CN115491332A - 枯草芽孢杆菌、酶制剂、再造烟叶基片及再造烟叶 - Google Patents

枯草芽孢杆菌、酶制剂、再造烟叶基片及再造烟叶 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌、酶制剂、再造烟叶基片及再造烟叶。其中，再造烟叶基片或再造烟叶的制备方法，包括：(1)提供原料烟草浆料；(2)向原料烟草浆料中添加枯草芽孢杆菌的酶制剂，进行反应，获得酶处理浆料；(3)将酶处理浆料加工为再造烟叶基片或再造烟叶。

Description

枯草芽孢杆菌、酶制剂、再造烟叶基片及再造烟叶
技术领域
本发明属于烟草领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌、酶制剂、再造烟叶基片及再造烟叶。
背景技术
再造烟叶是一种以烟梗、烟末等烟草物质为主体原料，经过重新组合加工而成的产品，也叫烟草薄片或重组烟草。
再造烟叶的制造方法，根据加工工艺的不同，主要有5种，即辊压法、造纸法、稠浆法、浸透法和喷层法等。
一些相关技术中，造纸法制备再造烟叶是借助于造纸技术和设备，将烟草物质用水浸泡萃取，将可溶物与纤维及不溶物分离，然后将纤维和不溶物打浆，获得原料烟草浆料，用造纸机加工加工原料烟草浆料，形成再造烟叶基片。再造烟叶基片再经含烟草成分的涂布液涂布，烘干后即获得再造烟叶成品。
本领域需要更好的再造烟叶基片和再造烟叶。
发明内容
发明人发现，现有的再造烟叶基片/再造烟叶存在木质气明显，烟气浑浊感明显，烟气较粗糙，刺激性稍大，热刺感较明显，余味较差的问题。
本申请在制备再造烟叶基片/再造烟叶的过程中，采用一种新型枯草芽孢杆菌的酶制剂对烟草浆料进行了处理，提高了再造烟叶基片中特定致香成分(如异戊酸)的含量，获得的再造烟叶基片木质气明显降低，香气丰富性增加，香气质地明显变好，带有甜感，烟气更细腻、柔和，热刺感减小，刺激性变小。
在第一方面，本申请提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YLG-2，2021年12月20日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCCNo.24133，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YLG-2是从河南驻马店B2F-2014烟叶表面筛选得到。
在第二方面，本发明提供一种枯草芽孢杆菌的酶制剂，所述枯草芽孢杆菌的酶制剂来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YLG-2，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YLG-2，2021年12月20日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.24133。
在一些实施方案中，枯草芽孢杆菌的酶制剂含有枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)YLG-2的外泌酶。
在一些实施方案中，枯草芽孢杆菌的酶制剂的淀粉酶活力为6000～10000U/mL，例如7000-9000U/mL，例如8000U/mL。
在一些实施方案中，淀粉酶活力的测定参考本领域通用标准，例如可以参考《GB/T24401-2009α-淀粉酶制剂中的方法》。
发明人出人意料地发现，上述枯草芽孢杆菌的酶制剂可以在制备再造烟叶基片的过程中用于处理原料烟草浆料，采用处理后的浆料去制备再造烟叶基片，基片表现出显著提高的感官品质，以及具有提升的异戊酸含量。而且，该方法能疏松基片结构，使基片纤维长短适中，感官评吸表现为基片的刺激性降低，口感改善，香气质更丰富，整体提升了基片的感官质量。另外，本发明所使用的枯草芽孢杆菌来源于河南驻马店B2F-2014烟叶表面，为天然来源，安全性较高，而且酶处理的烟草浆料风味协调，能与烟草的烟香能较好的契合。
