CN115448905A - 苯甲酸酯的衍生物 - Google Patents

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Abstract

苯甲酸酯的衍生物。提供了选自下述结构的化合物，所述化合物可用于对2‑(二乙氨基)乙基2‑乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品进行质控，也可用于消炎。
Figure DDA0003869353750000011

Description

苯甲酸酯的衍生物
技术领域
本申请涉及2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐的衍生物。
背景技术
化合物1的化学名称为2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐，临床上的适应症之一为用于治疗糖尿病性周围神经病理性疼痛。其结构相似的衍生物往往会成为在其生产过程中可能产生的杂质。本领域未见化合物1杂质的任何报道。
Figure BDA0003869353730000011
发明内容
本申请的目的在于提供2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐的衍生物，其可作为杂质对2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品进行质量控制，同时也具有相应的医药用途，例如消炎。
本申请一方面提供了选自下述结构的化合物：
Figure BDA0003869353730000012
以上结构中Ac为乙酰基。
本申请另一方面方面提供了选自下述结构的化合物在质控含有2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品中的应用：
Figure BDA0003869353730000021
和/或
Figure BDA0003869353730000022
本申请还有一个方面提供了一种检测2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品中杂质的方法，所述杂质选自下述结构的化合物：
Figure BDA0003869353730000023
和/或
Figure BDA0003869353730000024
所述方法包括以下步骤：
(1)提供2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品；
(2)获得所述化合物A、化合物B和/或化合物C的物理/化学特征参数；
(3)对2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品进行测试；以及
(4)将测试得到的物理/化学特征参数与所述化合物A、化合物B和/或化合物C的物理/化学特征参数进行比对，判断2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品中的杂质。
在本申请的一个实例中，所述步骤(3)中的测试选自色谱、核磁、红外、质谱和/或紫外。
在本申请的一个实例中，所述步骤(4)中的判断包括定性判断和/或定量判断。
本申请另一方面还提供了一种检测2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品中杂质的方法，所述杂质选自下述结构的化合物：
Figure BDA0003869353730000025
和/或
Figure BDA0003869353730000026
所述方法包括以下步骤：
(1)提供2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品；
(2)提供所述化合物A、化合物B和/或化合物C；以及
(3)通过比较步骤(1)中的2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品和步骤(2)中的化合物A、化合物B和/或化合物C的测试结果，判断2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品中的杂质。
在本申请的一个实例中，所述步骤(3)中的测试选自色谱、核磁、红外、质谱和/或紫外。
在本申请的一个实例中，所述步骤(3)中的判断包括定性判断和/或定量判断。
本申请还提供了一种含有2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐的产品，其特征在于，所述产品包括含量不小于98.00重量％2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐、和杂质化合物，所述杂质化合物选自如权利要求1所述化合物A、化合物B、化合物C或其组合，所述杂质化合物任一的含量小于或等于0.50重量％。
在本申请的一个实例中，所述产品包括含量不小于99.00重量％2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐。
在本申请的一个实例中，所述杂质化合物任一的含量小于或等于0.30重量％，优选所述杂质化合物任一的含量小于或等于0.20重量％，更优选所述杂质化合物任一的含量小于或等于0.10重量％。
本申请还提供了选自下述结构的化合物在制备消炎药物中的用途：
Figure BDA0003869353730000031
和/或
Figure BDA0003869353730000032
化合物A、B和C均为化合物1生产与质量控制中的关键一环。此外，他们在药学上具有抗炎作用，并具有较高的水溶性。
附图说明
图1为化合物A的电喷雾离子源(ESI)低分辨质谱图；
图2为化合物B的电喷雾离子源(ESI)低分辨质谱图；
图3为长期放置的化合物1的色谱图；
图4为化合物A对照品的色谱图；
图5为化合物1粗品的色谱图；
图6为化合物B对照品的色谱图；
图7为化合物C对照品的色谱图；
图8为逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测炎症因子单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)信使核糖核酸(mRNA)表达情况。
具体实施方式
