CN115433739A

CN115433739A - 一种新型的广谱抗菌基因及其应用

Info

Publication number: CN115433739A
Application number: CN202110619633.0A
Authority: CN
Inventors: 何祖华; 陈复旦; 颜丙霄; 李群; 邓一文; 刘继云
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2021-06-03
Filing date: 2021-06-03
Publication date: 2022-12-06

Abstract

本发明提供了一种新型的广谱抗菌基因及其应用。所述基因命名为Xa46基因，其能增强禾本科植物的抗菌能力，可将其与一种或多种其它抗菌基因(如Xa21)联合应用，获得聚合体植物材料，从而进一步增加植物的抗菌谱。

Description

一种新型的广谱抗菌基因及其应用

技术领域

本发明属于植物学和分子生物学领域；更具体地，本发明涉及一种新型抗菌基因及其应用，所述基因对于白叶枯菌具有广谱的抗菌性能。

背景技术

随着世界人口快速增加，城镇化水平提高以及工业建设用地规模的扩大，使得可耕地面积与农业人口减少。如何利用有限的资源来尽可能地实现粮食高产，是本领域的焦点。减少作物的病虫害，促进作物良好、健康地生长，也是其中重要的一个方面。

禾谷类作物是重要的农作物，如何在有限的耕地上种出更多的作物一直是农业工作者的研究重心。尤其是禾本科植物水稻(Oryza sativa)，是世界上近一半人口的主食，但水稻的种植和生长除干旱和洪涝灾害等非生物胁迫以外，由革兰氏阴性菌稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)引起的白叶枯病是全球水稻种植危害最重的细菌性病害之一，严重影响水稻的产量，其中以中国、日本、印度等亚洲地区尤为严重。在中国，长江以南地区是白叶枯病害流行高发区，其余多个省份地区也均有发生。育种实践证明，研究和培育抗性水稻品种是最为经济、有效且环保的白叶枯病防治手段，而抗菌基因的发掘是抗菌育种成功的基础和关键。

目前，已有45个白叶枯抗性基因被鉴定报道并被国际注册确认，其中15个已被克隆，包括Xa1，Xa3/Xa26，Xa4，xa5，Xa7，Xa10，xa13，Xa21，Xa23，xa25，Xa27，xa41，Xa2/Xa31，Xa14和Xa45；其中Xa2/Xa31，Xa14和Xa45是最新被报道的Xa1的等位基因。已有的抗菌基因中，约66％为显性抗菌基因，隐性抗菌基因包括xa5，xa8，xa13，xa15，xa19，xa20，xa24，xa25，xa28，xa32，xa33，xa34，xa41，xa42，xa42等。以上的抗菌基因大约33％在11号染色体上分布，隐性基因有xa41，显性基因包括Xa3/Xa26，Xa4，Xa10，Xa21，Xa22，Xa23，Xa30，Xa32，Xa35，Xa36，Xa39，Xa40，Xa43。

以上阐述的抗性基因编码不同的蛋白类型，根据结构和功能的不同可分为以下几类：(1)编码NBS-LRR蛋受体的抗菌基因：Xa1是最早报道的NLR基因，特异性介导对日本RaceI小种(T7174)的抗性，受白叶枯菌侵染和损伤诱导表达，目前，Xa2/Xa31，Xa14，Xa45最近被报道为Xa1的同源基因，同样编码NLR蛋白；(2)编码MtN3/saliva家族蛋白抗菌基因，又称为SWEET蛋白，如xa13、xa25、xa41等，因启动子突变逃避了TAL effector的靶标而产生抗菌性；(3)受体激酶RLK型抗性基因：Xa21，Xa3/Xa26，Xa4等；(4)执行基因executor：Xa7、Xa10、Xa23和Xa27，是一类与TAL effector相关的R基因，因启动子区发生显性突变而使病原菌无法诱导其表达，从而产生抗菌性；(5)其它类型的基因：xa5。

尽管已经有一些白叶枯抗性基因被鉴定，然而鉴于白叶枯病的普遍性，本领域还有必要进一步研究开发新的抗性基因。

发明内容

本发明的目的在于提供一种广谱抗菌基因及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种增强禾本科植物的抗菌能力的方法，包括：在植物中引入Xa46基因、表达具有抗菌活性的Xa46蛋白。

在一个优选例中，所述在植物中引入Xa46基因包括：将Xa46基因或含有该基因的表达构建物(包括表达载体)体引入植物中；或对Xa46基因进行功能获得性突变、能表达具有抗菌活性的Xa46蛋白。

在另一优选例中，所述的表达构建体或载体中，包括Xa46基因的启动子，较佳地所述启动子为其ATG前500～3500bp(如1000、1500、2000、2500、3000bp等)，较佳地为其ATG前2953bp；在严格条件下能够与上述的多核苷酸序列杂交且具有启动目的基因表达的功能的多核苷酸；或，与上述所示的多核苷酸序列具有80％以上(优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上)相同性且具有启动目的基因表达的功能的多核苷酸。

在另一优选例中，所述植物还包含其它抗菌基因，其表达具有抗菌活性的抗菌蛋白；较佳地，所述包含其它抗菌基因的植物为：内源存在其它抗菌基因，外源引入有其它抗菌基因；其中，所述其它抗菌基因包括选自(但不限于)：Xa1～Xa45的抗菌基因；较佳地包括选自(但不限于)：Xa21，Xa1，Xa3/Xa26，Xa4，xa5，Xa7,Xa10，xa13，Xa23，xa25，Xa27，xa41，Xa2，Xa14，Xa31，Xa45，xa8，xa15，xa19，xa20等；更佳地所述其它抗菌基因为Xa21。

在另一优选例中，所述方法还包括：将引入有Xa46基因的植物与包含所述其它抗菌基因(表达活性抗菌蛋白)的植物进行杂交，获得能表达活性Xa46蛋白和活性的其它抗菌蛋白的子代植物(例如聚合植物材料Xa46/Xa21)。

在另一优选例中，所述方法还包括：将子代植物进一步杂交或自交，获得能表达活性活性Xa46蛋白和活性的其它抗菌蛋白的子代植物。

在本发明的另一方面，提供一种Xa46基因或其编码的蛋白用途，用于：增强禾本科植物的抗菌能力；或用于制备增强禾本科植物的抗菌能力的制剂。

在一个优选例中，所述的禾本科植物是引入有其它抗菌基因或其它抗菌基因被上调、表达具有抗菌活性的其它抗菌蛋白的植物；较佳地，含有所述其它抗菌基因的植物为：内源存在其它抗菌基因，外源引入有其它抗菌基因；其中，所述其它抗菌基因包括选自(但不限于)：Xa1～Xa45的抗菌基因；较佳地包括选自(但不限于)：Xa1～Xa45的抗菌基因；较佳地包括选自(但不限于)：Xa21，Xa1，Xa3/Xa26，Xa4，xa5，Xa7,Xa10，xa13，Xa23，xa25，Xa27，xa41，Xa2，Xa14，Xa31，Xa45，xa8，xa15，xa19，xa20等；更佳地为Xa21。

在另一优选例中，所述Xa46蛋白包括：(a)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；(c)氨基酸序列与(a)限定的氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳地95％以上；如98％以上或99％以上)相同性且具有(a)多肽功能的多肽；或(d)具有(a)多肽功能的SEQ ID NO:2的片段；较佳地包括其含有选自下组区域的片段：CC结构域，NBS结构域，LRR 3结构域，CC结构域截短仅保留NBS和LRR的N端截短，或截短LRR仅保留CC和NBS的C端截短片段。

在另一优选例中，所述植物包括下组或所述Xa46(包括其同源物)来自包括下组：水稻、小麦、黍、粟、玉米、高粱、小米、大麦、黑麦、燕麦、二穗短柄草。

在另一优选例中，所述的菌包括：稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)。

在另一优选例中，所述抗菌能力包括对白叶枯病菌的抗性。

在本发明的另一方面，提供一种植物Xa46基因或其编码的蛋白的用途，用于作为鉴定禾本科植物抗菌能力的分子标记。

在本发明的另一方面，提供一种鉴定禾本科植物性状的方法，所述方法包括：鉴定测试植物中Xa46基因或其编码的蛋白的序列，若所述Xa46基因编码具有抗菌活性的Xa46蛋白，未发生导致抗菌活性丧失的变异，则所述植物为具有抗菌能力的植物；较佳地，所述导致抗菌活性丧失的变异包括：基因移码或蛋白提前终止；更佳地，包括鉴定测试植物Xa46基因序列中相应于SEQ ID NO:1所示核苷酸序列第673位碱基是否发生缺失，若发生缺失、则所述植物为不具有抗菌能力的植物，若未缺失、且其他处序列无缺失则所述植物为具有抗菌能力的植物。

在一个优选例中，采用包括：测序法，PCR扩增法，限制性酶切分析法，探针法，杂交法，芯片法，等位基因多态性分析法等进行核酸序列的鉴定。

在本发明的另一方面，提供一种植物细胞、组织或器官，其中引入有外源的Xa46基因；较佳地，其中引入了含有Xa46基因的表达构建物(包括表达载体)。

在另一优选例中，所述的植物细胞、组织或器官中还包含其它抗菌基因，其表达具有抗菌活性的抗菌蛋白；较佳地，所述包含其它抗菌基因的植物细胞、组织或器官为：内源存在其它抗菌基因，外源引入有其它抗菌基因或其它抗菌基因被上调；其中，所述其它抗菌基因包括选自(但不限于)：Xa1～Xa45的抗菌基因；较佳地包括选自(但不限于)：Xa21，Xa1，Xa3/Xa26，Xa4，xa5，Xa7,Xa10，xa13，Xa23，xa25，Xa27，xa41，Xa2，Xa14，Xa31，Xa45，xa8，xa15，xa19，xa20等；更佳地为Xa21。

