CN115607655A - 诱导细胞凋亡的方法，制备带锌胰酶的方法及由其制备的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及诱导细胞凋亡的方法，制备带锌胰酶的方法及由其制备的组合物。本发明涉及携带锌离子的胰酶，或带锌胰酶。使胰酶携带锌离子激活了胰酶的抗癌和抗炎性能，并且使得该酶能够口服给予。据观察，带锌胰酶能够在各种癌细胞中诱导细胞凋亡，而不影响正常细胞。还据观察，带锌胰酶诱导滋养细胞的细胞凋亡，并且通常降低炎症。本发明还涉及制备带锌胰酶的方法。本发明进一步涉及使用带锌胰酶治疗癌症和炎症的方法。

Description

诱导细胞凋亡的方法，制备带锌胰酶的方法及由其制备的组 合物

技术领域

本发明总体上涉及在各种癌细胞和滋养细胞(trophoblasts)中诱导细胞凋亡(apoptosis)，从而治疗癌症和炎症的带锌胰酶(zinc-charged pancreatic enzyme)。

背景技术

自20世纪初以来，已有理论认为胰酶可能对治疗癌症有效。苏格兰科学家约翰·比尔德(John Beard)在20世纪初就观察到，胎盘的滋养细胞与癌细胞有相似之处，因为这两种细胞类型都具有高度侵袭性和低分化。他还观察到胎儿大约在胎儿发育的第二个月开始分泌胰酶，这与胎盘对母亲子宫的持续侵入性终止相吻合。由于胎儿不需要消化酶是因为胎儿直接从母亲那里获得所有营养，这种巧合间接表明胰酶必须在控制滋养细胞侵袭中发挥作用。

滋养细胞是形成囊胚(blastocyst)外层的特化细胞。它们通常在人类受精后四天出现。这些特化细胞为胚胎提供营养，并发育成胎盘的很大一部分。滋养细胞在胚胎植入和与蜕膜母体子宫(decidualized maternal uterus)的相互作用中起重要作用。特定类型的滋养细胞侵入母体子宫，是妊娠构建的重要阶段。滋养细胞未能充分侵入在先兆子痫(pre-eclampsia)的发展中很重要。另一方面，滋养细胞侵入过深可能会导致诸如胎盘增生(placenta ac)、胎盘植入(placenta increta)或胎盘渗透(placenta percreta)等疾病。据发现，滋养细胞在妊娠的前三周开始侵入母体子宫，并在妊娠的第二个月停止。

鉴于滋养细胞和癌症之间的相似性，比尔德(Beard)因此假设胰酶可以用于控制癌症的侵袭和生长，并可以有效治疗癌症。然而，尽管这个理论已经存在了很长时间，但该理论并没有得到成功。这是由于对体外细胞培养物的研究表明，正常胰酶或“无携带(unchanged)”胰酶都未显示出对滋养细胞或癌细胞系的任何影响，既不影响细胞生长也不影响细胞死亡。

该胰腺会产生多种酶，包括但不限于，胰蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶、淀粉酶和胰凝乳蛋白酶，以及胰岛素。这些酶每种在人体内都有自己的功能。其中一种酶，淀粉酶，在怀孕期间的血浆中含量很高。这一发现表明胰酶可能对滋养细胞有影响，而因此可能对癌细胞有影响。然而，在本文公开的概念之前，这些胰酶并未显示出含有任何抗癌或细胞凋亡活性。

最近治疗癌症的方法之一是基于称为“细胞凋亡”的生物学现象。细胞凋亡也称为“程序性细胞死亡”或“细胞自杀”。与由细胞损伤引起的细胞死亡相比，细胞凋亡是起到生物学意义功能的基因导向性细胞自毁主动(active)过程。细胞凋亡的生物学意义功能的一个实例发生于胚胎的形态发生过程中。事实上，从胚胎发育的早期阶段到与衰老相关的不可避免的衰退，细胞凋亡在人体中起着关键作用。

使用细胞凋亡治疗癌症是一种有吸引力的癌症治疗方法，因为它本质上教导癌细胞自杀，从而杀死癌细胞。然而，由于癌症治疗的目标是杀死癌细胞而不杀死宿主，因此这种治疗的成功仍然取决于肿瘤细胞的选择性凋亡而不影响正常细胞。

即使存在关于胰酶具有抗癌特性的理论，经过一百多年的研究，这些胰酶还没有被证明具有任何抗癌或凋亡活性。

此外，这些胰酶与其他蛋白质和大分子一样，不能口服给药。这是由于这些蛋白质和其他大分子无法在胃的酸性条件下存活，从而无法被胃肠道吸收并输送到全身。因此，目前的做法是不口服给药这些胰酶，就像其他蛋白质和大分子一样。

令人惊讶的是，据发现，当这些胰酶带有锌离子时，这些酶在滋养细胞和癌细胞上都发生凋亡，而不会影响正常细胞系。换句话说，这些胰酶需要锌作为辅助因子以能够诱导滋养细胞发生细胞凋亡，以终止滋养细胞的进一步入侵。鉴于锌是调节胚胎发育的必需营养素，这种逻辑在生理上是有意义的。更重要的是，鉴于滋养细胞和癌细胞之间的相似性，这些胰酶在带上锌时可以用作抗癌剂。

发明内容

本发明总体上涉及带锌离子(“带锌胰酶(zinc-charged pancreatic enzyme)”)用于激活该胰酶的抗癌和抗炎特性的胰酶。本发明还涉及一种制备带锌胰酶的方法。

本发明的一个目的是提供已经带锌的胰酶而使所述带锌胰酶提供抗癌活性，例如，通过诱导癌细胞凋亡。本发明的另一个目的是提供已带上锌的胰酶，而使所述带锌胰酶提供抗炎活性。本发明的另一个目的是提供已带上锌的胰酶，而使所述胰酶可以口服给药。本发明的另一个目的是提供一种制备带锌胰酶的方法，而使所述胰酶的抗癌和抗炎特性被激活。