在本说明书中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
在本说明书中，如果没有特别的说明，所提到的所有实施方案以及优选实施方案可以相互组合形成新的技术方案。
在本说明书中，如果没有特别的说明，所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
在本说明书中，如果没有特别指出，所用的术语“一种”指“至少一种”。
在本说明书中，如果没有特别说明，所有百分比、份等都表示重量。
本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。
在本文中，术语“包括”指的是所述产品中还可以含有任何其它组分，这些组分可以以任何含量存在，只要以该含量存在的该组分是人体可接受的，并对于本发明产品中活性成分的活性没有负面影响即可。
在本文中，术语“消炎”或“抗炎”具有相同的含义，都指抑制炎症因子产生或释放。通过抑制炎症因子的产生或释放，使炎症得以减轻至消退，并有可能同时使炎症引起的疼痛得以缓解。
本申请一方面提供了选自下述结构的化合物：
Figure BDA0003869353730000051
以上结构中Ac为乙酰基。
本申请另一方面方面提供了选自下述结构的化合物在质控含有2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品中的应用：
Figure BDA0003869353730000052
和/或
Figure BDA0003869353730000053
本申请还有一个方面提供了一种检测2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品中杂质的方法，所述杂质选自下述结构的化合物：
Figure BDA0003869353730000054
和/或
Figure BDA0003869353730000055
所述方法包括以下步骤：
(1)提供2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品；
(2)获得所述化合物A、化合物B和/或化合物C的物理/化学特征参数；
(3)对2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品进行测试；以及
(4)将测试得到的物理/化学特征参数与所述化合物A、化合物B和/或化合物C的物理/化学特征参数进行比对，判断2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品中的杂质。
在本申请中，所述提供2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品的步骤可以是原位合成2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐或提供市售的2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐。所述合成2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐的方法在本领域是常规的，例如可参见WO2019/095879A1等。
在本申请中，所述获得所述化合物A、化合物B和/或化合物C的物理/化学特征参数的步骤包括，例如但不限于，原位获得所述化合物A、化合物B和/或化合物C的物理/化学特征参数，或者读取预先存储的所述化合物A、化合物B和/或化合物C的物理/化学特征参数，或者根据现有技术(例如但不限于技术手册、现有文献、专利公开文献或网络资料)获得所述化合物A、化合物B和/或化合物C的物理/化学特征参数。
在一个实例中，所述原位获得所述化合物A、化合物B和/或化合物C的物理/化学特征参数包括提供所述化合物A、化合物B和/或化合物C，然后测量所述化合物A、化合物B和/或化合物C的物理/化学特征参数。
在另一个实例中，预先存储的所述化合物A、化合物B和/或化合物C的物理/化学特征参数包括但不限于以数据形式存储在存储介质(例如外部或内部存储器)中的所述化合物A、化合物B和/或化合物C的物理/化学特征参数。
在本申请中，所述物理/化学特征参数包括但不限于色谱、核磁、红外、紫外和/或质谱特征参数及该特征参数与浓度(含量、纯度)的关系。
在本申请的一个实例中，所述步骤(3)中的测试选自色谱、核磁、红外、质谱和/或紫外。对2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品进行测试(例如色谱、核磁、红外、质谱和/或紫外)的方法是常规的，本领域普通技术人员可以根据现有技术容易地进行上述测试。
在本申请的一个实例中，所述步骤(4)中的判断包括定性判断和/或定量判断。例如，可以比较步骤(3)得到的2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品的物理/化学特征参数以及步骤(2)得到的所述化合物A、化合物B和/或化合物C的物理/化学特征参数(例如色谱、核磁、红外、质谱和/或紫外的特征参数)，对2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品中的杂质(化合物A、B和/或C)进行定性或定量判断。
在本申请的一个实例中，所述定性判断包括比较色谱(例如高效液相色谱)、核磁、红外、紫外和/或质谱特征参数。例如比较色谱的停留时间、核磁的信号峰、红外的特征峰、紫外的最大吸收波长和质谱的特征峰(或者荷质比)。
在本申请的一个实例中，所述定量判断包括：内标法或标准曲线法。
在本申请的一个实例中，所述定量判断包括：(a)配置不同浓度的化合物A、化合物B和/或化合物C标准品；(b)测试不同浓度的化合物A、化合物B和/或化合物C标准品的物理/化学参数；(c)根据步骤(b)所得的物理/化学参数以及步骤(a)中的浓度做出标准曲线；以及(d)根据上述步骤(3)中所得2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品的物理/化学参数以及上述标准曲线确定2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品中化合物A、化合物B和/或化合物C的浓度。
在本申请的另一个实例中，所述定量判断包括：
