CN114276388A

CN114276388A - 一种二茂铁哌嗪酰胺类化合物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN114276388A
Application number: CN202111406667.8A
Authority: CN
Inventors: 阮班锋; 唐小飞; 陈刘增; 郭庆垒
Original assignee: Hefei University
Current assignee: Hefei University
Priority date: 2021-11-24
Filing date: 2021-11-24
Publication date: 2022-04-05

Abstract

本发明公开了一种二茂铁哌嗪酰胺类化合物及其制备方法与应用，涉及药物化学技术领域，本发明设计并合成了一系列具有新型结构的二茂铁哌嗪酰胺类化合物，并对其结构进行了表征；制备这些化合物所采用的方法具有原料易得、操作简便、收率高的特点，能够快速合成目标化合物；同时测试了这些化合物的抗炎活性，从中筛选出高活性的化合物以用于开发新型抗炎药物。

Description

一种二茂铁哌嗪酰胺类化合物及其制备方法与应用

技术领域：

本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种二茂铁哌嗪酰胺类化合物及其制备方法与应用。

背景技术：

二茂铁又称二环戊二烯合铁，是化学式为Fe(C₅H₅)₂的有机金属化合物。二茂铁及其衍生物能够应用在医药领域，主要是因为它们具有以下的结构和性质：(1)具有亲油性的基团，能够顺利地进入到细胞内部，这使得它们可以和细胞内的各种酶发生反应；(2)具有芳香环的一些特殊性质，可以和亲电试剂发生反应，容易塑造成目标结构；(3)具有很低的毒性，这是其他一些化学品没有的性质；(4)具有氧化和还原的双向可逆性，可以在相关酶的作用下参与体内新陈代谢的生理过程。由于结构和性能的特殊性，使得二茂铁及其衍生物在医学、生物学和微生物学等方面有着广泛的应用，可以作为新兴抗肿瘤药物、抗菌剂等。

本发明旨在利用药物拼合原理设计并合成得到一种新型二茂铁哌嗪酰胺类化合物，期望从中筛选出具有良好抗炎活性的化合物，进而为研究新型抗炎药物奠定重要基础。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于设计并合成一种具有新型结构的二茂铁哌嗪酰胺类化合物，并测试这些化合物的抗炎活性，从中筛选出高活性的化合物以用于开发新型抗炎药物。

本发明所要解决的技术问题采用以下的技术方案来实现：

本发明的一个目的是提供一种二茂铁哌嗪酰胺类化合物，其结构如式I和式II所示：

式I中，R为苯基、取代苯基；

式II中，R′为苯基、取代苯基、萘基。

进一步地，式I中，R为

式II中，R′为

化合物的结构式具体见表1。

表1

本发明的第二个目的是提供一种上述二茂铁哌嗪酰胺类化合物的制备方法，由二茂铁甲酸与1-Boc-哌嗪反应得到中间体1，将中间体1进行Boc脱保护得到中间体2，中间体2与R-SO₂Cl反应得到化合物4a-i，或者中间体2与R′-COCl反应得到化合物5a-h。

合成路线如下：

所述二茂铁甲酸与1-Boc-哌嗪的摩尔比为1:(1-1.1)。

所述中间体2与R-SO₂Cl的摩尔比为1:(1-1.1)。

所述中间体2与R′-COCl的摩尔比为1:(1-1.1)。

所述R-SO₂Cl中的R为

所述R′-COCl中的R′为

本发明的第三个目的是提供一种上述二茂铁哌嗪酰胺类化合物在制备抗炎药物中的应用。

本发明的有益效果是：本发明设计并合成了一系列具有新型结构的二茂铁哌嗪酰胺类化合物，并对其结构进行了表征；制备这些化合物所采用的方法具有原料易得、操作简便、收率高的特点，能够快速合成目标化合物；同时测试了这些化合物的抗炎活性，从中筛选出高活性的化合物以用于开发新型抗炎药物。

附图说明：

图1为所有化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放的抑制作用(抑制率)；

图2为所有化合物对RAW264.7细胞的毒性作用；

图3为化合物4e、4h、4i对LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放的抑制作用(IC₅₀)；

