CN115487166B - 一种嗜黏液阿克曼氏菌口服递送系统及其制备方法和应用 - Google Patents

一种嗜黏液阿克曼氏菌口服递送系统及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种嗜黏液阿克曼氏菌口服递送系统及其制备方法和应用，该口服递送系统为球形微胶囊，其芯材包括嗜黏液阿克曼氏菌，壁材为双层结构，外层为海藻酸钙层，内层为碳酸钙层，其中碳酸钙附着在AKK菌上，海藻酸钙包裹在碳酸钙层表面形成球形结构；在胃部海藻酸钙减缓碳酸钙的溶解，避免其全部溶解，在十二指肠和小肠，碳酸钙能够中和海藻酸钙侧链的负电荷，减缓海藻酸钙因静电作用溶胀的速度，避免崩解，在结肠，碳酸钙表面带负电荷，其与海藻酸钙侧链以及海藻酸钙侧链之间的静电作用，能够加快口服递送系统崩解释放内部益生菌，且碳酸钙溶解产生的CO2能够促进AKK菌的生长，利于益生菌定植，可应用于预防和改善肥胖和抑郁。

Description

一种嗜黏液阿克曼氏菌口服递送系统及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，更具体地，涉及一种嗜黏液阿克曼氏菌口服递送系统及其制备方法和应用。
背景技术
嗜黏液阿克曼氏菌(Akkermansia mucinipila，简称AKK)，是从人类粪便中分离出的一株黏液降解菌，研究表明AKK菌在调控宿主健康中具有重要作用，通过提升宿主肠道内AKK菌的相对丰度能够显著改善相关疾病，传统的提升宿主肠道内AKK菌的相对丰度的方式为粪菌移植，但该方式是以侵入性的手术方式进行，容易引起并发症，而直接口服益生菌，其在体内存活性低、难定植。
现有技术中利用在液体环境中用层层自组装的方法，对益生菌进行保护，如专利CN202011377020.2《一种鼠李糖乳杆菌微胶囊的制备方法》，该微胶囊囊材外层为壳聚糖，内层为海藻酸钙，虽这种壳聚糖-海藻酸钙微胶囊对部分益生菌能够起到较好的保护作用和定向释放的作用，但这种天然高分子材料形成的微胶囊表面膜呈现多孔结构，具有一定通透性，允许氧、H+等自由出入，难以较好保护严格厌氧菌的活性，而且外层为壳聚糖的微胶囊崩解释放益生菌速度较慢，益生菌整体定植效果较差。
而AKK菌作为严格厌氧的肠道菌株，对培养条件要求极其苛刻，体外厌氧条件培养都难良好的生长，一般在体内的定植效果更差。基于AKK菌的生长特性，现有的微胶囊包埋技术难以确保AKK菌在肠道的快速定向释放和良好的定植作用，目前也未见适合的口服递送系统能够实现AKK菌在肠道中的快速靶向递送和良好的定植。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种嗜黏液阿克曼氏菌口服递送系统及其制备方法和应用，其目的在于提供一种嗜黏液阿克曼氏菌口服递送系统，采用海藻酸钙-碳酸钙双层壁材结构包埋益生菌，其中海藻酸钙包裹在碳酸钙层表面，而碳酸钙附着在益生菌上，在胃液中，海藻酸钙不溶解可减缓碳酸钙的溶解，在小肠中碳酸钙带正电荷，可中和海藻酸钙侧链的负电荷，减缓溶胀，在结肠中碳酸钙带负电荷，与海藻酸钙静电排斥，加速崩解释放益生菌，且产生的CO2利于AKK菌的生长，益生菌能够良好的定植，由此解决现有口服递送系统难以使益生菌快速靶向释放，嗜黏液阿克曼氏菌在结肠中定植活性较差的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种嗜黏液阿克曼氏菌口服递送系统，其所述口服递送系统为以海藻酸钙-碳酸钙作壁材的微胶囊，且其芯材包括嗜黏液阿克曼氏菌，所述壁材为双层结构，外层为海藻酸钙层，内层为碳酸钙层，其中碳酸钙附着在嗜黏液阿克曼氏菌上，海藻酸钙包裹在碳酸钙层表面形成球形结构。
优选地，所述嗜黏液阿克曼氏菌口服递送系统，其所述微胶囊，粒径大小为200um-1000um；所述海藻酸钙层，厚度为75um-500um；所述碳酸钙层，厚度为25um-200um。
优选地，所述嗜黏液阿克曼氏菌口服递送系统，其所述微胶囊，还包括产生CO2的益生元，其分布于海藻酸钙层与碳酸钙层之间。
优选地，所述嗜黏液阿克曼氏菌口服递送系统，其所述芯材为嗜黏液阿克曼氏菌和长双歧杆菌的混合益生菌；所述产生CO2的益生元，包括菊粉。