(a)配置一定浓度的化合物A、化合物B和/或化合物C对照品；(b)测试化合物A、化合物B和/或化合物C对照品的色谱图，确定化合物A、化合物B和/或化合物C对应峰的峰面积；(c)测试2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品的色谱图，根据下述公式计算化合物A、化合物B和/或化合物C的浓度：
Figure BDA0003869353730000071
式中：
A样为供试品溶液化合物A或B或C的峰面积；
ASTD为化合物A或B或C对照品溶液中化合物A或B或C的峰面积；
M样为供试品的称样量(mg)；
MSTD为化合物A或B或C对照品的称样量(mg)；
V样为供试品溶液的体积(mL)；
VSTD为化合物A或B或C对照品溶液的体积(mL)；
W为化合物A或B或C对照品的含量(高于100％时，计算时以100.0％计算)。
本申请另一方面还提供了一种检测2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品中杂质的方法，所述杂质选自下述结构的化合物：
Figure BDA0003869353730000072
和/或
Figure BDA0003869353730000073
所述方法包括以下步骤：
(1)提供2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品；
(2)提供所述化合物A、化合物B和/或化合物C；以及
(3)通过比较步骤(1)中的2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品和步骤(2)中的化合物A、化合物B和/或化合物C的测试结果，判断2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品中的杂质。
在本申请中，所述提供2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品的步骤可以是原位合成2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐或提供市售的2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐。所述合成2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐的方法在本领域是常规的，例如可参见WO2019/095879A1等。
在本申请中，所述提供所述化合物A、化合物B和/或化合物C包括原位合成化合物A、化合物B和/或化合物C，或者获得已经合成的化合物A、化合物B和/或化合物C(市售或作为标准品存储)。
在本申请的一个实例中，所述步骤(3)中的测试选自色谱、核磁、红外、质谱和/或紫外。对2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品以及化合物A、化合物B和/或化合物C进行测试(例如色谱、核磁、红外、质谱和/或紫外)的方法是常规的，本领域普通技术人员可以根据现有技术容易地进行上述测试。
在本申请的一个实例中，所述步骤(3)中的判断包括定性判断和/或定量判断。例如，可以比较得到的2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品的物理/化学特征参数以及得到的所述化合物A、化合物B和/或化合物C的物理/化学特征参数(例如色谱、核磁、红外、质谱和/或紫外的特征参数)，对2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品中的杂质(化合物A、B和/或C)进行定性或定量判断。
在本申请的一个实例中，所述定性判断包括比较色谱(例如高效液相色谱)、核磁、红外、紫外和/或质谱特征参数。例如比较色谱的停留时间、核磁的信号峰、红外的特征峰、紫外的最大吸收波长和质谱的特征峰(或者荷质比)。
在本申请的一个实例中，所述定量判断包括：内标法或标准曲线法。
在本申请的一个实例中，所述定量判断包括：(a)配置不同浓度的化合物A、化合物B和/或化合物C标准品；(b)测试不同浓度的化合物A、化合物B和/或化合物C标准品的物理/化学参数；(c)根据步骤(b)所得的物理/化学参数以及步骤(a)中的浓度做出标准曲线；以及(d)根据上述步骤(3)中所得2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品的物理/化学参数以及上述标准曲线确定2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品中化合物A、化合物B和/或化合物C的浓度。
在本申请的另一个实例中，所述定量判断包括：
(a)配置一定浓度的化合物A、化合物B和/或化合物C对照品；(b)测试化合物A、化合物B和/或化合物C对照品的色谱图，确定化合物A、化合物B和/或化合物C对应峰的峰面积；(c)测试2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品的色谱图，根据下述公式计算化合物A、化合物B和/或化合物C的浓度：
Figure BDA0003869353730000091
式中：
A样为供试品溶液化合物A或B或C的峰面积；
ASTD为化合物A或B或C对照品溶液中化合物A或B或C的峰面积；
M样为供试品的称样量(mg)；
MSTD为化合物A或B或C对照品的称样量(mg)；
V样为供试品溶液的体积(mL)；
VSTD为化合物A或B或C对照品溶液的体积(mL)；
W为化合物A或B或C对照品的含量(高于100％时，计算时以100.0％计算)。
本申请还提供了一种含有2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐的产品，其特征在于，所述产品包括含量不小于98.00重量％(例如98.00-99.5重量％)2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐、和杂质化合物，所述杂质化合物选自所述化合物A、化合物B、化合物C或其组合，所述杂质化合物任一的含量小于或等于0.50重量％(例如0.01-0.50重量％)。
在本申请的一个实例中，所述产品包括含量不小于99.00重量％(例如99.00-99.5重量％)2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐。