此外，由于已证实带锌胰酶在滋养细胞和癌细胞中会诱导细胞凋亡而不影响正常细胞，因此本发明的另一个目的是提供一种使用所述带锌胰酶治疗癌症和炎症的方法。

附图说明

本发明的这些和其他特征和优点随着它们参考本文的说明书、权利要求和附图获得更好的理解而将变得显而易见：

图1A是HTR-8滋养细胞细胞系用锌缓冲溶液培养(incubate)，用Hoechst染料染色，并在荧光下检查的载玻片。

图1B是HTR-8滋养细胞细胞系用带锌淀粉酶培养，用Hoechst染料染色，并在荧光下检查的载玻片。

图1C是HTR-8滋养细胞细胞系用无携带(uncharged)的淀粉酶培养，用Hoechst染料染色，并在荧光下检查的载玻片。

图2A是HL-60癌细胞系用锌缓冲溶液培养，用Hoechst染料染色，并在荧光下检查的载玻片。

图2B是HL-60癌细胞系用带锌淀粉酶培养，用Hoechst染料染色，并在荧光下检查的载玻片。

图2C是HL-60癌细胞系用无携带的淀粉酶培养，用Hoechst染料染色，并在荧光下检查的载玻片。

图3A是通过相差显微镜观察到的用锌缓冲溶液培养的LNCaP癌细胞系的载玻片。

图3B是通过相差显微镜观察到的LNCaP癌细胞系用带锌淀粉酶培养的载玻片。

图3C是LNCaP癌细胞系用锌缓冲溶液培养，用Hoechst染料染色，并在荧光下检查的载玻片。

图3D是LNCaP癌细胞系用带锌淀粉酶培养，用Hoechst染料染色，并在荧光下检查的载玻片。

图4是显示取自喂食带锌淀粉酶的小鼠的胰腺提取物与对照相比对HT-29癌细胞的凋亡活性百分比的线图。

图5是比较PD-L1在用对照、用带锌淀粉酶或用带锌胰酶处理的HT-29细胞中的表达的条形图。

图6A是显示与对照相比，带锌淀粉酶对小鼠血清中TNF-α水平的影响的条形图。

图6B是显示与对照相比，带锌淀粉酶对小鼠血清中IL-8水平的影响的条形图。

图6C是显示与对照相比，带锌淀粉酶对小鼠血清中IL-6水平的影响的条形图。

图7是显示用在人类受试者摄入带锌淀粉酶后的不同时间收集的唾液培养之后的HT-29细胞中的凋亡活性百分比的线图。

图8是显示与对照相比，胰腺中带锌淀粉酶的体内活性的条形图。

图9是显示与对照相比，由于给予带锌淀粉酶而在MDA-MB-23小鼠模型中对乳腺癌肿瘤生长的抑制的线形图。

图10A是显示与对照相比，带锌淀粉酶对小鼠血清中IL-6水平的影响的条形图。

图10B是显示与对照相比，带锌淀粉酶和带锌胰酶对小鼠血清中IL-8水平的影响的条形图。

图10C是显示与对照相比，带锌淀粉酶和带锌胰酶对小鼠血清中TNF-α水平的影响的条形图。

图11A是显示与对照相比，带锌淀粉酶对小鼠肺组织中IL-6水平的影响的条形图。

图11B是显示了与对照相比，带锌淀粉酶和带锌胰酶对小鼠肺组织中IL-8水平的影响的条形图。

图12是显示用口服给药全蛋白带锌的胰蛋白酶的人类受试者的唾液培养的HT-29癌细胞中的细胞凋亡百分比的线图。

图13是显示用口服给药全蛋白带锌胰蛋白酶的人类受试者的唾液培养的BXPC3癌细胞中的细胞凋亡百分比的线图。

图14是显示了用口服给药全蛋白带锌胰蛋白酶的人类受试者的唾液培养的HT-29癌细胞中的凋亡百分比的条形图。

图15是显示当用无携带的胰蛋白酶相对于用带锌胰蛋白酶处理时的HT-29癌细胞中的细胞凋亡百分比的条形图。

图16是显示当用无携带的胰蛋白酶相对于带锌胰蛋白酶处理时的胎盘细胞的凋亡百分比的条形图。

图17是显示用口服给药全蛋白带锌淀粉酶的人类受试者的唾液培养的HT-29癌细胞中细胞凋亡百分比的线图。

具体实施方式

现在将在下文中参照附图更全面地描述本发明，其中显示了本发明的实施方式。然而，本发明可以以许多不同的形式进行实施而不应该解释为仅限于本文所阐述的实施方式。相反，提供这些实施方式是为了使本公开彻底和完整，并将本发明的范围充分传达于本领域技术人员。

应当理解的是，当一个元件被称为“在”另一个元件“之上”时，它可以直接处于另一个元件上，或中间元件可以存在于它们之间。正如本文所用，术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合。

应当理解的是，尽管本文中可以使用术语第一、第二、第三等描述各种元件、组件、区域、层和/或部分，但这些元件、组件、区域、层和/或部分不应该受这些术语限制。这些术语仅用于将一个元件、组件、区域、层或部分与另一个元件、组件、区域、层或部分区分开。

正如本文所用，单数形式“一种”、“一个”和“该”旨在也包括复数形式，除非上下文另有明确指示。应该进一步理解的是，当在本说明书中使用时，术语“包括”和/或“包括了”、“包含”和/或“包含了”，以及“具有”和/或“具有了”，指定所述特征、区域、整数、步骤、操作、元件和/或组件的存在，但不排除一个或多个其他特征、区域、整数、步骤、操作、元件、组件和/或其组群的存在或添加。

此外，诸如“下部”或“底部”、“上部”或“顶部”、“内部”或“外部”等相关术语在此可以用于描述一个元件与另一个元件的关系，正如图中所示。应当理解的是，相关术语旨在涵盖该设备除了图中描绘的取向之外的不同取向。

除非另有定义，否则本文使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。还应理解的是，术语，诸如在常用词典中定义的术语应该解释为具有与其在相关技术和本公开的上下文中的含义一致的含义，而不应该被解释为理想化的或过于形式化的意义，除非在本文就此明确定义。

在本文中参考本发明的理想化实施方式而描述本发明的示例性实施方式。因此，可以预期的是，例如，由于制造技术和/或公差而导致的图示形状的变化。因此，本发明的实施方式不应该解释为限于本文中所示的区域的特定形状，而应该包括，例如，由制造引起的形状偏差。