按照本发明的另一方面，提供了一种如本发明所述嗜黏液阿克曼氏菌口服递送系统的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将获得的益生菌和Ca2+的混合液，涡旋震荡混匀，使得益生菌充分吸附Ca2+，加入含有CO3 2-离子的溶液使Ca2+能够完全反应，充分涡旋震荡，使得益生菌表面附着一层碳酸钙，即为碳酸钙-益生菌浑浊液，所述益生菌，包括嗜黏液阿克曼氏菌；
(2)将含海藻酸盐的溶液按照预设比例加入步骤(1)获得的碳酸钙-益生菌浑浊液中，涡旋震荡混匀，将混合液加入到含Ca2+的固定液中充分固化获得沉淀物，沉淀物经多次重悬、洗涤后，即为所述嗜黏液阿克曼氏菌口服递送系统。
优选地，所述嗜黏液阿克曼氏菌口服递送系统的制备方法，其步骤(1)所述益生菌和Ca2+的混合液，按照1mL的浓缩菌液加入0.1～0.3μmol的Ca2+获得，所述充分涡旋震荡，涡旋震荡时间1-5min，涡旋速度为200r/min-800r/min；步骤(2)所述预设比例为含海藻酸盐的溶液与碳酸钙-益生菌浑浊液的体积比为1:1～1.5，其中海藻酸盐的浓度为2～8％(W/V)。
优选地，所述嗜黏液阿克曼氏菌口服递送系统的制备方法，其步骤(2)所述混合液以喷雾形式加入固定液中，静电喷雾的条件为电喷针头与固定液液面高度在20-30厘米，静电喷雾的电压在8-12kv，推注速度为0.5-1mL/h。
优选地，所述嗜黏液阿克曼氏菌口服递送系统的制备方法，其所述含海藻酸盐的溶液为海藻酸钠和菊粉的混合溶液，其中菊粉的浓度为2～8％(W/V)。
优选地，所述嗜黏液阿克曼氏菌口服递送系统的制备方法，其所述益生菌为嗜黏液阿克曼氏菌和长双歧杆菌的混合菌。
按照本发明的另一个方面，还提供了一种如本发明所述嗜黏液阿克曼氏菌口服递送系统在预防和改善肥胖及抑郁中的应用。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
本发明提供的嗜黏液阿克曼氏菌口服递送系统，采用海藻酸钙-碳酸钙双层结构为壁材，其中海藻酸钙层为外层，碳酸钙层为内层，碳酸钙均匀附着在益生菌上，能够减少益生菌与氧气的接触，另碳酸钙颗粒可填充海藻酸钙层中空隙，营造内部低氧环境利于维持菌株的活性；而且碳酸钙和海藻酸钙两者相互配合在胃肠道不同部位发挥不同的作用，其中在进入胃液时，壁材外层海藻酸钙不发生溶解，其侧链基团羧基质子化，可减缓酸性环境条件下碳酸钙的溶解，另碳酸钙溶解生成的Ca2+与海藻酸钙相互作用可增强口服递送系统的结构强度，避免崩解；在进入十二指肠和小肠时，碳酸钙表面带正电荷，海藻酸钙表面带负电荷，正负电荷中和，可减缓海藻酸钙层的溶胀速度；在进入偏中性的结肠环境时，碳酸钙表面带负电荷，此时，海藻酸钙溶胀程度达到最大，碳酸钙与海藻酸钙侧链以及海藻酸钙侧链之间的静电排斥，协同加速口服递送系统的崩解，实现靶向快速释放益生菌；另外，碳酸钙溶解产生的CO2会促进AKK菌的生长，提升AKK菌在肠道中的相对丰度。
在肥胖小鼠粪便AKK菌相对丰度定量分析实验中，结果显示，采用本发明提供的AKK单菌口服递送系统和AKK-BL菌口服递送系统，相比对照组和直接口服AKK菌液组，小鼠肠道中AKK菌相对丰度均得到显著提升，尤其是AKK-BL菌口服递送系统体提升效果更佳。本发明提供的口服递送系统可实现在结肠中靶向释放AKK菌，且能够显著提升AKK菌在肠道中的相对丰度，定植效果良好，应用前景十分广阔。
附图说明
图1是AKK单菌口服递送系统耐酸、耐酶能力评测结果；
图2是AKK单菌口服递送系统结肠靶向释放能力评测结果；
图2中A，B，C，D为口服递送系统在第0～3h模拟胃液孵育的显微观察结果；D，E，F，G，H，I，J为口服递送系统第3～8h模拟小肠液孵育的显微观察结果；J，K，L为第8～11h口服递送系统在模拟结肠液孵育的显微观察结果；
图3是实施例5中各组肥胖小鼠Lee’s系数；
图4是实施例6中肥胖小鼠血清中总胆固醇、甘油三酯含量；
图5是实施例7中肥胖小鼠粪便中AKK的相对丰度。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
AKK菌是一种严格厌氧的肠道益生菌，其适宜生长的环境为pH接近中性的环境，在结肠中定植后可发挥调节肠道微生态的有益作用，单独直接口服益生菌，容易被胃液或酸性环境破坏其活性，难以发挥益生菌的作用，因此，需要合适的口服递送系统，以确保AKK菌在结肠中靶向释放且定植良好。