在一些方式中，所述的植物细胞、组织或器官不具有繁殖能力或不会再生为完整的植物体。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、SKZ抗水稻白叶枯菌J18；(A、C)NIP或SKZ植株感染不同种白叶枯菌株后的叶片表型；(B、D)NIP植物感染不同种白叶枯菌株后的叶片的菌斑长度统计。

图2、杂交F1代对J18菌株的抗菌表型性分析。

图3、Xa46的染色体定位；(A)3号染色体上的分子标记RM3199与感病表型有连锁，其中模板分别为1：SKZ，2：NIP，3：NIP×SKZ F1代，4：抗菌个体池，5：感病个体；(B)Xa46定位于3号染色体的120.4cM和122.8cM之间；(C)Xa46定位到约117kb的区域内。

图4、候选基因C1-C4敲除突变体接种J18的表型；(A)65kb定位区域筛选出4个候选基因Candicate Gene 1-4(简称C1-C4)；(B-C)C1敲除后的突变体材料菌斑长度明显要大于对照野生型SKZ，而C2-C4单基因敲除的突变体的接种表型与SKZ无明显差异。

图5、Xa46敲除突变对白叶枯菌J18的抗性降低；(A)突变体Xa46-KO-1、突变体Xa46-KO-2的突变示意图；(B-C)突变体植株在白叶枯病菌株J18接种两周后都表现出了明显的感病表型；(D)在接种菌株后的0、7、14天取菌斑叶片，统计叶片内的菌含量。

图6、Xa46回复NIP和TP309的感病表型；(A-B)互补后的植株NIP-Xa46能很好地抵抗J18的侵染；(C)接种J18的0、7和14天的叶片中菌含量；(D-E)在TP309背景下转入Xa46全长基因组序列，可互补感病材料TP309的表型；(F)接种J18的0、7和14天的叶片中菌含量；(G-I)Xa46的CDS互补NIP后同样提高了抗菌性。

图7、Xa46全长及其CDS赋予植株全生长期抗菌功能；(A-B)幼苗SKZ则表现出很强的抗菌性；(C)接种J18的0、3、6、9和12天的叶片中菌含量；(D-E)携带Xa46的NIP幼苗，接种2周后菌斑长度；(F)携带Xa46的NIP幼苗接种不同天数的菌含量。

图8A-B、Xa46在水稻的多个主要器官表达。

图9A-B、Xa46在NIP中的亚细胞定位。

图10、Xa46的表达不受病原菌和损伤诱导；(A)NIP的本底转录水平与SKZ的比较；(B)对SKZ材料分别接种无菌水、非亲和小种J18和亲和小种PXO99A，0、6、12、24、48和72h的荧光定量PCR数据。

图11、Xa46各个结构域的功能研究；(A)NIP中Xa46位点完整的CC domain(仅有2处氨基酸差异)；(B-C)Xa46的不同截短形式的抗菌功能。

图12、Xa46/Xa21聚合互补Xa21的抗谱；(A-B)Xa46(TP309-Xa46)对多种菌株的抗性；(C)TP309-Xa46和NIP-Xa46同样表现出对这类菌株很强的抗性；(D)针对大部分菌株，聚合后的抗菌性更强。

具体实施方式

本发明人通过大量的田间种植资源筛选，从一种具有特定抗菌性能的植物品种中获得一种新型抗菌基因，通过基因定位、敲除与互补等工作，本发明人明确了该基因对于白叶枯菌具有广谱的抗菌性能，并将其命名为Xa46。进一步地，还可通过转基因与杂交的手段，将Xa46与其它抗菌基因如Xa21基因聚合，聚合后植物材料的抗谱得到了进一步的扩展。Xa46的克隆与应用对植物抗性品种培育具有重要的意义。

术语

如本文所用，所述的“植物”包括表达Xa46多肽(蛋白)的植物或基因组存在Xa46基因或其同源物(同源基因)的植物。根据本领域的知识，表达Xa46多肽的植物，其内在存在如本发明所主张的作用机制，可以实现如本发明所主张的技术效果。本发明中也包括基因组含有Xa46基因或其同源物、但其不表达活性Xa46蛋白的植物，通过本发明的方法是指，所述植物可以实现抗菌性能的改善。本发明所述的植物可以是单子叶植物或双子叶植物。在一些优选方式中，所述的植物为作物，较佳地为禾谷类作物。在一些优选方式中，所述的“禾谷类作物”可以是禾本科植物；较佳地，所述的禾本科植物包括但不限于：水稻、小麦、黍、粟、玉米、高粱、小米、大麦、黑麦、燕麦、二穗短柄草等。优选地，所述的植物为水稻。

如本文所用，所述的“增强抗菌能力”或“抗菌能力增强”等，是指植物的对于相对更多种型(小种)的白叶枯菌具有抗性，也即，赋予植物更宽的抗菌谱。例如，赋予植物对于白叶枯菌J18、T3、Japan-4、KS-3-7、JS137-1、XZ40、GZ299、GZ10、PXO79、PXO145、PXO349、PXO61、PXO71、PXO347、PXO112、PXO99A、T1、T2、LN44、AH28、YC12、YC15、YC26、LYG50、KS-1-21、YN04-5、GX4、JNXO、Oct-78/78-10、YN1、YN11、YN7、YN18、PXO86、LN2、JL1、LN1、LN3等的广谱的抗性。

如本文所用，术语“上调”、“增大”、“提高”、“增加”、“促进”、“强化”等是相互可以交换的并且在应用含义上应当意指与本文中定义的“对照植物”或“对照基因”或“对照蛋白”等对照物相比较，至少有2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选的至少15％或20％、更优选25％、30％、50％、80％、100％或更显著的提高。

关于“对照植物”，选择合适的对照植物是实验设计的例行部分，可以包括对应的野生型植物或无目的基因的相应转基因植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同或属于同一类的品种。对照植物也可以是因分离而丢失转基因植物的个体。如本文所用的对照植物不仅指完整植物，也指植物部分，包括例如叶子。

如本发明所用，所述的高表达或高活性，是指与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的提高，如提高10％、20％、40％、60％、80％、90％或更高。

如本发明所用，所述的低表达或低活性，是指与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的降低，如降低10％、20％、40％、60％、80％、90％或更低。

如本文所用，所述的“改良性状”指改良植物的特性，本发明中，所述特性主要包括：抗菌活性。

如本文所用，“植物性状的改良”、“改良的性状”、“改良的植物性状”、“性状改良”等可以等同替代，是指与未改良前植物(如野生型植物)相比，经本发明的技术方案改造的植物的上段所述的性状或特性发生具有统计学意义的变化，该变化形成有益的农艺性状。

如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。

如本文所用，“外源(的)”或“异源(的)”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

Xa46及其抗菌特性

本发明中，所述Xa46编码一个NLR(nucleotide-binding leucine-rich repeat)受体蛋白Xa46，可以介导多个白叶枯小种的免疫。

如本发明所用，除非特别说明，所述的Xa46指具有SEQ ID NO:2序列的多肽或其编码基因，还包括具有与Xa46多肽相同功能的序列变异形式。所述的编码基因可以是gDNA或cDNA，也可以包含启动子。例如，所述的gDNA具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述的cDNA具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。所述编码基因的序列也包括与本发明所提供的序列相简并的序列。

所述Xa46多肽的变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-100个或1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。任何与所述的Xa46多肽同源性高(比如与SEQ ID NO:2所示的多肽序列的同源性为50％或更高、60％或更高、70％或更高；优选地同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有Xa46多肽相同功能的蛋白也包括在本发明内。来源于水稻以外其它物种的与SEQ ID NO:2所示序列的多肽序列的同源性较高、或在同样或相近的调控通路中发挥同样或相近作用的多肽也包括在本发明中。

本发明还提供了分离的多肽，其是Xa46多肽的片段或在两端添加其它蛋白或标签等形成的。所述的片段例如但不限于包括其含有选自下组区域的片段：CC结构域，NBS结构域，LRR 3结构域，CC结构域截短仅保留NBS和LRR的N端截短，或截短LRR仅保留CC和NBS的C端截短片段。结合本发明实施例的结果，本领域技术人员可以预期或制备获得合适的片段，这些片段及其应用均包含在本发明所涵盖的范围内。

本发明中，所述的“Xa46”也包括其同源物。应理解，虽然本发明中优选研究了获自特定物种水稻的Xa46，但是获自其它物种的与所述Xa46高度同源(如具有50％以上、60％以上，更特别如70％以上，80％以上，85％以上、90％以上、95％以上、甚至98％以上序列相同性)的其它多肽或基因也在本发明考虑的范围之内。来源于水稻以外其它物种的与SEQ IDNO:2所示序列的多肽序列的同源性较高、且在同样或相近的信号通路中发挥同样或相近作用的多肽也包括在本发明中。