本专利申请总体上描述具有带锌离子用于激活胰酶的抗癌和抗炎特性的胰酶。具体而言，本申请公开了带锌胰酶，其是已经带有锌离子的胰酶。此外，本申请公开了一种制备带锌胰酶的方法。该带锌胰酶已经证实会诱导滋养细胞和癌细胞的凋亡，而不影响正常细胞。因此，还公开了使用带锌胰酶治疗癌症和炎症的方法。

1.带锌胰酶

通常而言，无携带的胰酶不会表现出任何抗癌或抗炎反应。然而，一旦胰酶带有锌离子，胰酶开始表现出抗癌和抗炎行为。带锌胰酶通过在各种癌症和滋养细胞中诱导细胞凋亡而不影响正常细胞系以表现出抗癌特性。

第一种被探索的胰酶是淀粉酶，因为据发现淀粉酶在怀孕期间血浆中的含量很高。经测定，当淀粉酶带上锌离子时，带锌淀粉酶会诱导癌细胞和滋养细胞的细胞凋亡，从而表现出抗癌特性。

一旦确立带锌淀粉酶表现出抗癌特性，则其他胰腺酶也带上锌以确定所述其他胰酶在带锌时是否也表现出抗癌行为。据确定，其他胰酶，包括但不限于，胰蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶、胰凝乳蛋白酶和胰酶群(pancreatin)(各种胰酶的混合物)，在带上锌时均会诱导癌细胞凋亡。这一结果表明，由带锌胰酶诱导癌细胞凋亡是一种普遍存在的现象。这些胰酶需要带锌以激活其抗癌特性。

此外，据确定，这些带锌胰酶也表现出抗炎特性。带锌胰酶通过响应与小鼠体内注射脂质-多糖(LPS)而降低肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素8(IL-8)和白细胞介素6(IL-6)的分泌而表现抗炎特性。小鼠体内这些炎性免疫分子的减少间接表明，带锌胰酶除了观察到的抗癌特性外，还具有抗炎特性。

此外，这些胰酶带上锌不仅激活了胰酶的抗癌和抗炎特性，而且使带锌胰酶可以用于口服给药。这是因为一旦胰酶带上锌，胰酶表面就会出现“锌离子云”所致。该带锌胰酶表面上的锌离子云既保护胰酶免受胃酸性条件的影响，又有助于胰酶被胃肠道(GI)吸收。

具体而言，已知锌离子云中的锌通过以下化学反应而降解盐酸：Zn+2HCl→ZnCl₂+H₂。此外，胃中的消化酶(peptic enzyme)消化蛋白质需要胃的盐酸和酸性条件。因此，中和胃中盐酸的锌离子会既防止盐酸和消化酶被溶解，又防止胰酶被消化。因此，由于这种锌离子云，带锌胰酶能够在胃中存活。

一旦带锌胰酶通过胃进入胃肠道，锌离子云的存在进一步有助于胰酶吸收于血流中。锌离子云有助于肠道吸收胰酶的潜在原因是锌通过“锌转运蛋白”被肠道吸收，“锌转运蛋白”是一组肠绒毛中的锌结合蛋白。带锌胰酶的锌离子云可能与这些锌转运蛋白相互作用，从而将带锌胰酶从肠绒毛转运到血流中。因此，这些锌转运蛋白可以帮助带锌胰酶被肠道吸收，从而使大量的胰酶被血流吸收。

因此，带锌胰酶是可口服利用的，并且显示出抗癌和抗炎特性，从而使某些类型的癌症可以使用所公开的带锌胰酶进行治疗。

A.带锌淀粉酶

第一个研究诱导癌细胞和滋养细胞凋亡的胰酶是淀粉酶。具体而言，一旦使用本文公开的方法对淀粉酶进行带锌处理，就确定出带锌淀粉酶(1)在各种癌细胞和滋养细胞中诱导细胞凋亡而不影响正常细胞系，(2)降低HT-29细胞(结肠腺癌)中的PD-L1表达，(3)响应小鼠注射LPS而显著降低TNF-α、IL-8和IL-6的分泌，(4)下调癌基因C-Myc在HT-29细胞系中的表达，和(5)抑制乳腺癌在MDA-MB-23小鼠模型中的生长。这些测定结果中的每一个结合起来就表明带锌淀粉酶具有抗癌和抗炎活性。

首先，确定出了带锌淀粉酶在癌细胞和滋养细胞中诱导细胞凋亡而不影响正常细胞系。图1A-图1C(连同图1A-图1C)描绘了用三种不同组合物处理的滋养细胞细胞系(HTR-8)的Hoechst染色和荧光下观察的结果。图1A描绘了用Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)和锌培养12小时的HTR-8细胞。图1B描绘了用0.05mM带锌淀粉酶培养12小时的HTR-8细胞。图1C描绘了用0.05mM无携带淀粉酶培养12小时的HTR-8细胞。一旦将每个细胞系与各自的组合物一起培养12小时，就用Hoechst染料对细胞进行DNA染色并在荧光下检查。

正如图1A和图1C所示，用锌缓冲溶液(图1A)和无携带淀粉酶(图1C)培养的HTR-8细胞系没有表现出任何凋亡活性或其他活性。然而，用带锌淀粉酶培养的HTR-8细胞系，如图1B所示，则表现出DNA凝聚(condensation)、DNA断裂和新月形DNA，所有这些都是经历凋亡的细胞的典型形态。因此，图1A-图1C证实了正常锌组合物以及无携带淀粉酶对滋养细胞没有凋亡作用。然而，一旦淀粉酶带上锌，则所述带锌淀粉酶就会在滋养细胞细胞系中诱导细胞凋亡。

图2A-图2C(连同图2A-图2C)描绘了用三种不同组合物处理的HL-60细胞(人白血病细胞系)的Hoechst染色和荧光下观察的结果。图2A描绘了用Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)和锌培养12小时的HL-60细胞。图2B描绘了用0.05mM带锌淀粉酶培养12小时的HL-60细胞。图2C描绘了用0.05mM无携带淀粉酶培养12小时的HL-60细胞。一旦将每种HL-60细胞系与每种各自组合物培养12小时，就用Hoechst染料对细胞进行DNA染色并在荧光下检查。