图4为化合物4i对iNOS和COX-2表达的影响；

图5为化合物4i对NF-κB和MAPKs信号通路的影响。

具体实施方式：

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例和图示，进一步阐述本发明。

实施例1

1)中间体1的合成：

向二氯甲烷(15mL)中加入二茂铁甲酸(10.0mmol)、EDCI(11.0mmol)、HOBt(11.0mmol)，再加入溶有1-Boc-哌嗪(10.0mmol)的二氯甲烷(15mL)溶液，在室温下搅拌反应，TLC监测反应。反应结束，去除溶剂，向残余物中加入乙酸乙酯，用水和盐水洗涤，取有机层干燥后真空浓缩得到粗产物，粗产物通过柱层析纯化，得到中间体1。

2)中间体2的合成：

在室温下，向二氯甲烷(5mL)中加入中间体1(1mmol)，再逐滴加入CF₃COOH(0.5mL)，TLC监测反应。反应结束，去除溶剂，向残余物中加水，调节pH值为稍碱性。所得混合物用乙酸乙酯萃取，合并有机层，干燥后真空浓缩，得到中间体2。

3)ferrocenyl(4-(o-tolylsulfonyl)piperazin-1-yl)methanone(化合物4a)的合成：

向二氯甲烷(5mL)中加入中间体2(1.0mmol)、2-甲基苯磺酰氯(1.0mmol)和三乙胺(0.1mL)。在室温下搅拌反应，TLC监测反应。反应结束，去除溶剂，向残余物中加入乙酸乙酯，用水和盐水洗涤，取有机层干燥后真空浓缩得到粗产物，粗产物通过柱层析纯化，得到化合物4a。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.90(s,1H),7.55(s,1H),7.04(s,2H),4.53(s,2H),4.33(s,2H),4.24(s,5H),3.93-3.83(m,7H),3.25(s,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.0,156.9,134.9,131.8,125.8,120.5,112.4,70.3,70.0,69.4,56.1,46.1.

实施例2

(4-((2-methoxyphenyl)sulfonyl)piperazin-1-yl)(ferrocenyl)methanone(化合物4b)的合成：

制备方法同实施例1，只是将实施例1中的2-甲基苯磺酰氯替换为2-甲氧基苯磺酰氯，得到化合物4b。

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ7.86(d,J＝6.0,1H),7.46(s,1H),7.31(s,2H),4.48(s,2H),4.29(s,2H),4.19(s,5H),3.76(s,4H),3.14(s,4H),2.61(s,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.1,138.0,135.1,133.2,133.0,130.3,126.3,70.3,70.0,69.4,45.4,20.9.

实施例3

(4-((2-fluorophenyl)sulfonyl)piperazin-1-yl)(ferrocenyl)methanone(化合物4c)的合成：

制备方法同实施例1，只是将实施例1中的2-甲基苯磺酰氯替换为2-氟苯磺酰氯，得到化合物4c。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.83(s,1H),7.60(s,1H),7.28(s,2H),4.49(s,2H),4.31(s,2H),4.20(s,5H),3.81(s,4H),3.19(s,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.2,160.6,160.2,158.7,157.7,135.5,131.3,124.8,124.7,117.6,117.4,70.3,70.0,69.5,45.9.

实施例4

(4-((2-chlorophenyl)sulfonyl)piperazin-1-yl)(ferrocenyl)methanone(化合物4d)的合成：

制备方法同实施例1，只是将实施例1中的2-甲基苯磺酰氯替换为2-氯苯磺酰氯，得到化合物4d。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.08(s,1H),7.56(s,2H),7.44(s,1H),4.61(s,2H),4.41(s,2H),4.32(s,5H),4.00(m,4H),3.35(s,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.1,135.7,134.0,132.4,132.3,132.2,127.2,70.3,70.0,69.4,45.9.

实施例5

(4-((2-bromophenyl)sulfonyl)piperazin-1-yl)(ferrocenyl)methanone(化合物4e)的合成：

制备方法同实施例1，只是将实施例1中的2-甲基苯磺酰氯替换为2-溴苯磺酰氯，得到化合物4e。

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ8.04(s,1H),7.70(s,1H),7.40(s,2H),4.45(s,2H),4.24-4.17(m,7H),3.74(m,4H),3.26(s,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.1,137.3,136.0,134.0,132.4,127.7,120.4,70.3,70.0,69.4,45.8.

实施例6

ferrocenyl(4-(m-tolylsulfonyl)piperazin-1-yl)methanone(化合物4f)的合成：

制备方法同实施例1，只是将实施例1中的2-甲基苯磺酰氯替换为3-甲基苯磺酰氯，得到化合物4f。

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ7.51(s,2H),7.40(s,2H),4.45(s,2H),4.27(s,2H),4.16(s,5H),3.78(s,4H),2.97(s,4H),2.41(s,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.0,139.5,135.0,134.0,129.1,128.0,124.9,70.3,70.0,69.4,46.2,21.4.