本发明还涉及一种Xa46剪切形式，其相应于SEQ ID NO:2的氨基酸序列第227位之后发生提前终止，从而该Xa46剪切形式编码的多肽失去功能，使得植物的抗菌性能发生显著性变化。例如，该变体天然存在于日本晴中。

本发明中，还涉及到将Xa46与Xa21或其它抗菌基因联合应用的情形。因此，应理解，本发明也包括Xa21或其它抗菌基因、其变异形式或其片段。Xa21是第一个被克隆的水稻叶枯病抗菌基因。Xa21的表达虽然在各生长期变化不大，但其成株期的抗性强于幼苗期，且其表达水平不受病原菌和损伤的诱导。但Xa21也有一定局限性，韩国1号小种J18(DY89031)等多个北亚菌株能完全克服Xa21介导的抗菌性。而本发明的Xa46可与Xa21形成互补的抗菌谱，使得植物呈现更为优异的抗菌性能。

所述Xa21多肽的变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-100个或1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。任何与所述的Xa21多肽同源性高(比如同源性为50％或更高、60％或更高、70％或更高；优选地同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有Xa21多肽相同功能的蛋白也包括在本发明内。来源于水稻以外其它物种的与Xa21多肽序列的同源性较高、或在同样或相近的调控通路中发挥同样或相近作用的多肽也包括在本发明中。

编码所述Xa46多肽或Xa21或其它抗菌基因的多核苷酸(基因)可以是来自植物的天然基因，也可以是它们的简并的序列。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或多肽编码核酸经基因工程产生的宿主细胞。

本发明中，编码本发明的多肽的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。较佳地，所述表达载体还可选择性地加入抗性元件、筛选(选择)元件或报告基因元件，如Bar、GUS。

所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。

此外，本发明也包括植物细胞、组织或器官，其中引入有外源的Xa46基因或Xa46基因的表达被上调；较佳地，其中引入了含有Xa46基因的表达构建物(包括表达载体)。在更为优选的方式中，所述植物细胞、组织或器官中还包含其它抗菌基因，其表达具有抗菌活性的抗菌蛋白。所述其它抗菌基因包括选自(但不限于)：Xa1～Xa45的抗菌基因；较佳地包括选自(但不限于)：Xa21，Xa1，Xa3/Xa26，Xa4，xa5，Xa7,Xa10，xa13，Xa23，xa25，Xa27，xa41，Xa2，Xa14，Xa31，Xa45，xa8，xa15，xa19，xa20等；更佳地为Xa21。

Xa46在改良植物中的应用

白叶枯菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)引起的水稻白叶枯病害严重影响粮食作物水稻的产量，是一种非常严重的细菌性病害。并且白叶枯菌种型众多，防治困难。

在本发明的实施例中，本发明人通过大量的田间种植资源筛选，获得了一种材料SKZ(ShuangKeZao)，可以特异性对J18产生抗性。随后，基于图位克隆、基因敲除与互补的分子与遗传手段，本发明人在籼稻品种SKZ的3号染色体中定位并克隆到了一个对J18产生特异性抗性的Xa基因，命名为Xa46。Xa46可以介导多个白叶枯小种的免疫，尤其是北亚的菌株，且其抗菌性依赖于完整的蛋白结构。在J18的感病材料粳稻品种NIP或TP309中，Xa46的隐性等位基因xa46因碱基缺失影响蛋白功能而丧失抗性。Xa46敲除后直接影响SKZ对J18的抗性，同时，Xa46能很好互补感病水稻品种的抗性，并提供植株全生长期抗性。

基于本发明人的新发现，本发明提供了一种增强禾本科植物的抗菌能力的方法，所述方法包括：在植物中引入Xa46基因、表达具有抗菌活性的Xa46蛋白(不包括编码因提前终止而发生功能丧失的Xa46蛋白)。

本发明提供了一种使植物，特别是如因蛋白提前终止而不表达活性蛋白)的植物，表现为更为理想的抗菌性状。

应理解，在得知了所述Xa46的功能后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的Xa46的表达或活性。比如可以采用本领域人员熟知的多种方法来过表达Xa46。更具体地例如包括：将Xa46的编码基因或含有所述编码基因的表达构建物或载体转入植物中。

在本发明的实施例中，为扩大抗谱，本发明人构建了聚合Xa46和Xa21的杂交水稻材料。Xa21编码一个激酶受体蛋白，可以通过PAMPs分子激发的免疫方式对菲律宾6号小种PXO99A等多个白叶枯小种产生抗性，但Xa21介导的抗性也可以被其它菌株所克服，比如I型分泌系统缺陷的J18，J18是分离自韩国的、致病性较强的白叶枯小种，此外，也能被中国北方地区分离的菌株LN1、LN3、JL1等，韩国生理1号、3号的代表菌株克服。而本发明的接种试验表明，Xa46和Xa21基因聚合后对97.8％的检测菌株表现出很强的抗性。Xa46与Xa21的聚合实质上发挥了PTI与ETI(ETS激发的免疫方式)协调的广谱抗性，在水稻育种中显示出良好的潜力。应理解，尽管没有具体举例，但本发明的Xa46可与其它的一个或多个抗菌基因进行联合应用，以有利于进一步增加植物的抗菌谱。

因此，本发明还提供了一种联合应用Xa46和Xa21或其它抗菌基因的联合抗菌方案。对于内源表达活性Xa21或其它抗菌基因、但不表达活性Xa46的植物，可以在其中引入Xa46；而对于内源表达活性Xa46、但不表达活性Xa21或其它抗菌基因的植物，可以在其中引入Xa21或其它抗菌基因，从而使得植物具有更宽的抗菌谱。

综上，本发明揭示了全新的编码NLR受体的白叶枯抗性基因Xa46，此外，Xa46/Xa21的聚合为ETI与PTI信号途径协调重构对白叶枯病菌的广谱抗性应用于生产实践提供了理论与实验证据。

本发明中，在获得抗菌性状被增强的植物后，还可包括将引入有Xa46基因的植物与包含Xa21基因或其它抗菌基因(表达活性Xa21蛋白或其它抗菌蛋白)的植物进行杂交，获得能表达活性Xa21蛋白或其它抗菌蛋白以及活性Xa46蛋白的子代植物(如聚合植物材料Xa46/Xa21)；较佳地，所述方法还包括：将子代植物进一步杂交或自交，获得能表达活性Xa21蛋白或其它抗菌蛋白以及活性Xa46蛋白的子代植物。

植物定向筛选或靶向性筛选

在得知了Xa46的功能以后，可以以其为分子标记物，来进行植物的定向筛选。也可基于该新发现来筛选通过调节这一机制，从而定向调控植物抗菌性状的物质或潜在物质。

因此，本发明提供了一种定向选择或鉴定植物的方法，所述方法包括：鉴定测试植物中Xa46基因或其编码的蛋白的序列，若所述Xa46基因编码具有抗菌活性的Xa46蛋白，未发生导致抗菌活性丧失的变异，则所述植物为具有抗菌能力的植物；较佳地，所述导致抗菌活性丧失的变异包括：基因移码或蛋白提前终止；更佳地，包括鉴定测试植物Xa46基因序列中相应于SEQ ID NO:1所示核苷酸序列第673位碱基是否发生缺失，若发生缺失、则所述植物为不具有抗菌能力的植物，若未缺失、则所述植物为具有抗菌能力的植物。

例如，在本发明的具体实施例中，通过序列分析发现，水稻品种日本晴中，Xa46在673位点缺失1bp的碱基导致氨基酸发生移码，蛋白序列在第227位提前终止。据此，可以判断该日本晴品种不具有对于J18等白叶枯菌的抗菌性。应理解，在其它品种的植物中，也可能发生Xa46或其同源基因位于其它位置的变异，可根据如本发明实施例的实验对发生此类变异的Xa46或其同源基因进行活性分析，若保留Xa46活性，则表明相应植物具有对于J18等白叶枯菌的抗菌性；但若丧失Xa46活性，则表明相应植物不具有对于J18等白叶枯菌的抗菌性(其他未明确的抗菌基因存在的情况除外)。这种Xa46蛋白活性判断方式，是在本发明现有技术内容的指导或示例下可以实现的。

本发明提供了一种筛选调控Xa46进而增强植物抗菌性的物质(潜在物质)的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达Xa46的体系中；(2)检测所述体系，观测其中活性Xa46的表达或活性，若所述候选物质上调(显著上调)Xa46基因或其编码的蛋白，则表明该候选物质是对于增强植物抗菌性有用的调节物质。

以蛋白或基因或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。

经过大规模的筛选，可以获得一类特异性作用于Xa46或其所参与的信号通路，对植物抗菌性状有调控作用的潜在物质。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料与方法