正如图2A和图2C所示，用锌缓冲溶液(图2A)和无携带淀粉酶(图2C)培养的HL-60细胞系没有表现出任何凋亡活性或其他活性。然而，用带锌淀粉酶培养的HL-60细胞系，如图2B所示，则表现出DNA凝聚、DNA断裂和新月形DNA，所有这些都是经历凋亡的细胞的典型形态。因此，图2A-图2C证实了正常锌组合物以及无携带淀粉酶对癌细胞如HL-60细胞系没有凋亡作用。然而，一旦淀粉酶带上锌，则带锌淀粉酶就会在HL-60细胞系中诱导细胞凋亡。

图3A-图3D描绘了带锌淀粉酶对LNCaP癌细胞(前列腺癌)的凋亡作用。具体而言，图3A-图3B描绘了通过相差显微镜观察到的用两种单独组合物处理的LNCaP细胞。图3C-图3D描绘了用相同的两种组合物处理的LNCaP细胞的Hoechst染色和荧光下观察的结果。图3A和图3C描绘了用Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)和锌培养12小时的LNCaP细胞。图3B和图3D描绘了用0.05mM带锌淀粉酶培养12小时的LNCaP细胞。对于图3A和图3B，一旦将每种LNCaP细胞系与每种各自组合物培养12小时，就通过相差显微镜观察所述细胞系。对于图3C和图3D，一旦将每种LNCaP细胞系与每种各自组合物培养12小时，就用Hoechst染料对细胞进行DNA染色并在荧光下检查。

如图3A和图3C所示，用锌缓冲溶液培养的LNCaP细胞系没有表现出任何凋亡活性或其他活性。然而，用带锌淀粉酶培养的LNCaP细胞系，如图3B和图3D所示，被发现具有收缩和膜起泡，这是经历凋亡的细胞的另一种典型形态。因此，图3A-图3D证实了正常锌组合物对癌细胞如LNCaP细胞系没有凋亡作用。然而，一旦淀粉酶带上锌，带锌淀粉酶就会在LNCaP细胞系中诱导细胞凋亡。

对于其他癌细胞系也观察到类似的结果。如上所述，带锌淀粉酶在HL-60白血病细胞系和LNCaP前列腺癌细胞系中均诱导细胞凋亡。据类似观察，带锌淀粉酶也在HT-29细胞系(结肠腺癌)和Colo205细胞系(结肠癌)中诱导细胞凋亡。因此，该测定结果间接表明带锌淀粉酶能够在多种癌细胞系以及滋养细胞中诱导细胞凋亡。

接着，确定了带锌淀粉酶会降低PD-L1在HT-29癌细胞中的表达。在癌细胞上表达的PD-L1可以使T细胞失活，从而进而阻止T细胞攻击癌细胞。因此，降低癌细胞中PD-L1的活性可能会使癌细胞容易受到人体T细胞的攻击。

如图5所示，据观察，带锌淀粉酶以及带锌胰酶对HT-29癌细胞上的PD-L1表达有很强的抑制作用。图5描绘了比较用无携带淀粉酶对照、用带锌淀粉酶或用带锌胰酶处理的HT-29细胞中PD-L1表达的条形图。据观察，用对照处理的HT-29细胞表现出显著量的PD-L1表达。然而，用带锌胰酶处理的HT-29细胞的PD-L1表达降低了约42％，而用带锌淀粉酶处理的HT-29细胞的PD-L1表达降低到零。这一观察结果证实，给药带锌淀粉酶，以及带锌胰酶，如带锌胰酶，可以使癌细胞容易受到人体T细胞的攻击，从而使人体的免疫系统可能能够攻击和杀死癌细胞。该测定进一步支持了带锌淀粉酶和其他带锌胰酶的抗癌活性。

接着，如下文关于小鼠测试和图6A-图6C所讨论，还观察到带锌淀粉酶会显著降低小鼠体内TNF-α、IL-8和IL-6的分泌，间接表明带锌淀粉酶具有抗炎特性。具体而言，据观察，小鼠注射LPS诱导炎症后，当小鼠喂食含锌淀粉酶时，小鼠体内TNF-α、IL-8和IL-6的水平显著降低。

正常情况下，并正如对照中所见，TNF-α、IL-8和IL-6是作为对体内炎症的免疫反应而产生的。然而，当小鼠被给予带锌淀粉酶然后注射LPS时，TNF-α、IL-8和IL-6的量显著降低。该观察结果间接表明，带锌淀粉酶还具有抗炎活性以及所观察到的抗癌活性。

接着，类似地观察到带锌淀粉酶进一步在HT-29细胞系中致癌基因C-Myc表达的下调中起作用。C-Myc致癌基因的突变可能导致正常细胞癌变。因此，如果癌细胞系中C-Myc的量减少，则可以间接表明具有抗癌活性。在本文中，当具有C-Myc致癌基因的HT-29细胞与带锌淀粉酶培养时，观察到HT-29癌细胞系中C-Myc的量显著减少。因此，这一观察结果进一步支持了带锌淀粉酶具有抗癌活性。

最后，据观察，带锌淀粉酶会抑制小鼠乳腺癌的生长。虽然该测试将在以下实施例中详细讨论，但据观察，当将带锌淀粉酶注射到小鼠中时，MDA-MB-23小鼠模型中乳腺癌肿瘤的肿瘤体积受到显著抑制。该观察结果进一步支持带锌淀粉酶具有抗癌活性。

这些观察结果中的每个一起表明，一旦淀粉酶带上锌离子，带锌淀粉酶就会具有激活的抗癌和抗炎性能。因此，带锌淀粉酶可以用作癌症治疗或炎症治疗。

B.带锌胰蛋白酶

另一种确定诱导癌细胞和滋养细胞凋亡的胰酶是胰蛋白酶。无携带胰蛋白酶没有任何抗癌活性，并且不会诱导癌细胞或滋养细胞的细胞凋亡。然而，一旦胰蛋白酶带上锌离子，则带锌胰蛋白酶开始在癌细胞系中表现出凋亡活性，间接表明这种带锌胰酶具有抗癌活性。