在本申请的一个实例中，所述杂质化合物任一的含量小于或等于0.30重量％(例如0.01-0.30重量％)，优选所述杂质化合物任一的含量小于或等于0.2重量％(例如0.01-0.20重量％)，更优选所述杂质化合物任一的含量小于或等于0.10重量％(例如0.01-0.10重量％)。
本申请还提供了选自下述结构的化合物在制备消炎药物中的用途：
Figure BDA0003869353730000101
和/或
Figure BDA0003869353730000102
本申请另一方面提供了一种消炎的方法，所述方法包括将选自下述结构的化合物施用给需要治疗的个体：
Figure BDA0003869353730000103
和/或
Figure BDA0003869353730000104
下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明的范围。
实施例1：
在本实施例中，合成化合物A并表征的方法如下：
Figure BDA0003869353730000105
1)以阿司匹林为原料，在二甲基甲酰胺作用下与氯化亚砜反应得到邻乙酰水杨酰氯，后与二乙氨基乙醇反应生成2-(二乙氨基)-乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯，最后与氯化氢气反应得到2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐(即化合物1)粗品，再通过乙醇重结晶得到2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐原料。
2)称量110g化合物1于锥形瓶中，加入700mL纯净水溶解样品；冰浴磁力搅拌下，缓慢加入35g碳酸氢钠，有少量气泡逸出。搅拌至无显著气泡产生。
3)加入500mL二氯甲烷，水层有大量气泡逸出；继续搅拌至无显著气泡产生后，反应终止，萃取，分液，水层加入500mL二氯甲烷再次萃取，分液；合并有机相，用无水硫酸钠干燥，得游离碱干燥液。
4)称量78g间氯过氧苯甲酸，用500mL二氯甲烷制成悬浮液，缓慢倾入至游离碱干燥液中，控制速度防止爆沸。反应1h。反应完成后，过滤除去不溶物，旋蒸除去大部分溶剂，得到黄色油状液体。
5)向上述油状液体加入1500mL乙酸异丙酯，形成乳浊液，溶解粗品。缓慢滴加氯化氢的乙酸异丙酯溶液(折算约为化合物1投料量的1.1eq)至反应体系中，过滤，得到化合物A(纯度98.26％)。
6)在本实施例中，对化合物A进行表征：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.94(dd,J＝7.8,1.4Hz,1H),7.62(td,J＝8.0,1.5Hz,1H),7.35(t,J＝7.2Hz,1H),7.20–7.06(m,1H),4.90–4.72(m,2H),4.24–4.06(m,2H),3.84(ddt,J＝25.0,13.4,7.0Hz,4H),2.35(s,3H),1.40(t,J＝7.2Hz,6H)。
7)在本实施例中，对化合物A进行表征：13C NMR(101MHz,CDCl3)δ(ppm)＝169.51,163.42,150.58,134.53,130.88,130.84,126.05,123.69,121.86,77.32,77.00,76.68,61.45,59.24,57.41,20.93,20.88,8.05。
8)在本实施例中，还可通过红外色谱对化合物A进行定性分析，其中化合物A的红外特征与化合物1相比，明显不同在于化合物A存在有N-O键的伸缩振动，出峰范围为1500cm-1-1690cm-1，此外，其结构中形成N-O键，其铵盐的特征峰(2700～2500cm-1)处峰型和吸收强度与化合物1会明显不同。
9)在本实施例中，还可通过紫外色谱对化合物A进行定性分析，化合物A在甲醇中溶解后紫外光谱的最大吸收波长为225nm，第二大吸收波长为279nm。
10)在本实施例中，化合物A还可通过质谱进行定性测量,化合物A的质谱图见图1，离子化方式为电喷雾离子源(ESI)，离子模式为正离子模式，样品[M-Cl]+的测定值m/z为296.2。
11)在本实施例中，化合物A还可通过核磁内标法进行定量分析，内标物选择上要保证不干扰被测物质的信号峰，可以以四甲基硅烷(TMS)为内标物。
实施例2
在本实施例中，合成化合物B并表征的方法步骤如下：
Figure BDA0003869353730000121
1)称取200g化合物1加入500mL乙腈及50mL浓盐酸，常温搅拌72h。在30～40℃下减压蒸馏除去溶剂，加入600mL乙醇，搅拌加热至50～60℃，保温1h，固体全部溶解，静置至室温保温12h，抽滤，用100mL乙醇洗涤，得到湿品，在60℃干燥12h，得到2-乙酰氧基苯酚-2-(二乙氨基)乙酯盐酸盐。
2)称取250g 2-乙酰氧基苯酚-2-(二乙氨基)乙酯盐酸盐于四口瓶中，加入2100mL二氯甲烷，机械搅拌，冰浴降温至0～10℃。
3)称取96g吡啶于恒压滴液漏斗中，缓慢滴加至反应体系中，滴加完毕后继续搅拌10min。
4)内温0～10℃，称取137.5g氯乙酰氯于恒压滴液漏斗中，缓慢滴加至反应体系中，过程中控制内温0～10℃，滴加完毕后继续搅拌2～4h。
5)反应液转至单口瓶中，减压浓缩至基本无馏分蒸出，得淡黄色粘稠状固体。
6)向单口瓶中分别加入400mL异丙醇和800mL甲基叔丁基醚，控制内温0～10℃，打浆1～2h。
7)停止打浆，减压抽滤，滤饼用400mL甲基叔丁基醚洗涤数次，得到类白色固体湿品。
8)湿品放置真空干燥箱中，减压干燥，得到类白色粗品。
9)称取上述粗品置于三口瓶中，加入400mL异丙醇，机械搅拌，油浴升温。
10)内温75℃，体系未完全溶清，保温搅拌15min逐渐降温至0～10℃，期间可补加甲基叔丁基醚。
11)减压抽滤，得到类白色固体湿品。
12)湿品放置真空干燥箱中，减压干燥，得到类白固体化合物B(纯度98.4％)。
13)在本实施例中，对化合物B进行表征：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.42(s,1H),8.13(dd,J＝7.9,1.7Hz,1H),7.74(td,J＝7.8,1.7Hz,1H),7.46(td,J＝7.6,1.2Hz,1H),7.32(d,J＝8.2Hz,1H),4.64(t,J＝5.3Hz,2H),3.48(d,J＝5.2Hz,2H),3.17(s,1H),1.25(t,J＝7.2Hz,6H)。