水稻材料

水稻品种双科早(SKZ)参见王建军，朱旭东，王林友等，水稻类病斑突变体的生理与遗传分析；植物生理与分子生物学学报，2004，30(3)：331-338。

白叶枯菌的活化培养、接种方式及生长曲线方法

取-80℃保存的白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)菌种，在PSA固体培养基划线活化，28℃倒置培养72h。待长出单克隆菌落后，挑取单克隆至PSA液体培养基小摇2天。吸取100μl PSA培养液培养的菌液至PSA固体培养基，用灭菌后的涂布棒均匀涂布，倒置28℃培养72h，长出的白叶枯病菌可用于水稻接种。接种方法如下：大田接种——剪叶法：用无菌水将PSA培养基上长好的白叶枯菌刮洗下来，并稀释至OD值为1.0。用剪刀沾取稀释好的菌液，水稻叶片(生长60d左右)的叶尖2cm处，斜向下剪。接种14天左右，量取叶片菌斑的长度。幼苗接种——剪叶法：用无菌水将PSA培养基上长好的白叶枯菌刮洗下来，并稀释至OD值为0.6，用剪刀沾取稀释好的菌液，水稻叶片(生长25-30d左右)的叶尖，1cm处，斜向下剪。接种14天左右，量取叶片菌斑的长度。白叶枯菌的生长曲线按以下步骤开展：取接病不同天数的水稻叶片，长度包含发病菌斑，叶片表层用75％乙醇浸泡10-15s，然后立即在无菌水中清洗叶片表面的75％乙醇，轻轻抖去无菌水，用灭菌的剪刀剪碎叶片置入酒精烧过的研钵中，并加入少量灭菌的石英砂(幼苗可适量少加)，加1-2ml灭菌水后充分研磨至无明显的叶片组织，研磨好后，继续加无菌水至10ml，一起转移至10ml的无菌管子中，振荡混匀，充分释放菌体。按照所需不同的浓度稀释菌液，涂含有15mg/L头孢氨苄的PSA固体培养基上，待生长2-3天后，统计长出的白叶枯菌克隆数目，推算每张叶片的菌生长量，根据接种后不同天数的白叶枯菌的生长量绘制白叶枯菌在水稻上的生长曲线。

质粒的提取

常规方法进行质粒的提取。

水稻成熟胚愈伤组织诱导、转化、筛选和分化

水稻成熟胚愈伤组织的诱导：称取一定量所需品种的水稻种子，用剥壳机去壳，在白纸上将有明显感染的去壳种子和明显断裂不含胚的种子剔除。用75％乙醇浸泡摇晃30-45s，去除乙醇，用灭菌水冲洗种子并去除残留的乙醇；然后配制30％(v/v)NaClO3用其浸泡种子，置于200rpm摇床晃动30min。取出后去除NaClO₃，用无菌水漂洗5-6次至无明显黄色。将种子置于灭菌滤纸上，晾干或用滤纸吸干表面的水分。最后，将种子播于无抗生素的NBD培养基中诱导愈伤。26℃培养10天后，剔去胚乳、胚芽和胚根等，获取的愈伤组织可用于转基因或放于无抗的NBD培养基上继代培养，每2周继代一次。

农杆菌转化菌液准备：-80℃保存的转化好的含有目的基因的农杆菌菌种在冰上静置融化，在平板上划线活化，2d后挑取合适大小的单克隆置于5ml相应抗生素的YEP/LB液体培养基中再次活化，28℃，200rpm，振荡培养过夜。吸取1.5ml过夜培养的菌液，转入15mlAB(50mg/L Kan+20mg/L Rif+100mg/L AS)液体培养基中，28℃，200rpm，摇床培养至OD600＝0.5左右(约4h)。

水稻愈伤与农杆菌共培养：集菌，目测或分光光度计测OD600值在0.5左右，5000rpm，10min，离心，收集菌体；用含100mg/L AS的AAM悬浮菌体沉淀至菌液OD600＝0.5左右；挑去长势合适状态好的水稻愈伤，将以上菌液与水稻愈伤混合，28℃浸泡并摇晃20min；随后，用5ml枪吸掉AAM，滤纸吸干愈伤菌液(按照滤纸-愈伤-滤纸)顺序的方法，将愈伤组织在无抗生素NBD培养基上隔无菌滤纸在26℃共培养3天。每一皿可添加1ml含100mg/L AS的AAM培养液充分湿润无菌滤纸。

愈伤的筛选：用无菌滤纸吸取共培养到期的愈伤表面的农杆菌，充分吸干，转移至含相应筛选抗生素(如潮霉素等)的筛选培养基上筛选含抗性的愈伤。26℃，筛选培养2-3轮，根据愈伤状态而异。每一轮约2周，每一轮培养基需更换不同抗生素浓度。筛选抗生素以Hyg为例，每一轮筛选培养基抗生素添加如下：第一轮筛选：NBD+100mg/L Timentin+30mg/LHyg；第二轮筛选：NBD+100mg/L Timentin+40mg/L Hyg；第三轮筛选：NBD+100mg/LTimentin+50mg/L Hyg。愈伤的分化：将经过几次筛选且状态较好的的水稻愈伤组织转移至水稻分化培养基，光照培养。约2周左右更换一次培养基(2-3轮)，抗生素可适量少加，直至分化出一定大小的小苗。分化苗的生根：将分化培养基上的小苗取出，根部尽可能去除培养基，转至生根培养基上发根。待幼苗长出根，约3周左右后取出，尽可能洗去琼脂培养基，光照条件下，在水中培养一周后经叶片DNA提取pcr鉴定后，即可移栽到土里。

水稻基因组DNA小量提取

利用常规的TPS叶片简易提取法进行水稻基因组DNA小量提取。

总RNA的提取

采用常规的TRIzol法提取总RNA。

mRNA的反转录与实时荧光定量Real-time PCR(RT-PCR)

采用Invitrogen试剂盒进行将上述RNA反转录成cDNA反转录。通过Bio-Rad型号荧光定量PCR仪，计算表达量。

植物蛋白的提取及检测

常规方法进行植物总蛋白的提取，之后进行Western-Blot蛋白印迹检测。

水稻原生质体瞬时转化系统

(1)水稻种子脱壳，去除明显有黑点暗点的种子，经75％乙醇消毒，30％NaClO处理30min，完全洗去残留的30％NaClO，晾干，播种于不含抗生素的1/2MS，25℃生长10-14d。

(2)将生长至一定高度的水稻幼苗取出，大约60-80株(根据实验需求选择)小心剪去根和叶部位，保留其叶鞘组织，冰上凉置。

(3)用单面刀片将叶鞘组织切成小于0.5mm的小段，加入30ml新鲜配制的TVL原生质体缓冲液，放置10min。

TVL缓冲液配方如下：

(4)配制以下酶解液，加入等体积的酶解液30ml至浸没在TVL中的叶鞘碎段组织中。

(5)将盛有叶鞘组织的锥形瓶用锡箔纸包住，抽真空，避光酶解4-5h。

(6)酶解后的以下步骤，避光进行；经酶解的原生质体用40μm滤网过滤，转移到50ml离心管中。

(7)加入等体积的W5溶液，轻轻颠倒混匀。

(8)4℃静置过夜，使之分层；第二天将中间层小心吸出后转移至新离心管。

(9)加入与中间层等体积的W5溶液，并缓慢颠倒混匀。配制W5溶液：

(10)100g，离心5min；小心去除上清，加入约10ml W5溶液，重悬。60g，离心5min。

(11)小心去除上清，加5ml W5溶液重悬，避光，置于冰上，自然沉降约30min。

(12)60g，离心5min，尽量取出W5溶液，提前配制MMG和PEG-Ca²⁺溶液。

(13)根据实验要求，加入一定量新鲜配制的MMG溶液，轻轻重悬，镜检观察细胞完整度和浓度。

(14)根据需求加入质粒至2ml离心管，随后加入约100μl原生质体，混匀。加入110μl PEG-Ca²⁺转化液，轻轻缓慢混匀，平放静置，转化约15-20min。