在一些实施方案中，步骤(2)中，枯草芽孢杆菌的酶制剂的制备方法，包括：
a1)取枯草芽孢杆菌接种于LB培养基，进行培养；
a2)将上一步产物接种于牛肉膏培养基，进行培养；
a3)对上一步产物进行离心处理，去除菌体，收集上清液；
a4)对上清液进行超滤浓缩，收集浓缩产物作为酶制剂。
在一些实施方案中，步骤a1)中，每50-150mL(例如100mL)的LB培养基接种一个枯草芽孢杆菌单菌落。
在一些实施方案中，步骤a1)中，所述培养是指在28～37℃下培养。
在一些实施方案中，步骤a1)中，所述培养是指培养的时长为6～12h。
在一些实施方案中，步骤a1)中，LB培养基的成分为：胰蛋白胨8-12g/L；酵母提取物4-6g/L；氯化钠4-6g/L，pH 7.0-8.0(例如7-7.5)。
在一些实施方案中，步骤a2)中，将上一步产物按1-5wt％的比例接种于牛肉膏培养基。
在一些实施方案中，步骤a2)中，所述培养是指在28～37℃下培养。
在一些实施方案中，步骤a2)中，所述培养的时长为12～24h。
在一些实施方案中，步骤a2)中，牛肉膏培养基的成分为：2-4g/L牛肉膏，8-12g/L蛋白胨，4-6g/L氯化钠，pH＝7.0-7.5。
在一些实施方案中，步骤a3)中，离心速度为5000～10000rpm(例如8000rpm)。
在一些实施方案中，步骤a3)中，离心时间为5～15min(例如10min)。
在一些实施方案中，步骤a4)中，超滤浓缩是先使用100-200kd(例如150kd)的超滤膜洗脱大分子，获得第一产物，再将第一产物使用20-40kd(例如30kd)的超滤膜浓缩，获得第二产物。kd是千道尔顿的缩写。
在一些实施方案中，步骤a4)中，经超滤浓缩后，最终浓缩后的体积为浓缩前体积的5～10％。
在一些实施方案中，步骤a4)中，经超滤浓缩后，枯草芽孢杆菌的酶制剂的淀粉酶活力为6000-10000U/mL。
在第三方面，本申请提供一种制备再造烟叶基片或再造烟叶的方法，包括：
(1)提供原料烟草浆料；
(2)向原料烟草浆料中添加枯草芽孢杆菌的酶制剂，进行反应，获得酶处理浆料；
(3)将酶处理浆料加工为再造烟叶基片或再造烟叶；
所述枯草芽孢杆菌的酶制剂来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YLG-2，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YLG-2，2021年12月20日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.24133。
在上述方案中，通过在原料烟草浆料中加入枯草芽孢杆菌的酶制剂，使原料烟草与枯草芽孢杆菌的酶制剂发生生物/化学反应，从而起到改善烟草浆料的物理/化学的作用，获得一种新颖的改进的再造烟叶基片。感官评测发现新型的再造烟叶基片木质气明显降低，香气丰富性增加，香气质地明显变好，带有甜感，烟气更细腻、柔和，热刺感减小，刺激性变小。化学分析发现，再造烟叶基片的化学成分发生了改变，例如其中的异戊酸含量有明显升高。
在一些实施方案中，步骤(1)中，原料烟草浆料的固形物含量为1.0～5.0wt％，例如2～4wt％。
在一些实施方案中，步骤(2)中，枯草芽孢杆菌的酶制剂的添加量为原料烟草浆料的1～5wt％，例如2～4wt％。
在一些实施方案中，步骤(2)中，所述反应的温度为35～50℃，例如40-45℃。基于此，获得的再造烟叶片基或再造烟叶表现出更高的感官质量，以及更高的异戊酸含量。
在一些实施方案中，步骤(2)中，所述反应的时长为12～24h(例如16-20h)。
在一些实施方案中，骤(2)中，枯草芽孢杆菌的酶制剂的淀粉酶活力为6000-10000U/mL。
在一些实施方案中，步骤(3)中，再造烟叶基片或再造烟叶可以采用以下任一种再造烟叶通用制备方法来制备：辊压法、稠浆法、浸渍法、夹层法和造纸法。