如图15-图16所示，带锌胰蛋白酶在HT-29癌细胞和胎盘细胞中都表现出凋亡活性，而无携带胰蛋白酶则没有表现出任何凋亡活性。图15描绘了显示用无携带胰蛋白酶相对于带锌胰蛋白酶处理时HT-29癌细胞中的凋亡百分比的条形图。用无携带胰蛋白酶和带锌胰蛋白酶对HT-29细胞以五种不同浓度培养12小时，而确定HT-29癌细胞的凋亡百分比。如图15所示，没有一种浓度的无携带胰蛋白酶在HT-29癌细胞中会产生任何显著的细胞凋亡。然而，以0.34μM和更高的浓度，在HT-29癌细胞中就观察到由带锌胰蛋白酶诱导的100％细胞凋亡。该观察结果进一步表明带锌胰蛋白酶含有抗癌活性。

图16显示了显示用无携带胰蛋白酶处理相对于带锌胰蛋白酶处理时胎盘细胞的凋亡百分比的条形图。无携带胰蛋白酶和带锌胰蛋白酶与胎盘细胞以五种不同浓度培养而确定胎盘细胞中凋亡的百分比。如图16所示，没有一种浓度的无携带胰蛋白酶在胎盘细胞中产生任何显著的凋亡活性。然而，在0.10μM或更高的浓度下，观察到由带锌胰蛋白酶在胎盘细胞中诱导的细胞凋亡。带锌胰蛋白酶浓度越大，对胎盘细胞的细胞凋亡作用越大，当给予0.40μM的带锌胰蛋白酶时测量到100％的细胞凋亡。这一观察结果进一步表明带锌胰蛋白酶会诱导滋养细胞的细胞凋亡，进一步表明带锌胰蛋白酶具有抗癌活性。

正如以下关于人唾液测试的讨论，对带锌胰蛋白酶进行的人类受试者测试进一步证实了带锌胰蛋白酶含有抗癌活性。HT-29癌细胞系和BXPC3癌细胞系(胰腺癌)具有由单剂量的带锌胰蛋白酶诱导的细胞凋亡。此外，在给予单剂量带锌胰蛋白酶的受试者的唾液中观察到这种凋亡活性，间接表明带锌胰蛋白酶的抗癌活性也可以口服。

C.其他带锌胰酶

与带锌淀粉酶和带锌胰蛋白酶类似，一旦这些其他胰酶带有锌，则其他胰酶就能够在HT-29癌细胞系中诱导细胞凋亡。为了确定这些其他胰酶在HT-29癌细胞系中诱导细胞凋亡的能力，测量了每种带锌胰酶的IC50活性。IC50是一种定量测量，会指示需要多少具体抑制物质以将给定生物过程或生物组分抑制50％。

具体的带锌胰酶对诱导HT-29细胞系凋亡的IC50活性如下：α-淀粉酶(IC50＝0.12μM)；胰蛋白酶(IC50＝0.1μM)；弹性蛋白酶(IC50＝1.1μM)；羧肽酶(IC50＝1.8μM)；胰凝乳蛋白酶(IC50＝1.0μM)和胰岛素(IC50＝40nM)。

这些发现间接表明，带锌胰酶诱导癌细胞凋亡是一种普遍存在的现象，进一步支持了带锌胰酶可以用作抗癌药物的观点。

2.制备带锌胰酶的方法

本文还公开了一种制备带锌胰酶的方法。制备带锌胰酶的通用方法包括(1)将胰酶与螯合剂一起培养，(2)将步骤1的混合物用锌化合物培养，从而产生带锌离子的胰酶，(3)从步骤(2)得到的溶液中分离出带锌胰酶，和(4)干燥所述带锌胰酶化合物。步骤(3)中的分离可以通过用去离子水透析所述溶液以辅助从步骤(2)的溶液中分离出带锌胰酶而完成。另外，步骤(4)中的干燥可以通过冻干而完成。虽然透析和冻干是分离和干燥带锌胰酶的优选方法，但可以使用分离和干燥带锌胰酶的其他方法而不背离本文公开的概念。

在一个优选的实施方式中，该螯合剂可以是乙二胺四乙酸(“EDTA”)。在其他实施方式中，其他螯合剂，包括但不限于，二硫醇、二巯基琥珀酸(“DMSA”)和依他酸(egtazicacid)(“EGTA”)，在不背离本文公开的概念的情况下，都可以将其用作螯合剂。

在一个优选的实施方式中，锌化合物是乙酸锌。在其他实施方式中，其他锌化合物，包括但不限于，氧化锌、硫酸锌和硝酸锌，都可以用作锌化合物。任何锌化合物都可以使用，只要该化合物能够产生锌离子而使胰酶带锌。

上述方法的一个优选实施方式包括以下步骤：(1)将胰酶与螯合剂培养至少1小时；(2)将步骤1所得溶液用锌化合物培养2-3小时；(3)将步骤2得到的溶液用去离子水透析3小时；(4)将步骤3得到的溶液通过冻干进行干燥。在该优选实施方式中，该方法可以从0.6mM的胰酶开始，螯合剂可以是5mM ETDA，并且锌化合物可以是50mM乙酸锌。一旦遵循这些步骤，结果将是一种可以用于治疗癌症和/或炎症的带锌胰酶。

上述方法是对胰酶进行一般性描述，因为任何胰酶都可以使用上述方法而带锌。此外，如上所述，每种胰酶一旦通过上述方法带上锌，就表现出抗癌细胞的凋亡活性。

3.使用带锌胰酶治疗癌症和炎症的方法

由于这些带锌胰酶已被证明具有抗癌和抗炎活性，还公开了一种使用带锌胰酶治疗癌症和炎症的方法。使用带锌胰酶治疗癌症的方法包括通过将带锌胰酶给药于癌细胞而诱导癌细胞凋亡。使用带锌胰酶治疗炎症的方法包括通过向发炎细胞给药带锌胰酶而减轻炎症。在该方法中，任何带锌胰酶都可以通过上述方法用于治疗癌症或炎症。

4.小鼠抗癌和抗炎活性测试

在对小鼠进行的测试中观察到带锌胰酶的抗癌和抗炎活性。以下对小鼠进行的这些测试的描述进一步表明了带锌胰酶的抗癌和抗炎活性。对于小鼠的测试，主要使用了带锌淀粉酶。然而，基于对其他带锌胰酶的上述观察，预期这些带锌淀粉酶的结果将代表一旦带锌的其他胰酶。

