制备方法，其特征在于，所述全反式维甲酸与脂质体的复合物、骨肉瘤细胞膜脂质体混合后，超声处理得到杂化膜；
其中，全反式维甲酸与脂质体的复合物、骨肉瘤细胞膜脂质体混合时，全反式维甲酸与脂质体的复合物、与骨肉瘤细胞膜脂质体中细胞膜蛋白的质量比为(20～25):1；
超声处理时间为10～15min，超声处理温度为37℃。
9.根据权利要求1所述的治疗骨肉瘤的复合物的制备方法，其特征在于，
通过GA-Fe复合物的水溶液将杂化膜水化，超声处理10～15min，通过100nm聚碳酸酯膜挤压滤过8～12次，即得治疗骨肉瘤的复合物。
10.一种采用如权利要求1-9任一项所述制备方法制备所得的治疗骨肉瘤的复合物。
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