CN115491379A - 一种促进微生物镉积累的基因BrMYB116及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种促进微生物镉积累的基因BrMYB116及其应用。所述基因BrMYB116的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了含有促进微生物镉积累的基因BrMYB116的表达载体和转基因酵母菌及其构建方法。本发明提供了一种具有增加微生物镉吸收积累的编码基因，该基因在酵母菌中过量表达可明显增加转基因酵母菌细胞中镉的含量，镉处理后转基因酵母菌中的镉含量比以普通酵母菌为对照提高了34.5％，在重金属镉胁迫下转基因酵母菌中镉的吸收速度明显高于普通酵母菌，该转基因酵母菌可以用于镉污染土壤的生物修复。

Description

一种促进微生物镉积累的基因BrMYB116及其应用
技术领域
本发明涉及一种促进微生物镉积累的基因BrMYB116及其应用，属于植物基因工程领域。
背景技术
近年来，由于农药、化肥等农业化学品的不合理施入，重金属污染物在耕地、设施农业用地土壤中积累的数量逐年增加，给农业安全生产带来了严重的威胁。重金属污染具有隐蔽性、长期性和不可逆性，与农药残留相比，其严重性尚未引起高度关注。蔬菜重金属镉的污染及对人类的危害也逐步进入人们的视野。镉是对蔬菜污染最强的重金属之一。在自然界中，镉多以离子状态存在，大多数镉化合物易溶于水，很容易被蔬菜吸收，从而通过食物链严重影响人类的健康。镉被世界卫生组织列为Ⅰ类致癌物，是土壤重金属污染的主要元素，全国点位超标率达到7.0％，远高于其它被测无机污染物。
大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)起源于中国，是我国的特产蔬菜。目前，韩国、日本等国家种植的大白菜最早是由我国传入的。长期以来，大白菜一直是我国和东亚国家的骨干蔬菜，其重要地位和生产面积是其它蔬菜难以相比的。随着土壤重金属污染的加剧，大白菜镉超标也愈发严重。大白菜的镉超标直接影响大白菜的出口创汇，制约蔬菜产业的绿色发展。因此，解析大白菜降低镉吸收的机制变得越来越重要。
根据近二十年国内外发表的上百篇与植物重金属污染相关的文献报道，防控蔬菜镉污染的措施包括三个方面：(1)选择性种植对镉吸收、富集能力弱的蔬菜品种；(2)从污染源方面考虑采取相应措施避免镉污染的发生，如合理施用化肥，尽量多施用无害的有机肥料等；(3)生物修复，利用特定的动、植物或微生物吸收或钝化镉。与另外两种方法相比，生物修复能够达到净化土壤或钝化土壤中镉的目的，可以有效处理已经产生镉污染的土壤，适用范围更广，具有较大的潜在价值。面对日益严重的重金属土壤污染问题，寻找重金属超积累的生物修复基因并阐明其功能对于我国重金属污染的治理和修复具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种促进微生物镉积累的基因BrMYB116及其应用。为培育用于生物修复的动、植物或微生物品种提供依据。
本发明的技术方案如下：
一种促进微生物镉积累的基因BrMYB116，所述基因BrMYB116的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
一种含有促进微生物镉积累的基因BrMYB116的表达载体。
根据本发明优选的，所述表达载体的构建方法包括步骤如下：
(1)从大白菜中提取RNA，然后对RNA进行反转录得到cDNA；
(2)以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增得到基因BrMYB116序列，PCR引物序列如下：
Forward primer：5′-ATGTCAAATATAATGAAGAAGAGGT-3′，
Reverse primer：5′-CTAATTAAAAGGTGCGTACTCCTCA-3′；
(3)将基因BrMYB116序列连接至pRS416质粒，得到基因BrMYB116的表达载体。
上述促进微生物镉积累的基因BrMYB116在促进酵母菌镉积累中的应用。
根据本发明优选的，所述应用的途径包括：将含基因BrMYB116的表达载体转化进微生物基因组。
一种含有上述促进微生物镉积累的基因BrMYB116的转基因酵母菌。
有益效果：
本发明提供了一种具有增加微生物镉吸收积累的编码基因，该基因源自于大白菜植株，构建该基因的表达载体，利用该表达载体转化酵母菌，最终获得转基因酵母菌。该基因在酵母菌中过量表达可明显增加转基因酵母菌细胞中镉的含量，镉处理后转基因酵母菌中的镉含量比以普通酵母菌为对照提高了34.5％，在重金属镉胁迫下转基因酵母菌中镉的吸收速度明显高于普通酵母菌，该转基因酵母菌可以用于镉污染土壤的生物修复。
附图说明：
图1为转基因BrMYB116的酵母菌和JRY472酵母菌含有CdCl2(50μM)的SC固体筛选培养基和正常SC固体筛选培养基上生长结果图。
图中的三角符号表示镉离子以10倍浓度的递减。
图2为转基因BrMYB116的酵母菌和JRY472酵母菌在含有CdCl2(50μM)YPDA液体培养基上生长结果图。
图3为转基因BrMYB116的酵母菌和JRY472酵母菌在含有CdCl2(50μM)YPDA液体培养基上生长后细胞中Cd含量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