图4描绘了显示取自喂食带锌淀粉酶的小鼠的胰腺提取物的细胞凋亡活性的图。在该测试中，小鼠口服0.2mg带锌淀粉酶7天。7天后，从每只小鼠收集胰腺匀浆。然后将胰腺匀浆以不同浓度置于HT-29癌细胞上，并在24小时的培养时间内记录细胞凋亡的百分比。胰腺匀浆的浓度为3.6μL、10μL和15μL。该测试的对照遵循相同的方案，除了给小鼠喂食无携带淀粉酶7天代替带锌淀粉酶。

如图4所示，对照胰腺匀浆在HT-29癌细胞中没有表现出任何凋亡活性。这是预期的，因为无携带淀粉酶没有任何抗癌活性。然而，随着浓度增加，观察到带锌淀粉酶的凋亡活性水平增加。较低剂量的3.6μL胰腺匀浆显示出高达40％的细胞凋亡活性，在14小时时达到该水平。中等剂量的10μL胰腺匀浆显示出高达50％的细胞凋亡活性，在14小时时也达到了这一水平。更高剂量的20μL胰腺匀浆显示高达70％的细胞凋亡活性。这种较高剂量似乎在24小时时还未达到峰值，因为细胞凋亡的百分比在24小时时没有与3.6μL和10μL剂量一样趋于平缓(level out)。因此，假使20μL剂量允许与HT-29细胞一起培养超过24小时，预期将观察到大于70％的进一步凋亡活性。

来自图4的发现和观察结果证实了与带锌胰酶如带锌淀粉酶的抗癌活性相关的多种理论。首先，这些观察结果表明，带锌淀粉酶在胰腺中具有生物分布，因为从小鼠中提取的胰腺匀浆在HT-29癌细胞系中产生了凋亡活性。如果带锌淀粉酶没有被生物分布到小鼠的胰腺中，则预期不会具有这种凋亡活性。接着，这些观察结果证实，从喂食带锌淀粉酶7天的小鼠中提取的胰腺匀浆具有抗癌性能，因为它们能够诱导HT-29细胞凋亡。最后，这些观察结果表明，带锌淀粉酶的抗癌性能是剂量依赖性的，因为较高浓度的胰腺匀浆会导致HT-29细胞凋亡百分比更高。这些发现一起进一步证实了一旦带锌的胰酶的抗癌活性。

图8进一步证实了以上讨论的图4的发现。图8描绘了显示胰腺中带锌淀粉酶的体内活性的条形图。对于该测试，小鼠口服含锌淀粉酶或对照长达三天。对于该测试，对照是无携带淀粉酶。一旦给小鼠喂食完这两种单独的组合物，就从小鼠中提取胰腺提取物，并评价HT-29细胞的凋亡活性。

如图8所示，带锌淀粉酶在HT-29细胞上诱导100％的细胞凋亡，而对照对HT-29细胞仅产生7％的细胞凋亡活性。该测试进一步证实了图4的发现，即，带锌淀粉酶被生物分布到胰腺，并且含有带锌淀粉酶的胰腺提取物具有抗癌活性。

支持带锌淀粉酶的抗癌活性的最后测试显示于图9中。图9描绘了显示MDA-MB-23小鼠模型中乳腺癌生长抑制的线图。具体而言，图9显示了在十二天的跨度内对照相对于“区域2”实验组中的肿瘤体积的比较。对照小鼠每只小鼠注射1.5mg无携带淀粉酶，而“区域2”实验组小鼠每只小鼠注射1.5mg带锌淀粉酶。

如图9所示，给予对照的小鼠没有观察到任何对乳腺癌生长的抑制。到研究的第10天，对照小鼠的乳腺癌肿瘤体积增加到超过600mm³，到第12天达到最大值，接近800mm³。然而，注射了带锌淀粉酶的小鼠的乳腺癌生长受到显著抑制，在相同的十天期内，乳腺癌肿瘤体积从未超过200mm³。因此，据观察，带锌淀粉酶能够抑制小鼠乳腺癌的生长，进一步证实了带锌胰酶如带锌淀粉酶的抗癌活性。

此外，对小鼠的测试还表现出带锌胰酶的抗炎活性。图6A-图6C(连同图6A-图6C)显示了带锌淀粉酶对小鼠血清中IL-6、IL-8和TNF-α水平的影响。对此测试，小鼠喂食0.26mg带锌淀粉酶，持续7天。在第8天，给小鼠注射1mg LPS而诱导炎症。喂食无携带淀粉酶的对照小鼠也注射了1mg LPS诱导炎症。注射后2小时，从对照小鼠和喂食带锌淀粉酶的小鼠收集血清，并使用标准ELISA试剂盒比较IL-6、IL-8和TNF-α水平。

如图6A所示，与对照相比，喂食带锌淀粉酶的小鼠血清中的TNF-α水平显示出TNF-α水平降低84％。如图6B所示，与对照相比，喂食带锌淀粉酶的小鼠血清中的IL-8水平显示出IL-8水平降低28％。如图6C所示，喂食带锌淀粉酶的小鼠血清中的IL-6水平与对照相比表现出IL-6水平降低了61％。因此，与对照相比，这些化合物水平的显著降低表明带锌淀粉酶具有抗炎活性以及抗癌活性。

这些关于带锌胰酶的抗炎活性的观察结果进一步通过图10A-图10C(连同图10A-图10C)和图11A-图11B(连同图11A-图11B)证实。图10A-图10C和图11A-图11B各自显示了带锌胰酶对血清和肺组织中IL-6、IL-8和TNF-α水平的影响。这些测试的方案是一致的。每组小鼠要么给药带锌淀粉酶、带锌胰酶，要么不给药胰酶作为对照。对于接受带锌淀粉酶的小鼠，每只小鼠给药0.5mg带锌淀粉酶，持续三天。对于接受带锌胰酶的小鼠，每只小鼠给药0.66mg带锌胰酶三天。对照小鼠未给予任何一种胰酶。之后，对每组小鼠(包括对照)给药1mg/kg LPS。两小时后，从小鼠收集血清或肺组织而测定IL-6、IL-8和TNF-α的水平。