实施例7

(4-((3-fluorophenyl)sulfonyl)piperazin-1-yl)(ferrocenyl)methanone(化合物4g)的合成：

制备方法同实施例1，只是将实施例1中的2-甲基苯磺酰氯替换为3-氟苯磺酰氯，得到化合物4g。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.55-7.36(m,4H),4.50(s,2H),4.32(s,2H),4.22(s,5H),3.83(m,4H),3.04(m,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.2,163.8,161.3,137.5,131.2,131.1,123.5,123.4,120.6,120.4,115.2,114.9,70.3,70.0,69.4,46.1.

实施例8

(4-((3-chlorophenyl)sulfonyl)piperazin-1-yl)(ferrocenyl)methanone(化合物4h)的合成：

制备方法同实施例1，只是将实施例1中的2-甲基苯磺酰氯替换为3-氯苯磺酰氯，得到化合物4h。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.74-7.52(m,4H),4.51(s,2H),4.33(s,2H),4.23(s,5H),3.85(m,4H),3.04(m,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.2,137.2,135.6,133.4,130.6,127.7,125.8,70.3,70.0,69.5,46.1.

实施例9

(4-((3-bromophenyl)sulfonyl)piperazin-1-yl)(ferrocenyl)methanone(化合物4i)的合成

制备方法同实施例1，只是将实施例1中的2-甲基苯磺酰氯替换为3-溴苯磺酰氯，得到化合物4i。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.90(s,1H),7.77(s,1H),7.68(s,1H),7.45(s,1H),4.50(s,2H),4.33(s,2H),4.22(s,5H),3.83(m,4H),3.04(m,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.2,137.3,136.3,130.8,130.5,126.2,123.4,70.3,70.0,69.4,46.1.

实施例10

(2-fluorophenyl)(4-ferrocenylpiperazin-1-yl)methanone(化合物5a)的合成：

制备方法同实施例1，只是将实施例1中的2-甲基苯磺酰氯替换为2-氟苯甲酰氯，得到化合物5a。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.42(s,2H),7.29-7.23(m,1H),7.13(t,J＝12.0,1H),4.57(s,2H),4.35(s,2H),4.25(s,5H),3.86(s,4H),3.72(s,2H),3.37(s,2H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.2,165.4,159.3,156.8,131.7,129.3,124.9,123.6,116.0,115.8,70.3,70.0,69.4,47.1,42.3.

实施例11

(4-ferrocenylpiperazin-1-yl)(3-fluorophenyl)methanone(化合物5b)的合成：

制备方法同实施例1，只是将实施例1中的2-甲基苯磺酰氯替换为3-氟苯甲酰氯，得到化合物5b。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.46-7.40(m,1H),7.21(d,J＝12.0,1H),7.16(s,1H),7.15(d,J＝12.0,1H),4.57(s,2H),4.36(s,2H),4.26(s,5H),3.81-3.40(m,8H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.4,163.6,161.5,130.5,122.7,117.1,114.4,70.4,70.0,69.6,46.3.

实施例12

(4-ferrocenylpiperazin-1-yl)(4-fluorophenyl)methanone(化合物5c)的合成：

制备方法同实施例1，只是将实施例1中的2-甲基苯磺酰氯替换为4-氟苯甲酰氯，得到化合物5c。

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ7.44-7.41(m,2H),7.12-7.09(m,2H),4.57(s,2H),4.35(s,2H),4.26(s,5H),3.76-3.37(m,8H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ169.8,164.9,129.6,129.5,115.9,115.7,70.3,70.0,69.5.

实施例13

(4-ferrocenylpiperazin-1-yl)(2-bromophenyl)methanone(化合物5d)的合成：

制备方法同实施例1，只是将实施例1中的2-甲基苯磺酰氯替换为2-溴苯甲酰氯，得到化合物5d。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.60(d,J＝12.0,1H),7.39(t,J＝12.0,1H),7.28(s,2H),4.55(s,2H),4.34(s,2H),4.24(s,5H),3.92-3.73(m,6H),3.31-3.23(m,2H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.2,167.9,137.5,132.9,130.6,127.9,127.7,119.1,70.3,70.0,69.4,46.8,41.9.