在一些实施方案中，步骤3)中，采用造纸法将酶处理浆料加工为再造烟叶基片或再造烟叶。造纸法制造再造烟叶基片的原理是首先把烟草原料加水浸渍后进行压缩，将烟草中的水溶物与不溶物(纤维等)分离。然后烟草纤维等不溶物分散在水中之后获得原料烟草浆料，将原料烟草浆料制成酶处理浆料后，经抄纸机制成再造烟叶基片。
在一些实施方案中，步骤3)中，还包括将烟草水溶液经浓缩后加至再造烟叶基片上，干燥后即为再造烟叶。
在一些实施方案中，所述原料烟草浆料中的固形物来自于烟末、碎烟片、烟梗中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述原料烟草浆料中的固形物的50wt％以上来自于烟梗，例如70wt％以上来自于烟梗，例如90wt％以上来自于烟梗。在一些实施方案中，所述原料烟草浆料中的固形物100％来自于烟梗。
在第二方面，本申请提供一种再造烟叶基片或再造烟叶，由上述任一项所述的方法制备获得。
在一些实施方案中，所述再造烟叶基片或再造烟叶中含有异戊酸。
术语说明
再造烟叶(Reconstituted Tobacco)，是利用烟末、烟梗、碎烟片等烟草物质为原料制成片状或丝状的再生产品，用作卷烟填充料。再造烟叶从加工工艺不同可以分为辊压法、稠浆法、浸渍法、夹层法和造纸法等。
术语“造纸法制备再造烟叶”是将烟末、烟梗等原料分解成可溶物和不溶物，不溶物以类似造纸的方法制成再造烟叶基片。然后加入经浓缩后的可溶物经过烘干，分切制成再造烟叶产品的方法。
浆料的“浓度”是指浆料中固形物的含量，以wt％计。
有益效果：
本公开一项或多项的再造烟叶基片具有以下一项或多项有益效果：
(1)再造烟叶基片中异戊酸的含量显著提高；
(2)再造烟叶基片中淀粉含量有所降低；
(3)再造烟叶基片的感官质量改善，木质气明显降低，香气丰富性增加，香气质地明显变好，带有甜感，烟气更细腻、柔和，热刺感减小，刺激性变小。
附图说明
图1为对比例1的再造烟叶基片的气相色谱-质谱图；
图2为实施例1的再造烟叶基片的气相色谱-质谱图。
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的限定。
Figure BDA0003899597540000061
Figure BDA0003899597540000071
酶制剂的制备例1：
(1)将枯草芽孢杆菌单菌落接种100mL LB培养基，37℃培养6h(摇床培养，摇床转速为180rpm)，获得第一培养物；
LB培养基配方为：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠5g/L，pH7.0。
(2)将第一培养物按1％比例的接种量接种牛肉膏发酵培养基，37℃培养18h(摇床培养，摇床转速为180rpm)，获得第二培养物；
牛肉膏发酵培养基配方为：3g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5g/L氯化钠，pH＝7.0。
(3)对第二培养物进行离心，离心速度8000rpm，离心时间10min，采集上清液；
(4)将100体积份的上清液用150kd的超滤膜洗脱大分子，此步骤收集透过滤膜的产物，获得产物体积为150份体积(由于在收集透过液时采用纯水洗脱，所以产物体积大于100体积份)；再用30kd的超滤膜浓缩超滤上一步产物，此步骤收集未透过滤膜的产物，获得产物为10体积份。超滤获得的浓缩液作为枯草芽孢杆菌的酶制剂。
参考《GB/T 24401-2009α-淀粉酶制剂中的方法》测定的枯草芽孢杆菌的酶制剂的淀粉酶活力为8000U/ml。
酶制剂的制备例2：
将制备例中的枯草芽孢杆菌更换为韩国芽孢杆菌，其它操作一致。
实施例1
(1)将原料烟梗(产地云南)1.0kg与水按固液重量比1:6混合，将混合物置于恒温水浴锅中，在80℃条件下保温20min，从保温后的产物中分离固形物，获得浸泡后的烟草原料。