14)在本实施例中，对化合物B进行表征：13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ(ppm)＝166.71,163.59,150.19,135.30,132.21,127.30,124.21,122.44,59.98,49.44,47.27,41.78,8.84。
15)在本实施例中，还可通过红外色谱对化合物B进行定性分析，化合物B的红外特征与化合物1相比，明显不同在于化合物B存在有C-Cl键的伸缩振动，出峰在指纹区范围为800-600cm-1。
16)在本实施例中，还可通过紫外色谱对化合物B进行定性分析，化合物B在甲醇中溶解后紫外光谱的最大吸收波长为222nm，第二大吸收波长为243nm。
17)在本实施例中，化合物B还可通过质谱进行定性测量，化合物B的质谱图见图2。离子化方式为ESI，离子模式为正离子模式，样品[M-Cl]+的测定值m/z为314.1。
18)在本实施例中，化合物B可通过核磁内标法进行定量分析，内标物选择上要保证不干扰被测物质的信号峰，可以以TMS为内标物。
实施例3
在本实施例中，合成化合物C并表征的方法步骤如下：
Figure BDA0003869353730000141
1)称量阿司匹林180g于四口瓶中，加入二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺(1mL)，搅拌，油浴升温至约30～40℃。
2)称量144g氯化亚砜于恒压滴液漏斗中，缓慢滴加至反应体系中。滴加完毕后继续搅拌1h。
3)反应终止，反应液转至单口瓶中，减压浓缩除去溶剂，得酰氯浓缩液。
4)将酰氯置于四口瓶中，加入100mL氯仿溶解，机械搅拌，油浴升温。
5)缓慢滴加118g二乙胺基乙醇(1.0eq)，过程中升温并产生回流。
6)滴加完毕，反应1h。
7)终止反应，降温至室温。向体系中加入含40g氢氧化钠的氢氧化钠冰水溶液调成碱性(pH约为8)并搅拌，分液，有机相用400mL饱和氯化钠洗涤，40g无水硫酸钠干燥过夜。萃取液过滤，浓缩，得到浓缩液。
8)取80g浓缩液置于四口瓶中，加入200mL乙酸异丙酯，室温下机械搅拌。
9)缓慢通入HCl气体，先析出黄色油状物，当pH<7.0时开始析出固体并逐渐增多。监测pH值，控制pH值>6.0。通气完毕后，继续搅拌30min，过滤。
10)滤饼转至锥形瓶中，加入100mL乙腈，加热溶解。冷却至室温，加入乙酸异丙酯并振荡混匀，直至出现的浑浊在振荡后不再溶解。将体系加热直到液体澄清，于搅拌下降温至室温，过程中析出大量颗粒状固体。固体过滤，滤饼用少量乙酸异丙酯洗涤，烘干2h，得到化合物C(纯度99.4％)。
11)在本实施例中，对化合物C进行表征：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ11.5.(brs,1H,),δ7.96(dd,1H,J＝7.8Hz),7.66(dt,1H,J＝7.6Hz),7.22(t,4H,J＝7.6Hz),7.11(d,4H,J＝7.8Hz),4.30(m,2H),3.26(t,2H,J＝5.0Hz,),3.07(brs,4H),1.89(s,3H),1.31(t,6H,J＝6.0Hz)。
12)在本实施例中，对化合物C进行表征：13C NMR(125MHz,CDCl3)δ(ppm)＝136.81,129.17,123.47,116.99,22.37,58.76,49.75,46.89,8.40。
13)在本实施例中，还可以通过红外色谱对化合物C进行定性分析：3489.5cm-1：为苯甲酸酯C＝O伸缩振动的泛频信号，对应1755.0cm-1处出现苯甲酸酯C＝O伸缩振动，表明分子中可能存在苯甲酸酯结构。3003.3、2948.3cm-1：为甲基或亚甲基的C-H伸缩振动，表明分子中可能存在甲基或亚甲基结构。2578.9、2478.7cm-1：为铵盐的N-H伸缩振动，表明分子中可能存在铵盐的结构。1614.0、1591.4、1466.5cm-1：为苯环骨架的C＝C伸缩振动，表明分子中可能存在苯环结构。1393.8、1302.4cm-1：为甲基的C-H弯曲振动，表明分子中可能存在甲基结构。1270.5、1254.5cm-1：为苯甲酸酯的C-O弯曲振动，表明分子中可能存在苯甲酸酯结构。
14)在本实施例中，还可通过紫外色谱对化合物C进行定性分析：化合物C在甲醇中溶解后紫外光谱的最大吸收波长为205nm，第二大吸收波长为237nm。
15)在本实施例中，化合物C还可通过高分辨质谱进行定性测量，离子化方式为ESI，离子模式为正离子模式，样品[M-Cl]+的准确质量测定值m/z为280.1。
16)在本实施例中，化合物C还可通过核磁内标法进行定量分析，内标物选择上要保证不干扰被测物质的信号峰，可以以TMS为内标物。
实施例4
本实施例举例说明化合物A、B和C在化合物1质量控制及其中间体生产过程控制时作为杂质对照品的用途：
1.化合物1的制备流程：
化合物1(2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐)的制备方法可参见实施例1，或参考现有技术。
2.化合物A的来源及检测方法
2.1对化合物1成品长时间放置后的检测以及强降解实验结果均表明化合物1结构中的叔胺会由于氧化剂(如空气中的氧)的存在而产生氧化反应，得到化合物1的氮氧化物，即化合物A。为了研究化合物1在长期储存及运输中的稳定性，需开发一种分析方法检测化合物A(杂质)的含量，进而对化合物1的成品质量进行控制。
2.2化合物A的检测方法
2.2.1色谱条件：依照高效液相色谱法测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250mm×4.6mm，5μm)；柱温为33℃；流速为1.0mL/min；进样体积为10μL；检测波长为276nm；流动相为缓冲盐水溶液-甲醇-冰醋酸(66:24:10)。
2.2.2溶液配制:
1)供试品溶液：取长期放置的化合物1作为供试品约100mg，精密称定，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液，可选择一式两份。