微胶囊技术主要是利用天然或合成的高分子成膜材料把分散均匀的固体微粒、气体或液体包裹形成微小固体颗粒的技术。其中包裹在微胶囊内部的物质称为芯材，微胶囊外部的包裹膜称为壁材或囊材，目前已有将微胶囊技术用于包埋益生菌，以减少胃液酸性环境对益生菌活性的破环，但微胶囊对益生菌的保护效果取决于其壁材，而壁材种类繁多，来源广泛，不同壁材之间存在明显差异，往往需依据芯材的特性和使用目的选择合适的壁材。
海藻酸钠是一种从褐藻中提取出来的阴离子线性多糖，其基本结构由两种结构单元组成，即M单元和G单元。其中，G单元呈鼓形，而M单元则倾向于呈延伸的带状结构。当溶液体系中含有钙离子时，两个G单元能够通过其侧链羧基与钙离子之间形成配位键，最终形成海藻酸钙微球，海藻酸钙微球在胃酸低pH环境下，海藻酸钙侧链基团羧基质子化，致使海藻酸钙微球在酸性环境下不发生溶解，在进入十二肠和小肠后，随着pH的升高，海藻酸钙侧链羧基去质子化，侧链带负电荷，侧链之间开始静电排斥，使其发生膨胀，甚至崩解，难以确保内部的益生菌能够在结肠中定向释放，最终会影响益生菌的定植效果，甚至难以定植；而且海藻酸钙微球表面有一定的孔隙，具有较好的通透性，在胃液的酸性环境及含有消化酶的胃肠道环境下，虽海藻酸钙微球本身在胃液中不被消化，但氧气、H+以及消化酶会进入海藻酸钙微球内部，使得微球内部逐渐变成酸性、有氧环境，不利于厌氧菌的存活，尤其是AKK菌。
为改善海藻酸钙微球本身的通透性，目前常用的是利用大分子多糖，如壳聚糖，在海藻酸钙微球表面形成一层保护膜，但这种壳聚糖-海藻酸钙微胶囊由于壳聚糖分子的刚性结构难以快速崩解，且制备条件对微胶囊的空隙大小和壁材厚度有显著影响，进而影响益生菌的定植效果，因此，往往需要依据内部益生菌的特性调节合适的工艺条件进行制备。
然而，AKK菌是一种严格厌氧菌，生长必需CO2，且菌株本身在肠道中定植效果差，现有的微胶囊包埋技术并不适用于AKK菌，主要是因为难以确保AKK菌在结肠中快速靶向释放以及难以提供充足CO2使其良好定植。
本发明提供了一种嗜黏液阿克曼氏菌口服递送系统，所述口服递送系统为以益生菌作芯材且以海藻酸钙-碳酸钙作壁材的微胶囊；所述益生菌，包括嗜黏液阿克曼氏菌，所述壁材为双层结构，外层为海藻酸钙层，内层为碳酸钙层，其中碳酸钙附着在益生菌上，海藻酸钙包裹在碳酸钙层表面形成球形结构。
碳酸钙均匀附着在AKK菌上，一是利于填充海藻酸钙层的空隙，减少氧气、消化酶等进入内部，同时使菌株处于相对密闭的环境，利于保存菌株活性，二是碳酸钙溶解后产生的CO2能够促进AKK菌的生长，利于菌株的定植。
在口服递送系统进入胃液酸性环境时，由于H+的渗透碳酸钙开始溶解，而壁材外层海藻酸钙不发生溶解，其侧链基团羧基质子化可减缓碳酸钙的溶解速度，且碳酸钙溶解生成的Ca2+与海藻酸钙相互作用，可强化口服递送系统在胃液中的结构强度，使其在胃液中不易发生崩解释放；
在口服递送系统进入十二肠和小肠后，海藻酸钙侧链开始去质子化，使得侧链带负电荷，在海藻酸钙侧链之间的静电排斥作用下壁材开始出现溶胀，而此时，碳酸钙表面带正电荷，能中和海藻酸钙侧链的负电荷，可以减缓口服递送系统在十二肠和小肠的溶胀速度，利于口服递送系统在崩解前到达结肠；
在口服递送系统到达结肠后，随着pH的升高，海藻酸钙溶胀程度达到最大，此时，碳酸钙表面带负电荷，碳酸钙与海藻酸钙侧链产生静电排斥，并且海藻酸钙侧链之间也相互排斥，进而加快口服递送系统在结肠中崩解释放内部的益生菌，实现在结肠中快速靶向释放益生菌，而且碳酸钙溶解产生的CO2能够促进AKK菌的生长，利于AKK菌的定植。
所述微胶囊，优选粒径大小为200um-1000um，微胶囊若粒径太小，壁材厚度较薄，在胃液中容易被消化，若粒径太大，溶解速度慢，不利于在结肠中快速崩解释放内部的AKK菌；
所述壁材外层，优选海藻酸钙层厚度为75um-500um，海藻酸钙层厚度在合适范围内，其在胃液中可减缓碳酸钙层的溶解，保护碳酸钙层不被完全溶解；在十二肠和小肠中壁材外层有部分溶涨也不会造成口服递送系统的崩解，利于AKK菌在结肠中靶向释放，同时使口服递送系统在到达结肠前有部分溶胀，利于在结肠中口服递送系统的快速崩解释放内部的益生菌；