(2)使用盘磨机对浸泡后的烟草原料进行磨浆，程序如下：
第一次磨浆，磨盘间隙：0.8mm；
第二次磨浆，磨盘间隙：0.6mm；
第三次磨浆，磨盘间隙：0.3mm。
第三次磨浆结束后，收集浆料，获得盘磨浆。
(3)将盘磨浆配成浓度为2.0wt％的浆料，使用精浆机对其进行磨浆，磨浆如下：磨盘间隙0.75mm，磨浆时间3.0min，获得精磨浆。
(4)将精磨浆的浓度调整为1.5wt％的浆料，作为原料烟草浆料，将枯草芽孢杆菌的酶制剂按3wt％的比例加入原料烟草浆料，在45℃反应12h，获得中间烟草浆料。
(5)使用自动抄片器(奥地利PTI公司)将中间烟草浆料抄造为再造烟叶基片，再造烟叶基片定量为60g/m2。
对比例1
(1)将烟梗(产地云南)1.0kg与水按固液重量比1:6混合，将混合物置于恒温水浴锅中，在80℃条件下保温20min，从保温后的产物中分离固形物，获得浸泡后的烟草原料。
(2)使用盘磨机对浸泡后的烟草原料进行磨浆，程序如下：
第一次磨浆，磨盘间隙：0.8mm；
第二次磨浆，磨盘间隙：0.6mm；
第三次磨浆，磨盘间隙：0.3mm。
第三次磨浆结束后，收集浆料，获得盘磨烟草浆料。
(3)将盘磨浆配成固形物浓度为2.0wt％，使用精浆机对其进行磨浆，磨浆如下：磨盘间隙0.75mm，磨浆时间3.0min，获得产物作为原料烟草浆料。
(4)使用PTI自动抄片器将原料烟草浆料抄造为再造烟叶基片，再造烟叶基片定量为60g/m2。
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于：采用从云南马龙C3F-2014烟叶表面筛选的韩国芽孢杆菌(YLA-2)替换实施例1的菌株去制备酶制剂(酶制剂的制备方法参照上文记载的制备例)。
对比例2中所提供的韩国芽孢杆菌(Bacillus koreensis)YLA-2，发明人已于2021年12月20日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCCNo.24132，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
分析检测1：感官评吸
将上述对比例1、对比例2和实施例1所得到的再造烟叶基片切丝后卷制成卷烟，进行感官质量的评吸，评吸结果如表1所示：
表1
Figure BDA0003899597540000091
根据评吸结果，实施例1的烟草浆料制作的再造烟叶基片较对比例1和2的基片相比，木质气明显降低，香气丰富性增加，香气质地明显变好，烟气飘逸感增强，烟气更细腻、柔和，余味更干净。
分析检测2气相色谱-质谱(GC/MS)检测分析
对实施例1和对比例1、对比例2的再造烟叶基片进行GC/MS检测分析，具体方法如下：
用二氯甲烷分别萃取实施例1和对比例1、对比例2的基片。二氯甲烷与基片的质量比为1:1，共萃取3次，合并3次萃取液并减压浓缩(G3旋转蒸发仪，Heidolph公司)，浓缩温度为39℃，真空度为750mbar，转速为110rpm，浓缩至2.0mL。加入内标乙酸苯乙酯(12.553mg/mL)10.0μL，摇匀，过滤膜，移至色谱瓶内，作为待测样品。
气相色谱的检测条件如下：色谱柱DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；载气He(99.999wt％)；流速1.0mL/min；进样口温度240℃；进样量1.0μL；进样模式为不分流进样；升温程序为：40℃保持3分钟，然后以5℃/分钟速率升至200℃，再以3℃/分钟速率升至250℃，最后以5℃/分钟速率升至300℃并保持10分钟。
质谱的检测条件如下：离子源为电子轰击(EI)；电子能量70eV；离子源温度250℃。传输线温度300℃；分析器为四级杆质量分析器；扫描模式为全扫描；质量扫描范围40～500amu；溶剂延迟4.0分钟。