实施例中所述JRY472酵母菌在文献A Mitochondrial Pyruvate CarrierRequired for Pyruvate Uptake in Yeast,Drosophila,and Humans，2012中已经公开。
实施例1
1、从大白菜中提取RNA，具体方法如下：
液氮预冷研钵，称取2g大白菜“广东早”叶片，加入10mL液氮迅速研磨，转入1.5mL离心管中，加入l mL Trizol混匀后，在25℃下放置5min，使其充分裂解；在4℃，12000rpm下离心5min，弃沉淀取上清；向上清液中加入200μL氯仿，震荡混匀后在25℃放置15min；在4℃，12000rpm下离心5min，吸上层水相至另一离心管中，加入500μL异丙醇，在25℃放置10min；在4℃，12000rpm下离心10min，弃上清，总RNA沉于管底。向沉淀中加入1mL的75％的乙醇，温和颠倒洗涤；在4℃，8000rpm下离心5min，弃上清，将沉淀在25℃下晾干用50μL的DEPC处理的ddH2O溶解总RNA样品，制备好的总RNA样品在-80℃超低温冰柜中保存备用。
2、反转录PCR
对总RNA样品为模板进行反转录PCR扩增(两步法)，具体反转录PCR扩增体系和条件如下：
Step1：
Figure BDA0003671820620000031
反应条件：42℃温浴2min，4℃保存。
Step2：
Figure BDA0003671820620000041
反应条件：37℃温浴15min，85℃反应5s。
通过以上方法得到大白菜总cDNA，Step1和Step2中的试剂来自于TAKALA公司的PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒。
实施例2
1、构建含BrMYB116基因序列的表达载体，具体方法如下：
(1)以大白菜总cDNA为模板进行PCR扩增，扩增得到基因BrMYB116序列，所述PCR扩增的引物如下：
Forward primer：5′-ATGTCAAATATAATGAAGAAGAGGT-3′，
Reverse primer：5′-CTAATTAAAAGGTGCGTACTCCTCA-3′；
所述PCR体系如下：
Figure BDA0003671820620000042
所述PCR条件如下：预变性，98℃，30s；变性，98℃，10s；退火，60℃，30；延伸，72℃，1min(35个循环)；终止延伸，72℃，10min；最后4℃保温。
(2)采用限制性内切酶BamH1对pRS416质粒(含pGPD启动子)进行酶切，用同源重组酶(In-Fusion)将基因BrMYB116序列连接至pRS416质粒中，得到基因BrMYB116的表达载体；
所述连接体系如下：
Figure BDA0003671820620000051
连接反应条件：50℃，15min；4℃保存。
2、转基因酵母菌的制备
沾取-80℃中储存的JRY472酵母菌原液在YPDA固体培养基上划线，30℃倒置培养4天；挑取JRY472酵母菌单菌落至5mL的YPDA液体培养基中，在30℃，250rpm摇床上培养10h；取3mL的JRY472酵母菌菌液至50mL的YPDA液体培养基中扩大培养，在30℃，250rpm摇床上培养至OD600≤0.5；然后将JRY472酵母菌菌液在3000rpm，25℃下离心8min，除去上清，用无菌水重悬；继续在3000rpm，25℃下离心3min，用无菌水重悬；继续在6000rpm，25℃下离心2min，除去上清，用TE-LiAC缓冲液重悬；继续在6000rpm，25℃，离心2min，除去上清，用TE-LiAC溶液重悬；吸取100μL重悬液，与2μL的载体DNA(100℃加热5min，冰上放置，重复两次)和10μL的基因BrMYB116的表达载体混合，混匀，25℃放置10min；加入260μL浓度为40％的PEG/TE-LiAC溶液，混匀，在30℃下水浴1h，加入43μL，37℃预热的DMSO，混匀，42℃热激5min，将热激后的混合液12000rpm下离心30s，用无菌水重悬；将重悬后的溶液在12000rpm下离心30s，用的无菌水重悬，取100μL的重悬液涂于SC固体筛选培养基上，在30℃下倒置培养6天，得到转基因BrMYB116的JRY472酵母菌。
实施例3
1、挑取实施例2中转基因BrMYB116的酵母菌单菌落至5mL的SC液体筛选培养基中，分散混匀，在250rpm，30℃，摇床培养10h至OD600>0.3，得到转基因BrMYB116的酵母菌菌液。将转基因BrMYB116的酵母菌菌液稀释至OD600＝0.1，在250rpm，30℃，继续摇床培养6h，然后将转基因BrMYB116的酵母菌菌液稀释至OD600＝0.3，以此转基因BrMYB116的酵母菌菌液为母液。将母液分别稀释到1/10，1/100，1/1000倍的浓度梯度。将正常JRY472酵母菌菌液培养至OD600＝0.3，按照同样的比例进行稀释。
各取3μL母液、梯度稀释母液，并将正常JRY472酵母菌菌液、正常JRY472酵母菌菌液梯度稀释液为对照，分别滴至含有CdCl2(50μM)的SC固体筛选培养基和正常SC固体筛选培养基上，在30℃倒置培养4天，结果如图1所示。
由图1可知，基因BrMYB116在酵母固体培养基上可以显著降低酵母抗镉的能力。