(15)轻轻加入400μl W5溶液，小心颠倒混匀，终止转化反应。100g，离心2min。

(16)小心去除上清，加入1ml W5溶液，重悬。25-28℃暗培养过夜。

(17)根据镜检细胞浓度决定是否需要重新离心加W5溶液提高浓度，进行激光共聚焦荧光观察或者浓缩体积用于蛋白提取。

Xa46序列：

CDS序列(SEQ ID NO:1)：

atggcggcggcgctggaagcattcgcggccaagctggcgaacgtcctggtggggatggcgaaggaggaggtggagacgctcctgggcgtgcccggcgcgatcgccaagctcgagacgacgctcggcgacctgagcagcatcctggccgacgccgaccggaggcgcatccacgacccgggcgtggagcggtgggtgagggagctcaaggacgccatgtacgacgccgacgacatccttgacctcttccgcgccatggagggcggagaagaccccggctcgccgccaagagctgctccggcgccgtcggcgtgctggagcgccctctgccgccgcagccctgccgctacgcgcaagatcgggaggaagatccaggagctcaaccggagggtggaggagatcgcgaagaggagctcccgctttggatttgtctcccaagtaatccactcctcctcggcccttcgtctaaccgatagacccatgtgttcttgctcgtcagaaagcagccgcaacagcaagacgggaccatccatcattcgatccgatgttgtcggcgacaagatagatcttcacacaaggaacctcgttgatctgctgattggcaacaagctggcggatggtcgcacgcgcgcaagatcgtcaggcgatgtcatcgccgtcgcgatcaccggcgctggggggataggcaagaccacgcttgccaggatggtcttcaacgacgccgtgttggagagccacttcgacaagaaggtatggctgagcgtgaatcaggaggtcaacgaggttcacctcctgcacggcgtgatcgccgcgtttgggggaagctaccatggctgcgccggggacaaggccctgctcgaggacacgttgaagcatgccgtgaggcagaagaggttcctgctggtgatggatgacgtgtggagcgatagggtgtggagcgatctgctccgagcaccgctcggtgcttgtgctcctggaagccgagtgttggtgacgacgaggaacgacggagttgctcgtgggatgagagcccagcacctccaccgggttgagaagctggatctaggtgattcttggtcactgctaaagaagcaggtagttctgaacgagggcgatgaatctgagattgatggactagaggacatcggattgaagatcgtagaaagatgtgatggcttgccacttgcgattaaggttgtgggtggactcttactgaacaagggcaaaacgagagatgcttgggtgaacgtctctaatcactttgcatggtcaatgacaagaagcaatgacgacatcaacaaagcggtctatctgagctacgaagagctgcctccgcatttgaaacagtgcttcgtgttctgctcacttttccctaaagatgaactgatcataagaggagtaatagtcaggatgtggattgcacaaggttacggacatgacataatgagatcgacgctacctgaagatttgggagttgaatattacaatgagttggtgtcacggaatcttctagagccatacaaacgatcctatgatctatcagcaagcacaatgcatgatgttattcgctcctttgctcaacagatagttaaagatgaaggactacttgtcaatgacagacaagatgtgcatggtattgcaggtgcttcaaagctgcgtcacttgtctgtatccaaaactgcaatagagcgggtcgctatacaaaagcaagtgtcattgaggacattgttgctctttgggagatgtataactgagttgacgtatttcaggaacaatatctcttgcctaagagtactacatttacaaggtgtagatcttgttgacctgccggactatatatgccatctcaagcatctaagatacttggggcttgcaaatacaggcatatctgcaatccctcgaggcataggaaatctaaaatttctacagttcattgaccttatggggtgtcggaattttcatcagcttcctgacagcatcttgaagctacagaatatgaggtttctcgacttcaggggcacgaggttaacctcaattcctccaggtatgggaaagctagaaaacttggtgaacatgttggggttcccaacttatttggatgacaggggacatgcctggagcagcttggaagaactacggtctttgtcgaacctaaaatggcttgatttaagaggtctagagcttgcatcttcaggctctatggctgctacagcaatgctcaacagtaaaaagcacttgaaaatcttagacttgacatttgccagtaggctcaccgacaacgggatgatcgaaggaaccagcaatgtcatcgaggagcaggaacgagccgaggatgtgttgagtaatctctgtcctccgccttgcgtagaatgtcttacggtcaatggttactttggatatcgactaccccgatggatgagaacaatgtcggactttccaagcttaaggcgtttggagctgaaggactacgtatgctgcaagcagctgcctgtcggcttgggccagctcccttttcttgattatatttggattgatcatgctccatccatcgtgagcattggccatgatctcctcttcctctcctcctctagtgctgatgaccagaaagtcacaactggaacaaggatcactaggaagctgcagctccatggtctttctcgcggtgatgctggtgttgcatttccgaagctagaaacactgggtttaaaggggatgttgggatggagagtgtggaactgggatcagcaaacaccagggatgcccgccttagacgttgttaccatcaccggttgtaaactacgttatcttccgcttggacttgtacaccatgcaaccgcactaagggtgctgaatctcagaaatgcgccgcacctgatctccgtagagaacttcccgtcacttgtggagctcacgtcagctgacaacccgaagctgcagaggatctccaacagtccaagactgcgacatatcgtcgttatcagatgcccagggctgaaggtagtgaaggatttgcaatcacttaggagcgtcatttggaaggatttggatgctgatgccctcccagagtacctacgagagacagagctaaataagctggacgtgtactgcagtctaagattgcttaaactcatatccttgcaagatggcagctatgagtgggaaaagatccagcacgtccagctactgaaggcatatgggaagagatcaacggaggataaggttgaccggcacatcttctacactaaggatccgtactcgtttgaagcagatatgggcgaagatctatga

蛋白序列(SEQ ID NO:2)：

MAAALEAFAAKLANVLVGMAKEEVETLLGVPGAIAKLETTLGDLSSILADADRRRIHDPGVERWVRELKDAMYDADDILDLFRAMEGGEDPGSPPRAAPAPSACWSALCRRSPAATRKIGRKIQELNRRVEEIAKRSSRFGFVSQVIHSSSALRLTDRPMCSCSSESSRNSKTGPSIIRSDVVGDKIDLHTRNLVDLLIGNKLADGRTRARSSGDVIAVAITGAGGIGKTTLARMVFNDAVLESHFDKKVWLSVNQEVNEVHLLHGVIAAFGGSYHGCAGDKALLEDTLKHAVRQKRFLLVMDDVWSDRVWSDLLRAPLGACAPGSRVLVTTRNDGVARGMRAQHLHRVEKLDLGDSWSLLKKQVVLNEGDESEIDGLEDIGLKIVERCDGLPLAIKVVGGLLLNKGKTRDAWVNVSNHFAWSMTRSNDDINKAVYLSYEELPPHLKQCFVFCSLFPKDELIIRGVIVRMWIAQGYGHDIMRSTLPEDLGVEYYNELVSRNLLEPYKRSYDLSASTMHDVIRSFAQQIVKDEGLLVNDRQDVHGIAGASKLRHLSVSKTAIERVAIQKQVSLRTLLLFGRCITELTYFRNNISCLRVLHLQGVDLVDLPDYICHLKHLRYLGLANTGISAIPRGIGNLKFLQFIDLMGCRNFHQLPDSILKLQNMRFLDFRGTRLTSIPPGMGKLENLVNMLGFPTYLDDRGHAWSSLEELRSLSNLKWLDLRGLELASSGSMAATAMLNSKKHLKILDLTFASRLTDNGMIEGTSNVIEEQERAEDVLSNLCPPPCVECLTVNGYFGYRLPRWMRTMSDFPSLRRLELKDYVCCKQLPVGLGQLPFLDYIWIDHAPSIVSIGHDLLFLSSSSADDQKVTTGTRITRKLQLHGLSRGDAGVAFPKLETLGLKGMLGWRVWNWDQQTPGMPALDVVTITGCKLRYLPLGLVHHATALRVLNLRNAPHLISVENFPSLVELTSADNPKLQRISNSPRLRHIVVIRCPGLKVVKDLQSLRSVIWKDLDADALPEYLRETELNKLDVYCSLRLLKLISLQDGSYEWEKIQHVQLLKAYGKRSTEDKVDRHIFYTKDPYSFEADMGEDL.