所述壁材内层，优选碳酸钙层厚度为25um-200um，碳酸钙层厚度在合适范围，使得在胃液中有部分碳酸钙与进入口服递送系统内部的H+反应，维持内部一个中性环境，同时海藻酸钙与碳酸钙溶解生成的Ca2+相互作用，可增强口服递送系统在胃液中结构强度，使其在胃液中不易发生崩解释放；在进入十二肠和小肠后，未溶解部分的碳酸钙表面带正电荷，能够中和海藻酸钙侧链所带的负电荷，减缓壁材外层因静电作用产生的溶胀；在进入结肠后，海藻酸钙溶胀达到最大，且碳酸钙带负电荷，其与海藻酸钙侧链产生静电排斥，可加快口服递送系统的崩解，相比以壳聚糖-海藻酸钙为壁材的微胶囊，本发明提供的口服递送系统能够实现在结肠中快速靶向释放益生菌，同时可促进菌株生长。
进一步地，所述口服递送系统，优选还包括产生CO2的益生元，其分布于海藻酸钙层和碳酸钙层之间；所述芯材，还包括产生CO2的益生菌，益生菌表面均匀附着有碳酸钙颗粒，利于保护益生菌不被胃液酸性环境破坏其活性。
所述产生CO2的益生元，优选包括菊粉，益生元主要分布于海藻酸钙层与碳酸钙层之间，将产生CO2的益生元分布在壁材内外层中，一是可以进一步填充壁材内的空隙，营造低氧环境，利于保持厌氧益生菌的活性，二是为AKK菌提供生长所必需的CO2，可促进菌株生长，提升定植效果；如菊粉在结肠中被微生物发酵降解产生SCFA和CO2，产生SCFA中CH3COOH能够与释放的CaCO3继续反应加快CaCO3的溶解，同时释放CO2促进AKK菌的生长，可见，菊粉发酵后的产物能够与AKK菌表面附着的CaCO3起到协同促进AKK菌生长的作用，进而提高AKK菌经口服递送后在肠道中的相对丰度。
进一步地，所述口服递送系统，外表面还包括冻干保护剂，所述冻干保护剂，包括脱脂奶粉。
本发明还提供了一种如本发明所述嗜黏液阿克曼氏菌口服递送系统的制备方法，其包括以下步骤：
(1)在包含益生菌的浓缩菌液中按照预设比例加入含Ca2+的溶液，获得益生菌和Ca2+的混合液，涡旋震荡混匀，使得益生菌充分吸附Ca2+，再加入含CO3 2-离子的溶液，使得Ca2 +能够完全反应，涡旋震荡充分反应，使得生成的碳酸钙附着在益生菌上，即为碳酸钙-益生菌浑浊液；
这种涡旋震荡操作利于益生菌表面能够均匀附着一层碳酸钙，而且通过控制涡旋震荡条件可以控制益生菌表面附着的碳酸钙层的厚度；采用化学方法生成碳酸钙而不直接添加碳酸钙，主要是因为直接添加碳酸钙，溶解点低且难以在益生菌表面形成均匀的碳酸钙层；
所述益生菌的浓缩菌液，为对数期益生菌的重悬浓缩液，所述益生菌，包括AKK菌，优选包括AKK菌和长双歧杆菌；
步骤(1)所述预设比例为1mL浓缩菌液加入0.1～0.3μmol的Ca2+，例如1mL浓缩菌液加入10uL的Ca2+浓度为0.01-0.03mol/L的溶液；
所述涡旋震荡充分反应，优选涡旋震荡时间1-5min，涡旋速度为200r/min-800r/min；采用涡旋震荡的方式，利于益生菌表面均匀的附着一层碳酸钙，通过调节涡旋速度大小可以调整形成的碳酸钙层的厚度，涡旋速度越大，时间越短，形成的碳酸钙层厚度越小；
(2)将含海藻酸盐的溶液按照预设比例加入步骤(1)获得的碳酸钙-益生菌浑浊液中，涡旋震荡混匀，将混合液加入含Ca2+的固定液中进行充分固化获得沉淀物，沉淀物经多次重悬、洗涤后，即为所述益生菌口服递送系统；
优选混合液以喷雾形式加入，相比挤压法固化和乳化法固化，以喷雾形成加入固化，获得的微胶囊粒径更小且一致性更好，如采用静电喷雾装置将混合液加入固定液中，静电喷雾条件设置如下：
调整电喷针头与固定液液面高度在20-30厘米，设置静电喷雾的电压为8-12kv，推注速度为0.5-1mL/h，在这个条件下形成的海藻酸钙层的厚度适宜。
步骤(2)所述预设比例，含海藻酸盐的溶液与益生菌菌液的体积比为1:1-1.5，所述含海藻酸盐的溶液，其中海藻酸盐浓度为2-8％(W/V)，优选包括海藻酸钠以及产生CO2的益生元的混合液；所述产生CO2的益生元，优选菊粉，菊粉在混合液中的浓度为2-8％(W/V)；
先将菊粉与海藻酸钠均匀混合，再将海藻酸钠-菊粉混合液和附着碳酸钙的益生菌液加入含Ca2+的固定液中，可使得菊粉主要均匀分布在海藻酸钙和碳酸钙层之间，在口服递送系统到达结肠时，菊粉被结肠微生物发酵分解可产生SCFA和CO2，其中SCFA中的CH3COOH能够与CaCO3继续反应产生CO2，两者协同作用促进AKK菌生长；另外，菊粉在发酵分解前能够用于填充海藻酸钙中的空隙。