实施例14

(4-ferrocenylpiperazin-1-yl)(3-bromophenyl)methanone(化合物5e)的合成：

制备方法同实施例1，只是将实施例1中的2-甲基苯磺酰氯替换为3-溴苯甲酰氯，得到化合物5e。

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ7.57-7.56(m,2H),7.32-7.29(m,2H),4.54(s,2H),4.32(s,2H),4.23(s,5H),3.75-3.44(m,8H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.2,168.9,137.2,133.1,130.3,125.6,122.8,70.3,70.0,69.5,47.7,42.5.

实施例15

(4-bromophenyl)(4-ferrocenylpiperazin-1-yl)methanone(化合物5f)的合成：

制备方法同实施例1，只是将实施例1中的2-甲基苯磺酰氯替换为4-溴苯甲酰氯，得到化合物5f。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.60(s,2H),7.33(s,2H),4.58(s,2H),4.37(s,2H),4.27(s,5H),3.79(s,6H),3.49(s,2H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.3,134.0,131.9,128.9,124.5,70.3,70.0,69.5,50.8.

实施例16

(4-ferrocenylpiperazin-1-yl)(3-chlorophenyl)methanone(化合物5g)的合成：

制备方法同实施例1，只是将实施例1中的2-甲基苯磺酰氯替换为3-氯苯甲酰氯，得到化合物5g。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.74-7.29(m,4H),4.57(s,2H),4.36(s,2H),4.26(s,5H),3.80-3.47(m,8H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ170.3,169.1,137.0,134.8,130.2,130.1,127.3,125.2,70.3,70.0,69.5.

实施例17

(4-ferrocenylpiperazin-1-yl)(naphthalen-1-yl)methanone(化合物5h)的合成：

制备方法同实施例1，只是将实施例1中的2-甲基苯磺酰氯替换为1-萘甲酰氯，得到化合物5h。

¹HNMR(600MHz,CDCl₃)δ7.89-7.82(m,3H),7.53-7.41(m,4H),4.51(s,2H),4.30-4.21(m,7H),4.00-3.91(m,4H),3.60-3.53(m,2H).

抗炎活性评价：

1、相关溶液的配置

(1)PBS缓冲液：量取50mL 10×PBS缓冲液，加450mL双蒸水使溶液浓度稀释为1×PBS缓冲液，分装高压，4℃冰箱放置备用。

(2)噻唑蓝(MTT)溶液：称取MTT粉，在无菌操作台上用高压后的无菌PBS缓冲液避光配制成5mg/mL的储备液，配置后用锡纸避光保存于4℃冰箱，可长期保存于-20℃冰箱。

2、Griess实验

采用Griess法检测所有化合物对LPS诱导的NO产生的抑制作用，在一定程度上可以反应出化合物的抗炎活性。

(1)观察细胞生长状况，收集对数生长期的细胞，细胞计数，加入适当的培养基，每孔加入500μL培养基使得细胞密度每孔约为4×10⁶，二氧化碳恒温培养箱中孵育过夜。

(2)隔夜后，向实验组中加入设定好的五个浓度梯度(1.25，2.5，5，10，20μM)的药物，空白组和对照组换新鲜的培养基500μL即可。

(3)加完药后，培养箱孵育1h，加入LPS(1μg/mL)(由高浓度稀释得到)。

(4)细胞培养板置于二氧化碳恒温培育箱中孵育一天，然后分别提取上清液于EP管中，按照NO检测试剂盒的要求检测。

(5)取出Griess Reagent I和II，并且让温度达到室温条件。

(6)用待测样品所用溶液稀释标准品(1-100μM)。例如样品为细胞培养液上清，用高糖培养基稀释标准品。通常标准品的浓度可取0，1，2，5，10，20，40，60，100μM。

(7)按50μL/孔，在各孔中先加入室温Griess Reagent I。随后，同上一步加入等体积Griess Reagent4I。注意此步骤避光操作。

(8)酶标仪540nm测定吸光度。

在浓度为20μM时，化合物4e、4h、4i对RAW264.7中NO释放的抑制作用最强，尤其是化合物4i的抑制作用和阳性对照相当，结果见图1。

进一步测定化合物4e、4h、4i对RAW264.7中NO释放的抑制作用强度，其IC₅₀值分别为13.74、13.00和7.65μM，结果见图2。

3、MTT法检测细胞毒性

采用MTT法来检测化合物对RAW264.7细胞的毒性。

(1)细胞铺板：根据细胞生长情况将对数生长期细胞收集并细胞计数，每孔加入100μL混合细胞的的培养基，密度控制在每孔7×10⁴，最外围一圈加PBS防止溶剂挥发，只用中间的60个孔，并同时设空白对照组(培养基)、阴性对照组(培养基+细胞)、实验组(培养基+细胞+化合物)且每组实验均要设置3个副孔。