基因组序列(SEQ ID NO:3)：

atggcggcggcgctggaagcattcgcggccaagctggcgaacgtcctggtggggatggcgaaggaggaggtggagacgctcctgggcgtgcccggcgcgatcgccaagctcgagacgacgctcggcgacctgagcagcatcctggccgacgccgaccggaggcgcatccacgacccgggcgtggagcggtgggtgagggagctcaaggacgccatgtacgacgccgacgacatccttgacctcttccgcgccatggagggcggagaagaccccggctcgccgccaagagctgctccggcgccgtcggcgtgctggagcgccctctgccgccgcagccctgccgctacgcgcaagatcgggaggaagatccaggagctcaaccggagggtggaggagatcgcgaagaggagctcccgctttggatttgtctcccaagtaatccactcctcctcggcccttcgtctaaccgatagacccatgtgttcttgctcgtcagaaagcagccgcaacagcaagacgggaccatccatcattcgatccgatgttgtcggcgacaagatagatcttcacacaaggaacctcgttgatctgctgattggcaacaagctggcggatggtcgcacgcgcgcaagatcgtcaggcgatgtcatcgccgtcgcgatcaccggcgctggggggataggcaagaccacgcttgccaggatggtcttcaacgacgccgtgttggagagccacttcgacaagaaggtatggctgagcgtgaatcaggaggtcaacgaggttcacctcctgcacggcgtgatcgccgcgtttgggggaagctaccatggctgcgccggggacaaggccctgctcgaggacacgttgaagcatgccgtgaggcagaagaggttcctgctggtgatggatgacgtgtggagcgatagggtgtggagcgatctgctccgagcaccgctcggtgcttgtgctcctggaagccgagtgttggtgacgacgaggaacgacggagttgctcgtgggatgagagcccagcacctccaccgggttgagaagctggatctaggtgattcttggtcactgctaaagaagcaggtaagactatcacatagtatctatctatctattttctatctatctatctattatctatctatctattatctattattaagacagctcgaaaagaaggcaccacgttcgctgtggaggctagaaatttccacattaatcggagaaaaagaaaaaaaagaaaaagagagtccaactagaaatacaatctaaaaaagagctgaaattcgaaattaaaaataagcaatattgacagaaatttctatataagaacccaatacgagattaattaaaattcgaaataaaaataaaataaaattcaaaattagaaaaagaaaaggtgagtccatgtaggaatacaatctaaaaaaagctgaaattcggaattaaaaataagcaatattgaaagaatttttcatataagaacccaattcgaaattaatcaaaattcgaaataaaaataaaataaaatctaaaattagaaaagaaaaggagaatccaagtaggaatacaatttaaaaacagctgaaattcgaaattaaaaataaggaatattaaaagaagaatccaaataagaatccaatacgagattaattaaatttcggaataaaaataaaaataaatccaaaattagcaaaagaaaataaaagaagagttcaagtaggaatacaatttaaaattagctggaattaggaattgaaaataagcaatattaaaagaagaatccatataagaacccaatacgagattaattaaaatttagaataaaaaataaaataataaccaaaattagaaaaattaaaagagagttcaagtaggaatacaattataaaacaactaaaattgaaaataaaaaaataaaaacattaaaagaacacaatacagtattaactaattttttatgaaataaattctggaattagaaaaagaaaaataaaatttcaattaggaatacaatttttaaataactaaaatttgtgataaaaataaagactattaaaataaaagaccatctaaaacacatgacgaaataaattaagtaacatgcctataaagaagtagagtggtggcggttgatacgacatataaaaattgttaataaaacatcaaataaaatcctaatgacgattaaaaggagggacgtcaggcagaccgtgaagcagacaagtaaggtggtggccaggacttctagaaagtaaaaaaaaacattgataatcatttcgatttttaaaatctcaatgacaataaaaaggagaagcagcgggcggggtgtataagagtatagttgcagagccgccgacggttgatgggacttctagaaaataaaaaatgaattccaatgatagttatgttcaatttttagaatcacaatgacaataaagagtatgcggtggacgggctgtaaaggggcatagtggcctcgtttgatgggacttctaaaaattataaaaaataaaacaacaagttcattttttaaaggttcggaatttctaaaaagtaaaaaaaaaaacaatgataatcaggttcgattttaaaatctcaatgacaacaaagaaaggagatagcggacgagccatagaggagtacaatggcaaagctactgacggtttggcgggacttctaaaaagtaaaaatgaacccaaacgataattatgttcaatttttaaaatctcaatgacaataaagagaagagacagtggacgggccgtacaggagtgtaatggcaacgtttgacgggacatctagaaattataaaaatgaaacttaacgtgacaataaactctaaaaactacaaaatccaatttttaaaggttccaagaagaatggatagaaatagtggtagatcgagcaagcaaataaagaaagagatggcataagaggtagcaactggtgtgacttttcaaaactatataattagaaacacgatgatgataagttttggtctttcaaagtcttaatacaatgagatagctattaaataaattttaagtaaaatcatacttaaaaaatatatgattttgtttgggtgctagccgggcaattgcgcgggctacccagctagttaattactaattagtactgagatgcacattactaattactctctccatctaattttgatagtcatattttattttggcatactgaccaaggataagtaattctacttatcatccatttaaacatgttatttctcgttaacaagcgattaattaatatttacatttctcgatgcccatgcagccaatcttgtgtggaagaatggagagtcacgcattaaatctgagaaaatcattaagatgataggttgttggattgaaatatgcctattaaaaataaatttttcggatttggaaatatgcctatcaaaactagatggagggagtactaattattactccctccatcccataatataagggattttgagtttttccttgcaacgtttgaccactcatcttattcaattttttttgaaattattaattattttatttgtgacttaatttattatctatagtactttaagcataacttttcgttttttatatttgaaaaaaaatttgaataagacgagtagtcaaatgttacaagcaaaaactgaaaatcccttatattgtgggatggagggagtattagtactgggaataattgaatatagaatagaaatgtgcatctctgtactactccgtcccaaaatataagaacaccgaataggacaatttctaggattacgaatctagatatttcctagtactatgaatctggacatatagcctgtctagattcgtagtactaggaaatgtcctatccggtgttcttattgggacggaggaagtactaattagtgagatgcacattactattctatattcaattaagagagaatccactcagtgccactgagtttatcacacctctacaatttaccatcgactttgtcaagttccacaatataccattctgctttcttcaacctctactctctgccatcaccgtgcactagctgtcagttaacctctagttaacctctgttagcgctttgaaaagacctatttgcccctaactcattccacaaggtaattagttgtattttatgcaacctcaggacacacataataaaggtatgtaaaccatcaaacggtttcagccaactagatagggaaaaaaaatcacacattttgcttattttagctatccaatcaaaaaattttcaacatgatggatgacactaagctcctatagatataggagtgaagaccaaaatatttcagtatattagccaactccatacagtttagtaccataatatgaagagatatttcattacattagccaactagaaagtcaacacacgttcatatagttcacacattagccaactccatgcagttcagccatacatgttgaggcatacagtttagaatcacagtgaatacgcgcgtccggttgctgccgcattggggacggaagtgccagtacaacggcggtggagatgctgcaggcggacggttctggtgccgctgctgacggcgacgatggggactgctgcgctagggacagcgacgccaggaggccgtttgtggtggaggcgcggtaggcagaagcttgtcgcagcgccggtgacgacaccaccaagacatcgatgattgggacggtgggcgcatgatgggaggattgcggcggcgctgaggatggaagtgccaggacaccagcagcggaggcgtgctgggcggatggttgctgcggcactgctgtcggcaacgatggggatggctgcgctggggacggtggcgcctggaggccgccggcattggaggcgcggcaagcggacgcttgcagcggtgctggggacggcgccaccaggatgtccgcgattagggtggtgggggcgtggggggttgcggcaacgccaagccgtcgccagtgga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实施例1、水稻品种SKZ抗水稻白叶枯菌J18

水稻Xa21材料106(TP309背景，转入了Xa21基因)，本发明人检测其对于不同种白叶枯菌株的抗性。

结果显示，Xa21可以克服多个白叶枯菌株，包括毒性较强的菲律宾6号菌株PXO99A，日本1号生理小种MAFF311018和韩国小种KACC10331等。但是，Xa21无法克服J18导致的感病，表现为感病性状(图1A，B)。

通过大规模的水稻种质库田间接种筛选，本发明人发现一种籼稻品种SKZ，其特异性对J18表现为抗菌性(图1C，D)。

实施例2、Xa46抗菌表型遗传分析

通过籼籼稻杂交与籼粳稻杂交，本发明人获得了SKZ分别与籼稻品种9311、粳稻品种NIP的杂交F1，自交得到F2后代。两个杂交的F1代均对J18表现为抗菌(图2)，表明SKZ对J18的抗菌性为显性遗传。

SKZ与NIP、9311的杂交F1代自交得到的F2代接种J18后，抗菌植株和感病植株的分离比接近3:1(表1)，说明SKZ对J18的抗菌性可能由一个显性的单基因控制。

表1、SKZ对J18抗菌性的遗传分析

实施例3、Xa46的定位

从NIP与SKZ杂交的F1代自交得到F2代群体，用剪叶法接种白叶枯病菌小种J18，在接病后10天到12天之间根据发病情况挑选感病的个体426株，并在接种两周之后挑选少量抗菌个体，用于定位。在本发明人的已有及新合成的SSR分子标记中筛选出78对在两个亲本之间有差异的标记，并利用这78对分子标记扫描感病个体池(20个感病个体)和抗菌个体池(20个抗菌个体)，发现3号染色体上的分子标记RM3199与感病表型有连锁(图3A)。

随后，本发明人利用SSR和根据籼粳稻基因组序列差异设计的INDEL分子标记Xa46定位于3号染色体的120.4cM和122.8cM之间(图3B)。

根据已公布的NIP和9311基因组序列，进一步设计并筛选INDEL分子标记，发现在分子标记INDEL33和INDEL31处分别有1个和3个交换个体，将Xa46定位到约117kb的区域内(图3C)。该区域，已知的NIP和9311的基因组序列差异少，无法继续设计分子标记。由于SKZ和9311的基因组序列不完全相同，本发明人以SKZ基因组作为模板，对定位区域内注释的候选基因进行PCR扩增测序时，发现SKZ与NIP的基因组序列存在差异，根据这些差异，设计了新的CAPS分子标记，并将定位群体扩大到676个个体后，将定位区域缩小到约65kb的范围(图3C)。

实施例4、候选基因C1(Xa46)抗菌功能

通过BAC文库构建和测序，本发明人在65kb定位区域筛选出4个候选基因Candicate Gene 1-4(简称C1-C4)，分别编码NLR蛋白，NLR蛋白，质膜ATP酶，组氨酸磷酸酶。本发明人比较了NIP与SKZ在该区段的序列差异，该区段内SKZ序列相较NIP存在较多的插入和缺失，在SKZ候选基因C1的内含子中存在1.5kb左右的插入，C2的外显子序列中有一个5kb左右的反转录转座子插入，C3和C4相较NIP存在一些单碱基突变SNP(图4A)。

利用Crispr-Cas9敲除系统，本发明人逐一对四个候选基因进行了敲除，获得4个单基因敲除的纯合突变体材料。随后用白叶枯小种J18进行田间接种，测试以上突变体。统计发现，C1敲除后的突变体材料菌斑长度明显要大于对照野生型SKZ，而C2-C4单基因敲除的突变体的接种表型与SKZ无明显差异(图4B，C)，因此，本发明人初步认为C1是目的基因，暂命名为Xa46(t)。其CDS的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示，其基因组序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明人获取的不同类型的Xa46敲除基因型都有相似的接种表型，下面以其中的两种敲除类型做分析说明。突变体Xa46-KO-1在外显子上多出1个碱基(+1bp)bp(碱基T，位于其全长序列的第21～22bp位之间)，突变体Xa46-KO-2的外显子缺少4个碱基(-4bp)(图5A)(碱基AAGC，位于其全长序列的第17～20位之间)，以上两种敲除类型蛋白序列都发生了变化。突变体植株在白叶枯病菌株J18接种两周后都表现出了明显的感病表型(图5B，C)。