步骤(2)所述涡旋震荡混匀，优选涡旋震荡时间为3-5min，涡旋速度为200r/min-800r/min，采用涡旋震荡混匀，可避免机械式搅拌破坏益生菌表面的碳酸钙层。
另外，本发明还提供了如本发明所述嗜黏液阿克曼氏菌口服递送系统在预防和改善肥胖及抑郁中的应用。
以下为实施例：
实施例1AKK单菌口服递送系统
所述AKK单菌口服递送系统，按照如下制备方法制备：
主要实验材料：
(1)AKK菌浓缩液：取AKK菌株，在厌氧工作台中以1:100的比例接种到BHI-M液体培养基中，37℃培养96h至稳定期。将培养至稳定期的AKK菌液分装至50mL离心管中，每只离心管分装量不易超过25mL，分装后8000rpm，4℃离心20min，离心后转移至厌氧工作台中，除去离心管中上清液，采用超纯水重悬离心管底部的AKK菌，重悬后8000rpm，4℃离心20min，离心后除去上清液，再用1mL超纯水逐个重悬浓缩离心管底部AKK菌，重悬浓缩后将浓缩后的AKK菌液定量至5mL体积，即为AKK菌浓缩液。
(2)海藻酸钠-菊粉的混合液：称取0.4g菊粉加入20mL超纯水中，充分搅拌溶解，再加入0.4g海藻酸钠，搅拌混匀，灭菌获得海藻酸钠-菊粉混合液，其中海藻酸钠和菊粉的浓度均为2％(W/V)。所述灭菌，条件为110℃、恒温30min，在Liquid模式进行高压灭菌。
(3)固定液：称取55.5g氯化钙固体加入1000mL超纯水中，充分搅拌，灭菌后获得0.5mol/L的固定液；所述灭菌，条件为121℃，20min，Liquid模式进行高压灭菌制备固定液。
实验步骤：
(1)AKK菌预处理：向5mL浓缩后的AKK菌液中加入50μL的经过滤除菌后的0.15％(W/W)氯化钙溶液，涡旋震荡混匀1min，涡旋速度200r/min，加入50μL的经过滤除菌后的0.15％(W/W)碳酸钠溶液，涡旋震荡混匀1min，使得AKK菌表面附着一层碳酸钙。
(2)制备AKK单菌口服递送系统
取海藻酸钠-菊粉混合液5mL，全部注入步骤(1)的AKK菌液中，涡旋震荡混匀3min，涡旋速度500r/min，混匀后，用5mL注射器抽取混合物至注射器内，并用封口膜封闭注射器针头连接处，置于厌氧盒中转移至静电喷雾装置，转移至静电喷雾装置后，更换注射器针头为30G不锈钢45°弯针，向500mL烧杯中加入0.5mol/L的固定液200mL后将其置于静电喷雾装置中心；
固化：调整电喷针头与固定液液面高度为20厘米，设置静电喷雾的电压为12kv、推注速度为0.75，使混合物以喷雾形式加入固定液中开始制备，静电喷雾50min后，关闭静电喷雾仪器，转移固定液，待固化2h后且口服递送系统沉淀至底部，去除上部固定液，加入超纯水将底部AKK单菌口服递送系统重悬，待口服递送系统继续沉淀到底部后，去除上清液加入新的超纯水进行重悬洗涤，如此反复20次，目的是尽量稀释除去口服递送系统吸附的钙离子，以免影响后续实验。
冷冻干燥：洗涤后的AKK单菌口服递送系统采用灭菌后的10％脱脂奶粉溶液(W/V)进行重悬，置于37℃恒温摇床，200rpm摇晃30min，室温静置10min，待口服递送系统沉在离心管底部后，去除上层液体，正置放于-20℃预冻3h后转移至-80℃预冻过夜，再转移至提前预冷的冻干机中，冻干72h，收取冻干样品，即为AKK单菌口服递送系统，并于4℃保存。
本实施例中获得AKK单菌口服递送系统，经检测其粒径大小为300um，其中，海藻酸钙层厚度120um，碳酸钙层厚度25um。
实施例2AKK-BL混菌口服递送系统
实验材料：
(1)AKK-BL菌浓缩液：取长双歧杆菌菌株，在厌氧工作台中以1:100的比例接种到MRS液体培养基中，37℃培养箱中培养至稳定期，将培养至稳定期的长双歧杆菌(BL)取1mL于1.5mL离心管中，5000rpm，4℃离心5min后，用超纯水重悬后，再次5000rpm，4℃离心5min。用超纯水重悬，取100μL加入到已经重悬洗涤浓缩后的AKK菌液(同实施例1)中，涡旋震荡混匀2min，使AKK菌液和BL菌液充分混匀，即为AKK和BL混合菌浓缩液，记为AKK-BL菌浓缩液；