2)化合物A对照品溶液：取化合物A对照品约20mg，精密称定，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，摇匀，作为化合物A对照品溶液。
2.2.3.测定法：精密量取化合物A对照品溶液与供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。
2.2.4含量计算
Figure BDA0003869353730000161
式中：
A样为供试品溶液中化合物A的峰面积；
ASTD为化合物A对照品溶液中化合物A的峰面积；
M样为供试品的称样量(mg)；
MSTD为化合物A对照品的称样量(mg)；
V样为供试品溶液的体积(mL)；
VSTD为化合物A对照品溶液的体积(mL)；
W为化合物A对照品的含量(高于100％时，计算时以100.0％计算)。
供试品溶液色谱检测结果如图3所示，其中，化合物A的出峰时间为8.6min左右，化合物1的出峰时间为6.2min左右。化合物A对照品色谱检测结果如图4所示。
代入公式一，
其中，
A样为供试品溶液化合物A的峰面积，取值121719；
ASTD为化合物A对照品溶液中化合物A的峰面积，取值483700；
M样为供试品的称样量(mg)，取值100.71mg；
MSTD为化合物A对照品的称样量(mg)，取值19.89mg；
V样为供试品溶液的体积(mL)，取值为10mL；
VSTD为化合物A对照品溶液的体积(mL)，取值为100mL；
W为化合物A对照品的含量，取值为98.7％。
经计算后，供试品溶液中化合物A的含量为0.49％
3.化合物B和C的来源及检测方法
3.1在化合物1合成过程中的第1步(邻乙酰水杨酰氯生成过程)中会有副产物氯乙酰水杨酰氯生成，该化合物的来源为原料阿司匹林在酸性条件下水解生成的水杨酸与氯化亚砜反应所产生。而氯乙酰水杨酰氯在后续反应步骤中会分别与二乙氨基乙醇反应，并在后续步骤(通入氯化氢气体)后继续成盐。在理论上及成品的检测中均发现了该杂质的存在，即化合物B。
化合物1制备过程中第1步的产物为邻乙酰水杨酰氯，因邻乙酰水杨酰氯结构中乙酰基与酰氯基团的存在会自身发生环化反应，生成副产物2-氯-2-甲基-4氢-苯并-1,3-二噁英-4-酮，同样地，由于氯原子的存在，在后续反应中它会与二乙氨基乙醇反应，并在后续步骤(通入氯化氢气体)后继续成盐。在理论上及成品的检测中均发现了该杂质的存在，即化合物C。
3.2化合物B和C的检测方法
3.2.1色谱条件：依照高效液相色谱法测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250mm×4.6mm，5μm)；柱温为33℃；流速为1.0mL/min；进样体积为10μL；检测波长为276nm；流动相为缓冲盐水溶液-甲醇-冰醋酸(63:27:10)。
3.2.2溶液配制:
1)供试品溶液：取化合物1粗品作为供试品约100mg，精密称定，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液，可选择一式两份。
2)化合物B和C对照品溶液：取化合物B和C对照品各约20mg，精密称定，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，摇匀，作为化合物B和C对照品溶液。
3.2.3.测定法：精密量取化合物B和C对照品溶液与供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。
3.2.4含量计算
Figure BDA0003869353730000181
式中：
A样为供试品溶液化合物B或C的峰面积；
ASTD为化合物B或C对照品溶液中化合物B或C的峰面积；
M样为供试品的称样量(mg)；
MSTD为化合物B或C对照品的称样量(mg)；
V样为供试品溶液的体积(mL)；
VSTD为化合物B或C对照品溶液的体积(mL)；
W为化合物B或C对照品的含量(高于100％时，计算时以100.0％计算)。
当前色谱条件下化合物B和C出峰位置如图5所示，其中，化合物B的出峰时间为7.7min左右，化合物C的出峰时间为8.1min左右，化合物1的出峰时间为5.6min左右。
化合物B对照品检测结果如图6所示，代入公式二中。其中，
A样为供试品溶液化合物B的峰面积，取值92777；
ASTD为化合物B对照品溶液中化合物B的峰面积，取值9802329；
M样为供试品的称样量(mg)，取值99.95mg；
MSTD为化合物B对照品的称样量(mg)，取值20.21mg；
V样为供试品溶液的体积(mL)，取值为10mL；
VSTD为化合物B对照品溶液的体积(mL)，取值为100mL；
W为化合物B对照品的含量，取值为99.7％。
经计算后，供试品溶液中化合物B的含量为0.02％。
化合物C对照品检测结果如图7所示，代入公式二中。其中，。
A样为供试品溶液化合物C的峰面积，取值68429；
ASTD为化合物C对照品溶液中化合物C的峰面积，取值467641；
M样为供试品的称样量(mg)，取值99.95mg；
MSTD为化合物C对照品的称样量(mg)，取值20.21mg；
V样为供试品溶液的体积(mL)，取值为10mL；
VSTD为化合物C对照品溶液的体积(mL)，取值为100mL；
W为化合物C对照品的含量，取值为92.5％。
经计算后，供试品溶液中化合物C的含量为0.27％。
实施例5
本实施例举例说明化合物A、B、C具有优异的溶解度。
称取约0.2g的待测化合物(A或B或C)置10mL样品管，加入2mL纯化水，混匀。若完全溶解，继续补加约0.2g待测化合物，混匀，直至过饱和状态或待测化合物添加至2.0g。若待测化合物添加至2.0g，仍然完全溶清，则记录待测化合物在水中的溶解度>1.0g/mL。
通过实验证明，化合物A、化合物B与化合物C的溶解度均大于1.0g/mL。
实施例6
本实施例举例说明化合物A，B，C均显示出剂量依赖的抑制单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)信使核糖核酸(mRNA)水平，提示较好的抗炎药效。
1.溶液配制：
1.1阴性对照溶液：阴性对照为二甲基亚砜(DMSO)，无需配制，可直接使用。