用气相色谱-质谱对待测样品进行分析，对比例1和实施例1的检测结果分别如图1和图2所示。图中，纵坐标为丰度，横坐标为时间(分钟)。将对比例1、实施例1、实施例2的色谱特征峰列表2如下：
表2
Figure BDA0003899597540000101
*第一个峰的丰度值设定为100，其它峰的丰度等做比例缩放
由此可知，与对比例1和对比例2相比，实施例1的再造烟叶基片在38.558分钟的位置多一个色谱峰，经质谱定性，该色谱峰对应的物质为异戊酸。这一实验结果与感官评测结果相互印证，说明实施例1的再造烟叶基片确实与对比例1和对比例2的再造烟叶基片确实具有不同的化学成分。发明人已知，异戊酸具有多种水果样的香气和味道，主要用以配制干酪和奶油香精，亦微量用于水果型香精。实施例1的再造烟叶基片的感官品质改善可能归功于再造烟叶基片中异戊酸含量的增加。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (14)

1.一株枯草芽孢杆菌YLG-2，其于2021年12月20日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.24133。
2.一种枯草芽孢杆菌的酶制剂，所述枯草芽孢杆菌的酶制剂来自权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌的酶制剂，所述枯草芽孢杆菌的酶制剂的淀粉酶活力为6000～10000U/mL。
4.一种枯草芽孢杆菌的酶制剂的制备方法，包括：
a1)取权利要求1所述的枯草芽孢杆菌接种于LB培养基，进行培养；
a2)将上一步产物接种于牛肉膏培养基，进行培养；
a3)对上一步产物进行离心处理，去除菌体，收集上清液；
a4)对上清液进行超滤浓缩，收集浓缩产物作为酶制剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其具有以下一项或多项特征：
步骤a1)中，每50-150mL的LB培养基接种一个枯草芽孢杆菌单菌落；
步骤a1)中，所述培养是指在28～37℃下培养6～12h；
步骤a1)中，LB培养基的成分为：胰蛋白胨8-12g/L；酵母提取物4-6g/L；氯化钠4-6g/L，pH 7-8。
6.根据权利要求4所述的方法，其具有以下一项或多项特征：
步骤a2)中，将上一步产物按1-5wt％的比例接种于牛肉膏培养基；
步骤a2)中，所述培养是指在28～37℃下培养12～24h。
在一些实施方案中，步骤a2)中，牛肉膏培养基的成分为：2-4g/L牛肉膏，8-12g/L蛋白胨，4-6g/L氯化钠，pH＝7.0-7.5。
7.根据权利要求4所述的方法，其具有以下一项或多项特征：
步骤a4)中，超滤浓缩是先使用100-200KD的超滤膜洗脱大分子，获得第一产物，再将第一产物使用20-40KD的超滤膜浓缩，获得第二产物；
步骤a4)中，经超滤浓缩后，最终浓缩后的体积为浓缩前体积的5～10％。
8.一种再造烟叶基片或再造烟叶的制备方法，包括：
(1)提供原料烟草浆料；
(2)向原料烟草浆料中添加权利要求2所述的枯草芽孢杆菌的酶制剂，进行反应，获得酶处理浆料；
(3)将酶处理浆料加工为再造烟叶基片或再造烟叶。
9.根据权利要求8所述的方法，步骤(1)中，原料烟草浆料的固形物含量为1.0～5.0wt％。
10.根据权利要求8所述的方法，步骤(2)中，枯草芽孢杆菌的酶制剂的添加量为原料烟草浆料的1～5wt％。
11.根据权利要求2所述的方法，其具有以下一项或多项特征：
步骤(2)中，所述反应的温度为35-50℃；
步骤(2)中，所述反应的时间为12～24h。
12.一种再造烟叶基片或再造烟叶，由权利要求8～11任一项所述的方法制备获得。
13.根据权利要求12所述的再造烟叶基片或再造烟叶，其中含有异戊酸。
14.一种烟草制品，含有权利要求12-13任一项所述的再造烟叶基片或再造烟叶。
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