(2)海藻酸钠-菊粉混合液：称取0.8g菊粉加入20mL超纯水中，充分搅拌溶解，再加入0.8g海藻酸钠，搅拌混匀，灭菌获得海藻酸钠-菊粉混合液，其中海藻酸钠和菊粉的浓度均为4％(W/V)。所述灭菌，条件为110℃、恒温30min，在Liquid模式进行高压灭菌。
(3)固定液：同实施例1；
实验步骤：
(1)AKK-BL菌预处理：向5mL浓缩后的AKK-BL菌液中加入50μL的经过滤除菌后的0.3％(W/W)氯化钙溶液，涡旋震荡混匀3min，涡旋速度200r/min，加入50μL的经过滤除菌后的0.3％(W/W)碳酸钠溶液，涡旋震荡混匀3min，使得AKK和BL菌表面附着一层碳酸钙。
(2)制备AKK-BL菌口服递送系统
取海藻酸钠-菊粉混合液5mL，全部注入步骤(1)的AKK-BL菌液中，涡旋震荡混匀5min，涡旋速度500r/min，混匀后，用5mL注射器抽取混合物至注射器内，并用封口膜封闭注射器针头连接处，置于厌氧盒中转移至静电喷雾装置，转移至静电喷雾装置后，更换注射器针头为30G不锈钢45°弯针，向500mL烧杯中加入0.5mol/L的固定液200mL后将其置于静电喷雾装置中心；
固化：调整电喷针头与固定液液面高度为20厘米，设置静电喷雾的电压为12kv、推注速度为0.5，使混合物以喷雾形式加入固定液中，开始制备，静电喷雾50min后，关闭静电喷雾仪器；转移固定液，固化3h且口服递送系统沉淀在底部后，去除上部氯化钙溶液，加超纯水重悬、洗涤，反复多次；
冷冻干燥：洗涤后的AKK-BL菌口服递送系统采用冻干保护液(同实施例1)重悬，冷冻干燥后获得AKK-BL菌口服递送系统。
本实施例中获得AKK-BL菌口服递送系统，经检测其粒径大小为800um，其中，海藻酸钙层厚度300um，碳酸钙层厚度70um。
实施例3AKK单菌口服递送系统进行耐酸、耐酶能力
对实施例1获得的AKK单菌口服递送系统进行耐酸、耐酶测试，具体如下：
实验方法如下：
模拟胃液：向1000mL超纯水滴加10％盐酸，调整溶液pH＝2，加入胃蛋白酶10g，充分搅拌后，通过0.22μm滤膜过滤除菌，放置于4℃冰箱冷藏备用，使用前需37℃预热。
模拟小肠液：称取6.8g磷酸氢二钾，加入1000mL超纯水中，用10％氢氧化钠溶液调整到溶液pH＝6.8，加入10g胰蛋白酶，搅拌均匀后，通过0.22μm滤膜过滤除菌，放置于4℃冰箱备用，使用前需37℃预热。
取0.1g冻干AKK单菌口服递送系统于1.5mL离心管中，用1mL模拟胃液重悬后，加入到含有9mL模拟胃液的15mL离心管中，最终体积为10mL，之后转37℃恒温摇床150rpm摇晃，分别与第0h、第1h、第2h、第3h进行取样，用超纯水洗涤10次AKK单菌口服递送系统样品后，PBS重悬崩解释放，并用96孔板梯度稀释，每个梯度取10μL点板，在厌氧工作台中37℃培养箱中培养5天，对AKK菌落数进行统计计算。3h模拟胃液孵育后，将含有冻干AKK口服递送系统的离心管，用模拟小肠液洗涤10次，最后用10mL模拟小肠液重悬，放置于37℃恒温摇床150rpm摇晃，分别于第4h、第5h、第6h、第7h、第8h取样，超纯水洗涤，PBS重悬释放，并用96孔板梯度稀释，每个梯度取10μL点板，在厌氧工作台中37℃培养箱中培养5天，对AKK菌落数进行统计计算。
结果如图1，从整个8h的实验结果分析可知，在酸性且含有消化酶的模拟胃液和模拟肠液的环境中，AKK单菌口服递送系统组的菌株活力损失仅在一个数量级内，而游离的AKK菌液组的菌株活力则损失了将近四个数量级，且在实验终点时，两组实验结果之间出现了显著性差异。由此可得，在模拟胃液和模拟肠液的环境中，口服递送系统相比于游离的AKK菌液，具有更好的耐酸、耐酶能力，对内部的AKK具有良好的保护效果。
实施例4AKK-BL菌口服递送系统靶向释放能力评测
实验方法如下：
模拟胃液和模拟小肠液：同实施例3。
模拟结肠液：在1000mL超纯水中，溶解磷酸氢二钾5.59g、磷酸二氢钾0.41g，用10％氢氧化钠溶液调整溶液pH＝7.4；
(1)模拟胃液：取AKK-BL菌口服递送系统0.1g于1.5mL离心管中，用1mL模拟胃液重悬后，加入到含有9mL模拟胃液的15mL离心管中，最终模拟胃液加重悬后口服递送系统后的体积为10mL，转37℃恒温摇床150rpm摇晃，分别与第0h、第1h、第2h、第3h进行取样，置于载玻片上，用无尘纸轻轻吸干液体，在倒置显微镜10倍放大明场视野中，观察口服递送系统整体形态，以及崩解释放情况，拍照取样。