1.2 DMEM培养基：将1L用量的DMEM粉末(高糖，丙酮酸盐)加入950mL超纯水中并向培养基中加入3.7g无水碳酸氢钠。用1M HCl调节pH值到7.2并用超纯水定容至1L。最后用0.22μm定容过滤器通过膜过滤将培养基过滤到无菌容器中。(过滤后，pH值可能会上升0.1到0.3个单位)
1.3阳性对照药物的配置：地塞米松溶液：将1.95mg地塞米松中加到5mL DMSO中，晃动使其溶解。得1000×溶液(10mM)。进行分装，-20℃冰箱保存。
1.4供试品溶液配制：
化合物A/化合物B/化合物C：称取适当质量的供试品溶于DMSO中，配制成终浓度为1M的溶液，分装后置于-20℃保存。
1.5青/链霉素双抗溶液：800万单位/瓶的青霉素加40mL超纯水混匀，1g/瓶的链霉素加50mL超纯水混匀，两者体积比1:1混合，得100×青链霉素双抗溶液(含10万单位/mL青霉素和10mg/mL的链霉素)。经0.22μm无菌微孔滤膜膜过滤后，分装10mL/管，-20℃冰箱保存。
1.6缓冲液配制：
PBS：分别称量8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4于1L容量瓶中，加超纯水至900mL，用浓盐酸调至pH 7.2，并定容至1L。室温保存。
2.细胞培养(复苏，传代和冻存)：
2.1 H9c2细胞复苏(来源：中科院细胞库，37℃保存)：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL DMEM完全培养基(10％胎牛血清(FBS)和1％青/链霉素双抗溶液)混合均匀。在1000rpm条件下离心4min，弃去上清液，加入4mL DMEM完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入T25细胞培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约6mL培养基，培养过夜)。细胞培养瓶水平上下晃动两次，水平左右晃动两次，确保细胞在培养瓶中分布均匀。第二天换液并检查细胞密度。
2.2 H9c2细胞传代和铺板：如果细胞密度达80％～90％，即可进行传代培养。弃去培养上清，用不含钙、镁离子的500μL PBS轻轻左右晃动，润洗细胞1～2次后弃去。加500μL胰蛋白酶(H9c2细胞使用浓度为0.25％)于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化4min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，细胞大部分变圆并脱落，拿回操作台，加2mL DMEM完全培养基(DMEM培养基与胰蛋白酶体积比＝1:4)终止消化，并利用DMEM完全培养基将尚未脱落的细胞冲洗下来。按6～8mL/瓶补加DMEM完全培养基，轻轻打匀后吸出，在1000rpm条件下离心6min，弃去上清液，加2mL DMEM完全培养基重悬细胞。
如果进行细胞传代，则将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8mL DMEM完全培养基的新皿中或者5mL T25细胞培养瓶中。
3.细胞实验：
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导H9c2细胞炎症模型筛选抗炎药物
6孔细胞培养板中的H9c2细胞，弃掉培养上清，PBS润洗2次，进行药物孵育，实验孔设置分为：空白对照组、模型对照组、阳性对照组以及实验组。实验组细分为高剂量组、中剂量组以及低剂量组。PBS润洗后，空白组和模型组加入0.98mL DMEM培养基(含0.5％DMSO)，阳性对照组每孔分别加入含终浓度为10μM地塞米松。实验组分为化合物A、化合物B和化合物C组每种药物设三个浓度梯度，即高、中、低剂量，均用DMEM培养基稀释。化合物A和化合物C的工作浓度分别为5mM、1mM和0.2mM，化合物B的工作浓度分别为3mM、1mM和0.2mM。6孔板每孔加入上述溶液后与细胞孵育2h。2h后，禁止弃掉DMEM培养基，除空白对照组以外，所有组均加入20μL含浓度为500ng/mL TNF-α的DMEM培养基，使最终TNF-α的工作浓度为10ng/mL，诱导细胞炎症反应。1h后弃掉培养上清，PBS润洗后收集细胞提取RNA。
4.细胞样品处理：
4.1细胞总RNA提取过程
使用TRizol试剂制备细胞总核糖核酸(RNA)，操作如下：
组织匀浆：加入1mL的TRizol到含有细胞的6孔板中，将细胞刮下。吹打均匀后转移至1.5mL EP管中。
液相分离：加入0.2mL的氯仿，剧烈手摇15s，室温放置2～3min后离心4℃，12000rpm，15min。(离心后分成三层，下层的红色为组织沉渣及酚-氯仿相，中间层为蛋白和脱氧核糖核酸(DNA)，上层是无色的水相，RNA只存在于水相中。)
RNA沉淀与洗涤：将上层水相转移到另一干净的EP管中(注意宁少勿多，不要取到中间层)，加入0.5mL异丙醇，用手摇匀，室温静置10min，然后离心4℃，12 000rpm，10min。离心后可以在管的侧壁和底部看到白色沉淀，为RNA沉淀。去上清，加入1mL 75％乙醇(需DEPC水)，上下颠倒摇匀，使沉淀飘起，4℃，7500rpm，5min。
RNA再溶解：轻轻倒掉上清，勿丢失沉淀，然后短暂离心，将残余上清甩到管底，用200μL和10μL枪将上清吸尽。开盖，空气干燥5～10min。用DEPC水20～50μL重悬RNA沉淀，用枪头反复吹打几次。
测浓度：以DEPC水作空白对照，测OD260/280值。1OD＝40μg RNA。OD260/280值在1.8～2.0视为纯度很高。一般浓度在1000ng/mL以下较准。浓度太高要稀释以后再测定。OD260/280在1.8～2.0之间表示RNA质量较好；大于2.2时，说明RNA已水解为单核苷酸；小于1.8时，说明有蛋白质污染。RNA提取结束后，当天取一部分进行反转录；剩余的标记好，放-80℃保存。
4.2反转录mRNA合成cDNA的第一条链
采用两步法反转录mRNA合成cDNA的第一条链，具体操作如下：
逆转录反应体系配制(10μL体系)：在反应管中直接加入5×PrimeScript RTMaster Mix、总RNA以及DEPC水，最后用移液枪轻轻吹打混匀。
表1逆转录反应体系配制
Figure BDA0003869353730000221
表2逆转录程序设置
Figure BDA0003869353730000222