首先，图10A-图10C描述了在给药对照、带锌淀粉酶或带锌胰酶后小鼠血清中IL-6、IL-8和TNF-α的水平。如图10A所示，与对照相比，带锌淀粉酶使小鼠血清中的IL-6水平降低了49％。如图10B所示，与对照相比，带锌淀粉酶将小鼠血清中的IL-8水平降低了28％。然而，在该测试中，带锌胰酶对IL-8的水平没有任何影响。如图10C所示，与对照相比，带锌淀粉酶和带锌胰酶将小鼠血清中的TNF-α水平分别降低了95％和72％。因此，该测试表明带锌淀粉酶能够降低受试者的IL-6、IL-8和TNF-α水平，从而证实了带锌淀粉酶的抗炎活性。带锌胰酶不能有效降低小鼠血清中的IL-6或IL-8水平，但会有效降低TNF-α水平。这进一步表明其他带锌胰酶也能够具有抗炎活性。

图11A-图11B描述了在给药对照、带锌淀粉酶或带锌胰酶后小鼠肺组织中IL-6和IL-8的所得水平。如图11A所示，与对照相比，带锌淀粉酶将小鼠肺组织中的IL-6水平降低了36％。如图11B所示，与对照相比，带锌淀粉酶使小鼠肺组织中的IL-8水平降低了17％。然而，在该测试中，带锌胰酶对肺组织中的IL-8水平没有任何影响。因此，该测试表明，带锌淀粉酶能够降低肺组织中的IL-6和IL-8水平，同时证实了对小鼠血清的测试结果。

总体而言，图10A-图10C和图11A-图11B都表明带锌胰酶能够减少负责炎症免疫反应的分子，从而提供抗炎活性。因此，这项对小鼠血清和肺组织的测试证实了带锌胰酶的抗炎活性。

5.人唾液抗癌活性测试

在口服摄入带锌胰酶后对人体唾液进行的测试也证明了这些胰酶在带锌之后的抗癌活性和口服有效性。对于每个这些对人类受试者的测试，人类受试者摄入了一种带锌胰酶，并在摄入后的不同时间段收集唾液。然后将唾液样品置于HT-29癌细胞上，并在HT-29癌细胞用唾液培养后评价细胞凋亡活性。最终，这些测试表明，带锌胰酶具有能够在唾液中检测到的口服生物利用度，进一步证实了这些带锌胰酶的抗癌活性。

图7描绘了显示用在摄取带锌淀粉酶后不同时间收集的唾液培养后的HT-29细胞中的凋亡活性百分比的线图。对于该测试，人类受试者摄入了200mg带锌淀粉酶。在摄入后4小时、6小时、9小时、12小时、15小时、18小时、24小时和27小时之时收集人类受试者的唾液。然后将唾液样品置于HT-29癌细胞上，将唾液样品与HT-29癌细胞一起培养20小时后评价凋亡活性。如图7所示，摄入后第9小时采集的唾液样本诱导了HT-29癌细胞100％凋亡。因此，图7表明带锌淀粉酶具有在唾液中能够检测到的口服生物利用度，在摄入后9小时检测到唾液中的峰值活性。这项人体研究进一步证实了带锌胰酶，特别是带锌淀粉酶的抗癌活性。

图17所示的测试进一步证实了这一观察结果，图17描绘了用口服全蛋白带锌淀粉酶的人类受试者的唾液培养的HT-29癌细胞的凋亡百分比。对于该项特定测试，将25mg全蛋白带锌淀粉酶(IC50＝25nM)以单剂量给药于人类受试者，并在摄入后3-、6-、9-、12-、15-、18-、21-和23-小时之时采集唾液样本。然后通过将每个唾液样品与HT-29细胞一起培养6小时、8小时、10小时或12小时而测试每个唾液样品的HT-29凋亡活性。

如图17所示，唾液样品在所有四个培养时间都表现出一定的凋亡活性。培养6小时的唾液样品仅显示出轻微的细胞凋亡活性，在摄入后6小时、9小时和15小时之时的唾液样品具有峰值细胞凋亡活性。虽然这些测试中显示出最低限度的细胞凋亡活性，但人类受试者唾液中存在任何细胞凋亡活性这一事实表明带锌淀粉酶含有一些抗癌活性。然而，与HT-29癌细胞培养8-、10-和12-小时的唾液样品均显示出显著的凋亡活性，其中12小时培养显示出HT-29癌细胞100％凋亡。此外，虽然8小时和10小时的培养时间没有像12小时培养那样达到HT-29癌细胞100％凋亡，但这两个培养时间显示出由HT-29细胞中显著的细胞凋亡百分比所致的显著细胞收缩(shrinkage，萎缩)。这对于摄入后15-小时收集的唾液尤为普遍。因此，该数据证实了带锌淀粉酶的抗癌活性，以及带锌淀粉酶在摄入后唾液中的口服生物利用度。

对于其他带锌胰酶(即带锌胰蛋白酶)进行了进一步的人体测试，以确定这种抗癌活性是否在所有一旦带锌的胰蛋白酶中普遍存在。图12-图14描绘了人类唾液中全蛋白带锌胰蛋白酶在摄入后的细胞凋亡活性的测试结果。对于这些测试，人类受试者摄入了全蛋白带锌胰白酶，并在摄入后的不同时间段收集唾液。将唾液样品浓缩10倍，然后置于HT-29癌细胞和BXPC3癌细胞上，在癌细胞与唾液一起培养后评价凋亡活性。此外，收集的一些唾液也进行浓缩，然后与HT-29癌细胞一起培养，以确定摄入后不同时间段的凋亡活性水平。最终，这些测试表明，不仅带锌淀粉酶，而且带锌胰蛋白酶等其他带锌胰酶也具有在唾液中能够检测到的口服生物利用度，进一步证实了带锌胰酶的一般抗癌活性。