(2)模拟小肠：在3h模拟胃液孵育结束后，将含有口服递送系统的离心管，先用超纯水重悬洗涤10次，再用模拟小肠液洗涤10次，最后用10mL模拟小肠液重悬，放置于37℃恒温摇床150rpm摇晃，分别于第4h、第5h、第6h、第7h、第8h取样，置于载玻片上，轻轻吸干液体，在倒置显微镜10倍放大明场视野中，观察口服递送系统整体形态，以及崩解释放情况，拍照取样。
(3)模拟结肠：第8h模拟小肠液孵育结束后，将口服递送系统，先用超纯水洗涤10次，再用模拟结肠液洗涤10次，最后用10mL模拟结肠液重悬，转37℃恒温摇床150rpm摇晃，分别于第9h、第10h、第11h取样，置于载玻片上，用无尘纸轻，在倒置显微镜10倍放大明场视野中，观察口服递送系统整体形态，以及崩解释放情况，拍照取样。
结果如图2，整个模拟胃液3h的孵育过程中，口服递送系统都未出现崩解释放的情况，从第3～8h是在模拟小肠液中继续孵育轻吸干液体的结果，在模拟小肠液孵育的5h中，口服递送系统边缘一直保持清晰，并未出现明显的崩解释放，在第8h后，将模拟小肠液中的口服递送系统转移到模拟结肠液中进行孵育，在模拟结肠液孵育的3h过程中，由于磷酸盐、碳酸钙、海藻酸钙的共同作用，可以明显观察到口服递送系统的溶胀破裂、崩解释放，证明了口服递送系统具有一定的结肠靶向释放能力。
实施例5益生菌口服递送系统预防肥胖
购买6周龄C57雄性小鼠进行肥胖小鼠造模，先适应性饲养一周。适应性饲养结束后，除普通饲料对照组小鼠继续保持普通饲料饲养外，其他组小鼠断食一晚后，转为高脂饲料进行肥胖小鼠造模，造模期间控制高脂饲料加入量，每三天加入新鲜高脂饲料，防止高脂饲料氧化影响肥胖小鼠造模效果。每周称量高脂饲料组的肥胖小鼠体重和普通饲料组小鼠体重，并计算体重差异。当高脂饲料组的肥胖小鼠体重高于普通饲料组小鼠体重30％后，即认为肥胖小鼠模型造模成功，造模成功后将肥胖小鼠进行分组，进行为期8周的实验干预。
肥胖小鼠分为4个实验组：PBS组、AKK菌液组、AKK单菌口服递送系统组、AKK-BL混菌口服递送系统组，灌胃的菌株活力都在5×106～107CFU之间。其中AKK单菌口服递送系统和AKK-BL混菌口服递送系统，按照实施例1制备方法制备获得，下同。
所有组小鼠，灌胃前3h撤掉食物不撤水，断食3h后，所有组肥胖小鼠不进行10％碳酸氢钠中和胃酸的操作，即PBS组直接灌胃无菌PBS，AKK菌液组直接灌胃无菌PBS洗涤重悬后的AKK菌液，AKK单菌口服递送系统组灌胃超纯水重悬后的AKK单菌口服递送系统，AKK-BL混菌口服递送系统组灌胃超纯水重悬后的AKK-BL混菌口服递送系统，灌胃操作结束2h后，恢复各组肥胖小鼠食物。
测量肥胖小鼠体重与体长(从鼻尖到肛门距离)，计算Lee’s系数。Lee’s系数是表征动物肥胖的指标，其中Lee’s系数越大，表示动物越肥胖，Lee’s系数计算公式如下：
结果如图3，从四组小鼠的Lee’s系数结果中可以得知，AKK单菌口服递送系统组与AKK-BL混菌口服递送系统相比于PBS组和AKK菌液组均能显著降低肥胖小鼠的Lee’s系数，改善肥胖小鼠的肥胖状况，而AKK菌液组降低肥胖小鼠Lee’s系数的效果并不明显。
实施例6口服递送系统改善血脂异常
对实施例5肥胖小鼠血清中与肥胖相关的指标进行检测，即血清中的总胆固醇(Total cholesterol)、甘油三酯(Triacylglycerol)2个指标进行检测。将在-20℃冰箱中保存的动物血清取出，在室温下缓冻后，分别按照南京建成总胆固醇(T-CHO)测试盒和甘油三酯(TG)测试盒进行检测，根据标准曲线计算血清中甘油三酯浓度。
结果如图4，可知，AKK单菌口服递送系统组与AKK-BL混菌口服递送系统组中肥胖小鼠的血清总胆固醇和甘油三酯均相较于PBS组和AKK菌液组有着下降趋势，证明了AKK口服递送系统与AKK-BL混菌口服递送系统在降低肥胖小鼠血清中总胆固醇含量和甘油三酯含量上具有一定效果。
实施例7口服递送系统提升AKK在肠道内的相对丰度
在实施例5最后一次灌胃后72h时间点收取了各组肥胖小鼠粪便样本，提取了粪便的基因组，并通过荧光定量PCR对各组粪便中AKK的相对丰度进行定量。