2、将实施例2中转基因BrMYB116的酵母菌和正常JRY472酵母菌分别接种至YPDA液体培养基中，在250rpm，30℃，摇床培养至OD600＝0.3，然后加入CdCl2使其终浓度达到50μM(分别为MY-B116+Cd组和EV+Cd组)，同时以不添加CdCl2在转基因BrMYB116的酵母菌和正常JRY472酵母菌为对照组(分别为MY-B116组和EV组)，在加入CdCl2后的12、14、16、18、20、22h分别取样，测量培养液的OD600值，结果如图2所示。
由图2可知，基因BrMYB116在酵母液体培养基上可以显著降低酵母抗镉的能力。
3、按照本实施例步骤2所述方法对实施例2中转基因BrMYB116的酵母菌和正常JRY472酵母菌进行培养，在加入CdCl2后的14h后取样，分别测量转基因BrMYB116的酵母菌和正常JRY472酵母菌细胞中的Cd2+含量，结果如图3所示。
由图3可知，镉处理后转基因BrMYB116的酵母菌中的镉含量比以正常JRY472酵母菌为对照提高了34.5％，在重金属镉胁迫下转基因BrMYB116的酵母菌中镉的吸收速度明显高于正常JRY472酵母菌。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院
<120> 一种促进微生物镉积累的基因BrMYB116及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 855
<212> DNA
<213> 大白菜
<400> 1
atgtcaaata taatgaagaa gaggtgtaat gaaaatgaag agagcgcaga gcagagaaaa 60
gggccttgga cgcttgagga agacactctt ctcactaatt acattgccca taacggtgaa 120
ggccgatgga atctgctcgc caaatcttct gggctaaaga gaaaaggaaa aagttgcaga 180
ttacgatggt tgaattacct taaacccgac ataaagcggg ggaatctcac tcctcaagaa 240
caactcttaa tcctcgaact tcactgtaaa tggggtaata ggtggtcaaa aattgcgcag 300
tatttaccgg gaagaacgga caacgagatc aaaaactatt ggaggactag agtgcagaaa 360
caagcacgcc agctcaatat tgattccagc agccaccagt tcttggaagt tgtccgtagt 420
ttctgggttc caagattgat ccacaagatg aaagattact caaacaccaa cagtaaagct 480
cctcctacgg attcacttgg acccgtcgta caagacaata atttctcaca taattcgggt 540
ttaaacaaca tagattgttc cacttccatg tctcaagatc tggcgaaaat ttcacagtta 600
atggatttgt ctgatcttga aaccactaat tcaatgtgct tggaaggatc acgagggagt 660
agtaatcaat atgtgaacga agatcatagg tgcttagagg aggagtacat agtgaccacc 720
atgggtaatt cagacatttt accattgcag gattgtcatg tagcatattc gacttacgag 780
gaggatgtaa cacaagatcc aatgtggaac atggatgata tttggcagtt tgaggagtac 840
gcacctttta attag 855

Claims (6)

1.一种促进微生物镉积累的基因BrMYB116，其特征在于，所述基因BrMYB116的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种含有权利要求1所述促进微生物镉积累的基因BrMYB116的表达载体。
3.如权利要求2所述的含有促进微生物镉积累的基因BrMYB116的表达载体，其特征在于，所述表达载体的构建方法包括步骤如下：
(1)从大白菜中提取RNA，然后对RNA进行反转录得到cDNA；
(2)以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增得到基因BrMYB116序列，PCR引物序列如下：
Forward primer：5′-ATGTCAAATATAATGAAGAAGAGGT-3′，
Reverse primer：5′-CTAATTAAAAGGTGCGTACTCCTCA-3′；
(3)将基因BrMYB116序列连接至pRS416质粒，得到基因BrMYB116的表达载体。
4.权利要求1所述促进微生物镉积累的基因BrMYB116在促进酵母菌镉积累中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用的途径包括：将含基因BrMYB116的表达载体转化进微生物基因组。
6.一种含有权利要求1所述促进微生物镉积累的基因BrMYB116的转基因酵母菌。
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