(2)细胞培养：在二氧化碳恒温培养箱内过夜培养，不同的细胞有专用的培养基，一般化合物浓度按照二倍法设置五个浓度梯度，每组浓度均有三个副孔确保结果的准确。

(3)加入化合物，过夜培养的细胞大多会贴壁生长，我们吸去每个孔中的培养基，然后按照之前的设置将混含着药物的培养基沿着孔壁慢慢加入，不要使铁壁细胞再次漂浮，再向其他两组实验补满100μL培养基。

(4)细胞经过培养箱培养一段时间后，用排枪向每个孔中加入事先配制好浓度的MTT，培养箱培养4h后拿出，用注射器小心的洗掉培养基，不能刮掉底部的细胞，随后每个孔中加入150μL的DMSO,锡纸包裹，置于摇床上缓慢震荡15min，溶解生成的甲瓒。

(5)OD值的测量：设置酶标仪波长为490nm，检测吸光度，绘制表格。

结果见图3。所有化合物在浓度20μM下对RAW264.7未表现出细胞毒性。

抗炎机制研究：

1、相关溶液的配置

(1)10％过硫酸铵(AP)：精确称取0.1g过硫酸铵，移液枪加入1mL双蒸水完全溶解，锡纸避光置于4℃冰箱储存，配置好后尽快使用，最好不要配大量体积，按需配置，长期存储再用可能失效。

(2)TBST缓冲液：把一袋TBS粉溶解于2L双蒸水中，加入1mL吐温，搅拌至其完全溶解。

(3)牛奶(脱脂)封闭液：天平称取5g脱脂奶粉，加TBST定容100mL，得到浓度50mg/mL的配制液，保存于4℃冰箱。

2、Western Blot实验

利用Western Blot检测LPS刺激的RAW264.7细胞中一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶-2(COX-2)、NF-κB信号通路中P65、IκB的表达情况，从蛋白质水平上反应化合物的抗炎活性。

(1)细胞处理：将对数生长期细胞按照一定细胞数目(提取24h蛋白细胞接种数量为每小皿1.5×10⁶，即LPS刺激24h后提蛋白；提30min蛋白细胞接种数量为3×10⁶/皿，即LPS刺激半小时后提蛋白)把细胞接种到60mm的细胞培养皿中，每皿加培养基3mL，提取24h的蛋白。将皿放置培养箱过夜孵育。实验分为空白对照组，模型组，阳性对照组和实验组，隔夜后，空白对照组和模型组只换培养基，阳性对照组加培养基配置的含有工作浓度的Bay11-7082，实验组加化合物不同浓度(20、10、5μM)的培养基配制液。加药1h后加入LPS(工作浓度1μg/mL)刺激。

(2)提取细胞蛋白：吸去培养皿中的培养基，PBS清洗两遍后，向每个小皿中加入细胞裂解液(PIPA裂解液和PMSF需要现配现用并且吹打均匀)300μL置于冰上10min，缓慢摇晃小皿使裂解液均匀的覆盖满培养皿，破裂细胞得到蛋白。每皿吸取1.5mL到EP管中，离心30min(12000转/min)，吸取上清液，按BCA试剂盒上的操作经行即可。

(3)BCA蛋白定量：把标准品加到96孔板中，使得浓度0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL，每孔体积等量为20μL。加适当体积样品到96孔板的样品孔中。各孔加入200μLBCA工作液，37℃放置20-30min。用酶标仪测定A562，或540-595nm之间的其他波长的吸光度。绘制标准曲线，利用样品体积可以计算得到样品的蛋白浓度。计算出蛋白浓度后可用细胞裂解液将其稀释配平，加入SDS蛋白上样缓冲液(体积为提取液的1/4)，吹打均匀后沸水中煮10min，取出放置于-20℃冰箱保存。