结果如图5，图中的2-ΔΔCt表示各组小鼠粪便中AKK的相对丰度相较于PBS组小鼠粪便中AKK相对丰度的增加倍数。从图5可知，AKK菌液组小鼠粪便中AKK的相对丰度相比于PBS组增加不明显不具有显著性差异。而AKK单菌口服递送系统组和AKK-BL混菌口服递送系统组相对于PBS组和AKK菌液组能够显著增加小鼠粪便中AKK的相对丰度，且AKK-BL混菌口服递送系统组增加小鼠粪便中AKK相对丰度的效果更优。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌口服递送系统，其特征在于，所述口服递送系统为以海藻酸钙-碳酸钙作壁材的微胶囊，且其芯材包括嗜黏蛋白阿克曼氏菌，所述壁材为双层结构，外层为海藻酸钙层，内层为碳酸钙层，其中碳酸钙附着在嗜黏蛋白阿克曼氏菌上，海藻酸钙包裹在碳酸钙层表面形成球形结构；
所述微胶囊，粒径大小为200um-1000um；所述海藻酸钙层，厚度为75um-500um；所述碳酸钙层，厚度为25um-200um；
所述微胶囊，还包括产生CO2的益生元，其分布于海藻酸钙层与碳酸钙层之间，所述产生CO2的益生元，包括菊粉。
2.如权利要求1所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌口服递送系统，其特征在于，所述芯材为嗜黏蛋白阿克曼氏菌和长双歧杆菌的混合益生菌。
3.一种如权利要求1或2所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌口服递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将获得的益生菌和Ca2+的混合液，涡旋震荡混匀，使得益生菌充分吸附Ca2+，加入含有CO3 2-离子的溶液使Ca2+能够完全反应，充分涡旋震荡，使得益生菌表面附着一层碳酸钙，即为碳酸钙-益生菌浑浊液，所述益生菌，包括嗜黏蛋白阿克曼氏菌；
（2）将含海藻酸盐的溶液按照预设比例加入步骤（1）获得的碳酸钙-益生菌的浑浊液中，涡旋震荡混匀，将混合液加入到含Ca2+的固定液中充分固化获得沉淀物，沉淀物经多次重悬、洗涤后，即为所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌口服递送系统；所述含海藻酸盐的溶液为海藻酸钠和菊粉的混合溶液。
4.如权利要求3所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌口服递送系统的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述益生菌和Ca2+的混合液，按照1mL的浓缩菌液加入0.1~0.3μmol的Ca2+获得，所述充分涡旋震荡，涡旋震荡时间1 -5min，涡旋速度为200r/min-800r/min；步骤（2）所述预设比例为含海藻酸盐的溶液与碳酸钙-益生菌浑浊液的体积比为1:1~1.5，其中海藻酸盐的浓度为2~8%，W/V。
5.如权利要求4所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌口服递送系统的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述混合液以喷雾形式加入固定液中，静电喷雾的条件为电喷针头与固定液液面高度在20-30厘米，静电喷雾的电压在8-12 kv，推注速度为0.5-1mL/h。
6.如权利要求5所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌口服递送系统的制备方法，其特征在于，所述菊粉的浓度为2~8%，W/V。
7.如权利要求6所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌口服递送系统的制备方法，其特征在于，所述益生菌为嗜黏蛋白阿克曼氏菌和长双歧杆菌的混合菌。
8.一种如权利要求1或2所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌口服递送系统在制备预防和改善肥胖及抑郁药物中的应用。
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