逆转录产物可立即用于实时聚合酶链式反应(qPCR)反应，也可-20℃短期保存，若长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。逆转录产物要测cDNA浓度，仪器空白调零用DEPC水，测得的样本cDNA可直接用做qPCR检测。
5.逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测
5.1引物设计及RT-PCR
以微管蛋白(Tubulin)作为内参基因，设计目的炎症相关基因MCP-1的引物，并由上海派森诺生物科技股份有限公司或生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息见表3(H9c2细胞适用)。
表3大鼠RT-PCR的引物序列
Figure BDA0003869353730000231
5.2 RT-PCR
以cDNA为模版，使用SYBR Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)配制RT-PCR体系(表4)。使用Roche Light Cycle 480II 96Real-Time PCR System进行反应，扩增程序如下：95℃预变性30s，95℃变性5s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环40次，添加熔解曲线，每个循环结束检测荧光信号。
表4 RT-PCR体系
Figure BDA0003869353730000232
6.试验分组与方法
6.1.分组及给药信息
表5分组及给药信息
Figure BDA0003869353730000233
Figure BDA0003869353730000241
6.2.试验方法
6.2.1.造模方法
H9c2细胞炎症诱导模型造模条件如下：10ng/mL TNF诱导1h。
6.2.2.药效指标测定
H9c2细胞模型选取炎症因子MCP-1作为抗炎药效指标。以RT-PCR法检测炎症因子MCP-1mRNA表达情况。见图8。
7.结论
在TNF诱导H9c2细胞模型下，化合物A、B、C在一定剂量范围内，具有剂量依赖的抑制炎症因子MCP-1mRNA水平的升高。说明化合物A、B、C具有抗炎活性。

Claims (10)

1.选自下述结构的化合物：
Figure FDA0003869353720000011
2.选自下述结构的化合物在质控含有2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品中的应用：
Figure FDA0003869353720000012
和/或
Figure FDA0003869353720000013
3.一种检测2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品中杂质的方法，所述杂质选自下述结构的化合物：
Figure FDA0003869353720000014
和/或
Figure FDA0003869353720000015
所述方法包括以下步骤：
(1)提供2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品；
(2)获得所述化合物A、化合物B和/或化合物C的物理/化学特征参数；
(3)对2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品进行测试；以及
(4)将测试得到的物理/化学特征参数与所述化合物A、化合物B和/或化合物C的物理/化学特征参数进行比对，判断2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品中的杂质；
优选地，所述步骤(3)中的测试选自色谱、核磁、红外、质谱和/或紫外。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的判断包括定性判断和/或定量判断。
5.一种检测2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品中杂质的方法，所述杂质选自下述结构的化合物：
Figure FDA0003869353720000021
和/或
Figure FDA0003869353720000022
所述方法包括以下步骤：
(1)提供2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品；
(2)提供所述化合物A、化合物B和/或化合物C；以及
(3)通过比较步骤(1)中的2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品和步骤(2)中的化合物A、化合物B和/或化合物C的测试结果，判断2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐产品中的杂质；
优选地，所述步骤(3)中的测试选自色谱、核磁、红外、质谱和/或紫外。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的判断包括定性判断和/或定量判断。
7.一种含有2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐的产品，其特征在于，所述产品包括含量不小于98.00重量％2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐、和杂质化合物，所述杂质化合物选自如权利要求1所述化合物A、化合物B、化合物C或其组合，所述杂质化合物任一的含量小于或等于0.50重量％。
8.如权利要求7所述的产品，其特征在于，所述产品包括含量不小于99.00重量％2-(二乙氨基)乙基2-乙酰氧基苯甲酸酯盐酸盐。
9.如权利要求7或8所述的产品，其特征在于，所述杂质化合物任一的含量小于或等于0.30重量％；优选地，所述杂质化合物任一的含量小于或等于0.20重量％；更优选，所述杂质化合物任一的含量小于或等于0.10重量％。
10.选自下述结构的化合物在制备消炎药物中的用途：
Figure FDA0003869353720000031
和/或
Figure FDA0003869353720000032
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