(4)SDS-PAGE凝胶电泳：主要包括配胶、上样、电泳、转膜、查封、一、二级孵育、显影等步骤。

1)配胶：主要有分离胶和浓缩胶的配置，分离胶：向烧杯中依次加入Tris-HCl pH8.87.8mL，双蒸水9.6mL，30％Acr-Bis 12mL，10％SDS和AP各加300μL，最终加TEMED 30μL，稍微搅拌，移液枪将分离胶灌入组装好不漏液的玻璃板中，灌到指定标记线位置，加异丙醇，等待分离胶凝固，大约30min，分离胶凝固后倒掉异丙醇。浓缩胶：烧杯中分别按照顺序加入Tris-HCl Ph 6.81.5mL，双蒸水8.4mL，30％Acr-Bis 1.98mL，10％SDS和AP各加120μL，最终加TEMED 15μL，快速摇晃，分离胶受到冲击损坏，插好梳子等待15min凝固。

2)上样：装配好配好胶的玻璃板，从第二个胶孔开始上样，marker 3μL，后面上提好的样品。

3)电泳：上好样后，将电泳夹放入电泳槽，恒压80V下电泳半个小时，当marker分离即提高电压到120V电泳1h。(后续的电泳时间可根据目的蛋白的分子量来经行调整。)

4)转膜：将电泳完的板子拿出，小心分离胶和板，剪出蛋白相应大小的PVDF膜，标记完后放入甲醇溶液中激活1h，转膜夹和海绵浸入转膜液中处湿润状态，黑板在下，白板在上，从下往上依次是海绵垫，三层滤纸胶，PVDF膜，海绵垫，夹好转膜夹，对应好正负极，把转膜夹放入槽内，放好冰袋(转膜过程散热过多)，用新配的转膜液加满转膜槽，整个转膜槽放入有冰块的盆中。设置电流200mA转膜，具体时间依据目的蛋白进行调整(分子量加10min)。

5)封闭：转膜完成后，将膜取出置于事先配好的牛奶中摇床封闭2h，完成后以每次三分钟用TBST缓冲液缓慢在摇床上晃洗三次。

6)一抗孵育：事先按说明说上的方法说明稀释好一抗，将洗好的膜放入相应的抗体盒内于4℃冰箱内过夜，完成后接着用TBST缓冲液缓慢在摇床上晃洗三次.每次10min。

7)二抗孵育：膜浸入配好的二抗中于摇床上缓慢摇晃孵育2h后取出，用TBST缓冲液缓慢在摇床上晃洗三次，每次10min。

8)显影：等量混合显影液试剂A和显影液试剂B配成显影液，均匀涂在显影板上的膜上，在凝胶成像仪(Alliance Mini 4M，英国UVI-tec)上进行显影。用Image-J软件测量蛋白图灰度值，输入数据至Graph Pad Prism 5.0软件中，分析数据做出柱状图。

结果见图4。可以发现经过LPS刺激RAW264.7细胞之后，空白组中两种酶的表达水平明显提高，而实验组在加入不同浓度的化合物4i之后，两种酶的表达明显减低，而且存在明显的浓度依赖关系，因此表明化合物4i能够下调COX-2和iNOS的表达，从而达到抗炎的效果。

3、流式实验

通过流式细胞技术来检测化合物LPS刺激的细胞中活性氧(ROS)的变化情况，间接地来评价化合物的抗炎活性。

(1)细胞处理：观察细胞生长状况，计数对数生长期后以细胞密度为每孔1×10⁶接种于6孔板，设置空白对照组、模型组和实验组，模型组加入一定浓度的Bay11-7082，实验组加入事先准备好的浓度不同的化合物(2.5、5、10μM)配制液，静置1h后用LPS(1μg/mL)刺激，放于二氧化碳恒温培养箱中孵育6h。

(2)探针装配：用不含胎牛血清(FBS)的高糖培养基以1:1000的比例将DCFH-DA探针稀释好(工作浓度10μmol/L)，收集细胞将其以密度为1×10⁷/mL移入到配好的DCFH-DA探针中，用移液枪吹打均匀，转入培养箱中孵育20min，期间每5min需要取出上下摇晃确保细胞和探针充分的混合，最后为了除去非需要的其他物质，用不含FBS的培养基清洗细胞三次。

(3)检测：细胞收集于EP管中并检测结果(流式细胞仪)。

结果见图5。可以发现当细胞用LPS诱导之后，I-κB和P65磷酸化呈上升的趋势，表明LPS刺激后激活了NF-κB信号通路。当加入化合物4i之后，可以明显的看到I-κB和P65的磷酸化水平降低，柱状图同理，表明化合物4i可以通过阻断或者抑制NF-κB信号通路来达到抗炎效果。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。