本发明人在接种菌株后的0、7、14天取菌斑叶片，根据叶片内的菌含量所得到生长曲线图显示，从第7天开始突变体中的菌生长量已超过野生型2-3个数量级，直至第14天菌含量各有小幅度增长，但突变体与野生型之间的菌含量差异继续维持(图5D)。

以上数据表明，Xa46基因被敲除突变后，SKZ植株对白叶枯病菌株J18抗性明显下降。

实施例5、互补遗传实验进一步明确Xa46(C1)是抗菌功能基因

以NIP的基因组序列为参考设计引物，通过PCR扩增的方法，本发明人获得了SKZ中Xa46的启动子区域(Xa46的ATG前2953bp的序列)和基因组的全长序列(SEQ ID NO:3)，并将Xa46自身启动子连接Xa46的基因组序列pXa46:Xa46构建到双元载体pCambia1300上，通过农杆菌介导的侵染方法将外源基因Xa46导入到感病植株NIP中。

本发明人发现，互补后的植株NIP-Xa46都能很好地抵抗J18的侵染，几乎看不到菌斑延伸，表现出了很强的抗性(图6A，B)。根据接种J18的0、7和14天的叶片中菌含量所绘制的生长曲线图同样表明(图6C)，Xa46被导入NIP后抗性大幅度增强。为进一步验证互补的表型，本发明人同时用相同方法在TP309背景下转入了Xa46的全长基因组序列，再一次互补了感病材料TP309的表型(图6D，E，F)。由此，本发明人进一步证实Xa46是SKZ材料中的抗菌功能基因。

此外，CDS互补实验证实了Xa46的CDS也具有很强的抗菌功能。本发明人以SKZ的mRNA反转录的cDNA为模板，扩增了Xa46的CDS序列。随后分别以玉米泛素基因启动子pUbi和自身启动子pXa46连接Xa46 CDS，携带含3个Flag蛋白的标签，分别将其导入NIP背景中。

接种结果显示，Xa46的CDS互补NIP后同样提高了抗菌性(图6G，H，I)。

实施例6、Xa46提供植株全生长期抗性

SKZ背景下的Xa46敲除材料的制备：突变体Xa46-KO-1在外显子上多出1个碱基(+1bp)bp(T位于其全长序列的第21～22bp位之间增加1个碱基)，突变体Xa46-KO-2的外显子缺少4个碱基(-4bp)(图5A)(AAGC位于其全长序列的第17～20位之间缺少该4个碱基)。

幼苗的接种实验显示，SKZ背景下的Xa46敲除材料在幼苗时期容易受到J18的侵染，而幼苗SKZ则表现出很强的抗菌性(图7A，B)，由接种J18的0、3、6、9和12天的叶片中菌含量所绘制的生长曲线图证实了以上结论(图7C)。

携带Xa46的NIP幼苗，不论是genome DNA(利用pCambia1300建立的Xa46转基因植物)还是CDS的互补形式(利用Pun1301建立的Xa46转基因植物)，接种2周后菌斑长度很短甚至只看得到刀口(图7D，E)，其叶片内部的菌含量较成株期对比的差异更悬殊(图7F)，说明在幼苗时期Xa46也可以发挥重要抗菌作用。

综合上述结果，本发明人认为，Xa46全长基因及它的CDS都能赋予的水稻抗菌功能，且这类抗性体现在水稻的幼苗和成株整个生长期。

实施例7、Xa46编码一个NLR蛋白，在水稻各组织遍在表达

Xa46所在的基因位点包含一个3285bp开放阅读框，中间含1个4575bp的内含子。Xa46编码1094个氨基酸，蛋白序列预测的编码产物是一个NLR蛋白，由N端的CC结构域，中间的NBS区域和C端LRR结构域组成，因此Xa46基因属于NBS-LRR类植物抗菌基因。

为研究Xa46在水稻各组织中的表达情况，本发明人对SKZ根、茎、叶、穗、种子等组织提取的RNA进行反转录用于荧光定量(qRT-PCR)分析，数据显示，Xa46在多个部位表达，其中幼叶、成熟叶、穗和茎秆处有相对高的转录水平(图8A)；同时，本发明人将Xa46自身启动子驱动GUS报告基因(pXa46:GUS)的片段构建到载体上，通过转基因手段导入NIP背景。GUS染液染色的结果表明，水稻的营养器官和生殖器官包括根、茎、叶、花、穗、种子都有GUS报告基因表达(图8B)，其中叶片、茎着色深，GUS报告基因表达较高；此外，幼穗的表面和内部花粉粒都有GUS报告基因的表达。

以上说明，叶片和茎秆Xa46表达较高，同时种子、穗子和花粉粒甚至根部都存在Xa46的表达，GUS染色结果与qRT-PCR鉴定Xa46表达量的结果吻合。

实施例8、Xa46在亚细胞水平的分布覆盖细胞核、质、膜

为更好地了解Xa46在水稻亚细胞水平的定位情况，本发明人利用水稻原生质体瞬时转化体系，在NIP材料背景下瞬时表达Xa46。转化Xa46-GFP能观察到明显的细胞质定位(图9A)。以OsRac1为膜蛋白标志物(Marker)，以OsNLS为核蛋白标志物，通过共转化Xa46-GFP与Marker基因，发现Xa46具有明显的细胞核和细胞膜定位(图9B)。

因此，Xa46在细胞核质膜多个亚细胞部位都有定位。

实施例9、Xa46的表达不受病原菌诱导

水稻品种NIP中也存在Xa46同源的基因，但不同水稻背景(如NIP和SKZ)的相应基因位点的抗菌功能不同，为研究转录表达水平是否影响抗菌能力，本发明人检测了抗菌品种SKZ与感病品种NIP中Xa46位点的基础转录水平。

结果表示，NIP的本底转录水平仅略低于SKZ(图10A)，本发明人猜测，两者表达量的倍数差异不足以引起抗菌功能的反向差距。此外，对SKZ材料分别接种无菌水、非亲和小种J18和亲和小种PXO99A，0、6、12、24、48和72h的荧光定量PCR数据显示(图10B)，3个处理在72h内Xa46的mRNA量变化波动不大，Xa46不受病原菌诱导。

本发明人检测了感病材料NIP和抗菌材料SKZ中Xa46所在位点编码区的区别，通过cDNA扩增获取粳稻材料NIP中Xa46位点的CDS序列，与SKZ Xa46功能位点的CDS序列比较发现，NIP的Xa46在673位点缺失1bp的碱基(图11A)，导致氨基酸发生移码，蛋白序列在第227位提前终止。本发明人认为，NIP中蛋白序列的变化是引起Xa46基因功能缺失的关键原因。

实施例10、Xa46的抗菌功能实现依赖于全长蛋白

为进一步证实前一实施例的结果，本发明人分别将Xa46各个结构域的截短形式通过转基因导入NIP中，包括CC、NBS、LRR 3个独立domain，以及CC domain截短仅保留NBS和LRR的N端截短Xa46，截短LRR仅保留CC和NBS的C端截短Xa46，以及NIP中Xa46位点完整的CCdomain(仅有2处氨基酸差异，基因序列差异示意图如图11A)。

表1

对以上6个转基因材料进行J18接种测试。菌斑统计揭示，Xa46的CC、NBS和LRR，包括NIP该位点CC domain，表现出一部分的抗菌功能(图11B，C)。

因此，综合比较发现，最优选的是以Xa46全长蛋白来实现抗菌功能。

综上，NIP中Xa46的等位基因缺失的1bp碱基导致蛋白序列改变是其功能变化的主要原因。

实施例11、Xa46与Xa21聚合的分子育种途径

Xa21是一个分离自野生稻(长雄野生稻)的基因，具有广谱的白叶枯抗性，至今已有广泛的田间生产应用，但多年来，Xa21的抗性正在不断被病原菌克服。为互补Xa21的抗谱，本发明人首先通过转基因方式，将Xa46转入水稻TP309背景，利用引物F-5’GATGGGAGAGGTTCATG-3’(SEQ ID NO:4)；R-5’-ATGTCATGTCCGTAACC-3’(SEQ ID NO:5)用于鉴定阳性植株，片段长度982bp。在T0代获得的82株转基因苗中，有65株鉴定为阳性。此外，成株期本发明人通过接种J18的表型判断转基因植株的抗菌性，进一步明确Xa46在TP309背景中表达；结合分子鉴定与抗性鉴定实验，最终得到了纯合的转基因T2代TP309-Xa46株系。

随后，本发明人将纯合的T2代TP309-Xa46株系与水稻材料106(TP309背景，含Xa21基因)通过杂交手段聚合在TP309背景中。杂交后代材料通过分子鉴定，Xa21用F-5’CGATCGGTATAACAGCAAAAC-3’(SEQ ID NO:6)；R-5’-TCTGATCATGCATGTTCTGTG-3’(SEQ IDNO:7)引物鉴定，含576bp片段条带的样品是阳性株系，Xa46鉴定引物同上，随后，杂交材料用PXO99A与J18同步接种，对两个基因聚合后的抗性进行验证，最终本发明人在F3代获得纯合的Xa46/Xa21。