与图17一样，图12和图13描绘了用人类受试者的唾液培养的HT-29癌细胞和BXPC3癌细胞的凋亡百分比，该人类受试者进行了口服给药全蛋白带锌胰蛋白酶。对于该项特定测试，将50mg全蛋白带锌淀粉酶(IC50＝50nM)以单剂量给药于人类受试者，并在摄入后3-、6-、9-、12-、15-、18-和21-小时时采集唾液样品。将这些唾液样品每个都浓缩10倍，然后通过将每个唾液样品与HT-29细胞培养6小时、8小时、12小时、13小时或24小时测试HT-29细胞凋亡活性。还通过将每个唾液样品与BXPC3细胞一起培养6小时、8小时、12小时或13小时而测试这些唾液样品每个的BXPC3细胞凋亡活性。

如图12所示，唾液样品在HT-29癌细胞的所有5个培养时间都表现出一定的凋亡活性。培养6小时的唾液样品显示出高达20％的细胞凋亡活性，对于21-小时摄入后唾液样品具有峰值细胞凋亡活性。培养8小时的唾液样品显示出与培养6小时的样品几乎相同的细胞凋亡活性。培养12小时和13小时的样品也显示出显著的细胞凋亡活性，在18-小时摄入后唾液以高于50％的细胞凋亡活性达到峰值。培养24小时的样品在HT-29细胞中显示出近100％的凋亡活性，摄入后唾液样品在18小时之时也达到峰值。因此，与先前的测试数据一样，人类受试者唾液中存在HT-29细胞的凋亡活性这一事实表明，带锌胰蛋白酶以及所有其他带锌胰酶都具有抗癌活性。这仅通过对于与HT-29细胞培养24小时的唾液接近100％的细胞凋亡活性进一步证实。

如图13所示，唾液样品对BXPC3癌细胞的所有四个培养时间也表现出一定的凋亡活性。培养6小时的唾液样品显示出略高于20％的细胞凋亡活性，21-小时摄入后的唾液样品具有峰值细胞凋亡活性。培养8小时的唾液样品显示出与培养6小时的样品几乎相同的细胞凋亡活性，其中峰值细胞凋亡发生于18-小时摄入后唾液样品中。培养12和13小时的样品也显示出显著的细胞凋亡活性，18-小时摄入后唾液样品以60％细胞凋亡达到峰值。在本文中，BXPC3细胞的培养时间不能超过13小时，因为BXPC3细胞不再健康，无法进行测试。

然而，由于来自图12的HT-29细胞系的凋亡活性百分比与来自图13的BXPC3细胞系在6-、8-、12-和13-小时培养时间的凋亡活性非常相似，预期如果将样品培养24小时，它在BXPC3细胞中也会显示出近100％的凋亡活性，对于摄入后唾液样品，也可能在18小时达到峰值。此外，图12和图13都显示出更长培养时间导致更高细胞凋亡率。

图14所示的图进一步证实了18-小时或更长时间摄入后采集的唾液样品中的强凋亡活性。图14描绘在摄入带锌胰蛋白酶后3小时、6小时、9小时、12小时、15小时、18小时和21小时之时采集的唾液样品，浓缩10倍，并用HT-29细胞培养6小时而确定每个唾液样品的凋亡活性。最初，采集了100μL唾液样品，然后浓缩至10μL，然后与HT-29细胞一起培养。

图14中描绘的结果表明，在摄入带锌胰蛋白酶后3小时、6小时、9小时和12小时收集的唾液样品没有细胞凋亡活性。然而，唾液中的凋亡活性在摄入后15小时开始增加，约45％的凋亡活性。最终，唾液样品在摄入后18小时收集，随后对HT-29细胞表现出100％的凋亡活性。这一发现与图12和图13以及图17中的发现一致，每个都显示出最小的细胞凋亡活性，直至在摄取带锌胰酶后15小时采集的唾液样品，而在15-或18-小时或更晚摄取后时间点时测量到峰值细胞凋亡活性。

因此，这些对人受试者的测试进一步表明，带锌胰酶能够诱导各种癌细胞系中的细胞凋亡。这些测试已经证实，带锌淀粉酶和带锌胰蛋白酶都具有抗HT-29癌细胞系和BXPC3癌细胞系的抗癌活性。此外，这些测试证实，带锌胰酶具有口服生物利用度，因为带锌胰酶能够存活于胃的酸性条件之下，并会通过GI道吸收到体内和血流中。因此，这些发现进一步证实，胰酶一旦带有锌，就具有口服生物利用度和抗癌活性，并可以用于治疗癌症。

Claims (20)

1.一种在受试者的癌细胞中诱导细胞凋亡的方法，包括：

向所述受试者给予带锌胰酶，其中所述带锌胰酶的所述给予在所述癌细胞中诱导细胞凋亡。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述带锌胰酶是带锌淀粉酶。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述带锌胰酶是带锌胰蛋白酶。

4.根据权利要求1所述的方法，其中口服给予所述带锌胰酶。

5.一种制备带锌胰酶的方法，所述方法包括：

(1)用螯合剂培养胰酶；

(2)将步骤(1)所得的混合物与锌化合物一起培养，其中所述胰酶带有锌离子，从而形成所述带锌胰酶；和

(3)从步骤(2)的所得混合物中分离所述带锌胰酶。

6.根据权利要求5所述的方法，还包括：

(4)干燥所述带锌胰酶。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述胰酶是淀粉酶。

8.根据权利要求5所述的方法，其中所述胰酶是胰蛋白酶。

9.根据权利要求5所述的方法，其中通过透析完成所述带锌胰酶的所述分离。

10.根据权利要求6所述的方法，其中通过冻干完成所述带锌胰酶的所述干燥。

11.根据权利要求5所述的方法，其中所述螯合剂是乙二胺四乙酸。

12.根据权利要求5所述的方法，其中所述锌化合物是乙酸锌。

13.一种由权利要求5所述的方法制备的组合物，包含：

带锌胰酶。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述带锌胰酶能够治疗癌症。

15.根据权利要求13所述的组合物，其中所述带锌胰酶能够治疗炎症。

16.根据权利要求13所述的组合物，其中所述带锌胰酶是带锌淀粉酶。

17.根据权利要求13所述的组合物，其中所述带锌胰酶是带锌胰蛋白酶。

18.根据权利要求14所述的组合物，其中所述带锌胰酶是带锌淀粉酶。

19.根据权利要求14所述的组合物，其中所述带锌胰酶是带锌胰蛋白酶。

20.根据权利要求13所述的组合物，其中所述带锌胰酶能够口服给予。

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