此外，本发明人还通过将SKZ与106植株杂交的方式，获得了两个基因聚合的SKZ/106材料。

实施例12、聚合植物材料Xa46/Xa21的抗谱检测

Xa46作为一个介导小种特异性抗性的R基因，本发明人判断Xa46是以ETI的免疫方式发挥抗菌功能，除了J18小种，本发明人还检测到多个Xa46的不亲和小种。为测试Xa46的抗菌能力，本发明人收集了多种多样的国内外的白叶枯菌株针对TP309，TP309-Xa21，TP309-Xa46，TP309-Xa46/Xa21进行田间测试，Xa46、Xa21和Xa21/Xa46接种46个白叶枯小种的抗菌性统计(菌斑长度)如表2。

表2(单位：cm)

在46个小种中，34个(约74％)菌株接种TP309表现为2.5cm以上菌斑长度的致病性，其中仅有3/34个2.5-5cm菌斑长度的菌株，大部分菌株都对TP309有一定致病力；而有40个(87.2％)以上的菌株接种Xa46的菌斑小于对照TP309菌斑，说明Xa46作为R基因，对白叶枯病害有显著的基础免疫作用。

Xa46对多种菌株的抗性特别强(菌斑不超过1cm)，包括YN系列的云南菌株、菲律宾小种PXO86、LN系列的辽宁菌株LN1，LN2，LN3、吉林菌株JL1，韩国小种J18，T2，YN7，YN18，YN11，YN1等；尤其是JL1，LN1，LN3，J18等菌株(图12A，B)。

本发明人分别用NIP和TP309背景的Xa46幼苗接种JL1，LN1，LN3，和J18接种Xa46幼苗。结果相似，TP309-Xa46和NIP-Xa46同样表现出对这类菌株很强的抗性(图12C，D)。

以上数据表明，Xa46可以抵御多个白叶枯小种的侵染，对大部分菌株有显著的防御能力，因此Xa46是一个具有重要水稻育种价值的抗菌基因。

在此次接种试验中，本发明人发现，Xa46/Xa21的聚合材料接种46个菌株结果显示，一方面，该聚合材料互补了Xa21的抗谱，很好抑制了多个Xa21亲和小种的侵染能力，以LN1，LN3，JL1，J18等最为显著；另一方面，对所有测试菌株都表现出抗菌表型，其中对45/46个(94％)的白叶枯菌株表现为强抗性(1.5cm以下的菌斑长度)，对剩下1个致病力极强的菌株HN-Xoo-2的抗病性相比TP309与单基因也有提升，即对白叶枯病菌的抗谱得到扩展；再者，针对大部分菌株，聚合后的抗病性也比野生型更强。因此，本发明构建的聚合材料在对白叶枯病的抗性和对白叶枯病菌的抗谱等几方面都达到了1+1＞2的效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> 一种新型的广谱抗菌基因及其应用

<130> 212088

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3285

<212> DNA

<213> 稻属(Oryza sativa L.)

<400> 1

atggcggcgg cgctggaagc attcgcggcc aagctggcga acgtcctggt ggggatggcg 60

aaggaggagg tggagacgct cctgggcgtg cccggcgcga tcgccaagct cgagacgacg 120

ctcggcgacc tgagcagcat cctggccgac gccgaccgga ggcgcatcca cgacccgggc 180

gtggagcggt gggtgaggga gctcaaggac gccatgtacg acgccgacga catccttgac 240

ctcttccgcg ccatggaggg cggagaagac cccggctcgc cgccaagagc tgctccggcg 300

ccgtcggcgt gctggagcgc cctctgccgc cgcagccctg ccgctacgcg caagatcggg 360

aggaagatcc aggagctcaa ccggagggtg gaggagatcg cgaagaggag ctcccgcttt 420

ggatttgtct cccaagtaat ccactcctcc tcggcccttc gtctaaccga tagacccatg 480

tgttcttgct cgtcagaaag cagccgcaac agcaagacgg gaccatccat cattcgatcc 540

gatgttgtcg gcgacaagat agatcttcac acaaggaacc tcgttgatct gctgattggc 600

aacaagctgg cggatggtcg cacgcgcgca agatcgtcag gcgatgtcat cgccgtcgcg 660

atcaccggcg ctggggggat aggcaagacc acgcttgcca ggatggtctt caacgacgcc 720

gtgttggaga gccacttcga caagaaggta tggctgagcg tgaatcagga ggtcaacgag 780

gttcacctcc tgcacggcgt gatcgccgcg tttgggggaa gctaccatgg ctgcgccggg 840

gacaaggccc tgctcgagga cacgttgaag catgccgtga ggcagaagag gttcctgctg 900

gtgatggatg acgtgtggag cgatagggtg tggagcgatc tgctccgagc accgctcggt 960

gcttgtgctc ctggaagccg agtgttggtg acgacgagga acgacggagt tgctcgtggg 1020

atgagagccc agcacctcca ccgggttgag aagctggatc taggtgattc ttggtcactg 1080

ctaaagaagc aggtagttct gaacgagggc gatgaatctg agattgatgg actagaggac 1140

atcggattga agatcgtaga aagatgtgat ggcttgccac ttgcgattaa ggttgtgggt 1200

ggactcttac tgaacaaggg caaaacgaga gatgcttggg tgaacgtctc taatcacttt 1260

gcatggtcaa tgacaagaag caatgacgac atcaacaaag cggtctatct gagctacgaa 1320

gagctgcctc cgcatttgaa acagtgcttc gtgttctgct cacttttccc taaagatgaa 1380

ctgatcataa gaggagtaat agtcaggatg tggattgcac aaggttacgg acatgacata 1440

atgagatcga cgctacctga agatttggga gttgaatatt acaatgagtt ggtgtcacgg 1500

aatcttctag agccatacaa acgatcctat gatctatcag caagcacaat gcatgatgtt 1560

attcgctcct ttgctcaaca gatagttaaa gatgaaggac tacttgtcaa tgacagacaa 1620

gatgtgcatg gtattgcagg tgcttcaaag ctgcgtcact tgtctgtatc caaaactgca 1680

atagagcggg tcgctataca aaagcaagtg tcattgagga cattgttgct ctttgggaga 1740

tgtataactg agttgacgta tttcaggaac aatatctctt gcctaagagt actacattta 1800

caaggtgtag atcttgttga cctgccggac tatatatgcc atctcaagca tctaagatac 1860

ttggggcttg caaatacagg catatctgca atccctcgag gcataggaaa tctaaaattt 1920

ctacagttca ttgaccttat ggggtgtcgg aattttcatc agcttcctga cagcatcttg 1980

aagctacaga atatgaggtt tctcgacttc aggggcacga ggttaacctc aattcctcca 2040

ggtatgggaa agctagaaaa cttggtgaac atgttggggt tcccaactta tttggatgac 2100

aggggacatg cctggagcag cttggaagaa ctacggtctt tgtcgaacct aaaatggctt 2160

gatttaagag gtctagagct tgcatcttca ggctctatgg ctgctacagc aatgctcaac 2220

agtaaaaagc acttgaaaat cttagacttg acatttgcca gtaggctcac cgacaacggg 2280

atgatcgaag gaaccagcaa tgtcatcgag gagcaggaac gagccgagga tgtgttgagt 2340

aatctctgtc ctccgccttg cgtagaatgt cttacggtca atggttactt tggatatcga 2400

ctaccccgat ggatgagaac aatgtcggac tttccaagct taaggcgttt ggagctgaag 2460

gactacgtat gctgcaagca gctgcctgtc ggcttgggcc agctcccttt tcttgattat 2520

atttggattg atcatgctcc atccatcgtg agcattggcc atgatctcct cttcctctcc 2580

tcctctagtg ctgatgacca gaaagtcaca actggaacaa ggatcactag gaagctgcag 2640

ctccatggtc tttctcgcgg tgatgctggt gttgcatttc cgaagctaga aacactgggt 2700

ttaaagggga tgttgggatg gagagtgtgg aactgggatc agcaaacacc agggatgccc 2760

gccttagacg ttgttaccat caccggttgt aaactacgtt atcttccgct tggacttgta 2820

caccatgcaa ccgcactaag ggtgctgaat ctcagaaatg cgccgcacct gatctccgta 2880

gagaacttcc cgtcacttgt ggagctcacg tcagctgaca acccgaagct gcagaggatc 2940

tccaacagtc caagactgcg acatatcgtc gttatcagat gcccagggct gaaggtagtg 3000

aaggatttgc aatcacttag gagcgtcatt tggaaggatt tggatgctga tgccctccca 3060

gagtacctac gagagacaga gctaaataag ctggacgtgt actgcagtct aagattgctt 3120

aaactcatat ccttgcaaga tggcagctat gagtgggaaa agatccagca cgtccagcta 3180

ctgaaggcat atgggaagag atcaacggag gataaggttg accggcacat cttctacact 3240

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<210> 2

<211> 1094

<212> PRT

<213> 稻属(Oryza sativa L.)

<400> 2

Met Ala Ala Ala Leu Glu Ala Phe Ala Ala Lys Leu Ala Asn Val Leu

1 5 10 15

Val Gly Met Ala Lys Glu Glu Val Glu Thr Leu Leu Gly Val Pro Gly

20 25 30

Ala Ile Ala Lys Leu Glu Thr Thr Leu Gly Asp Leu Ser Ser Ile Leu

35 40 45

Ala Asp Ala Asp Arg Arg Arg Ile His Asp Pro Gly Val Glu Arg Trp

50 55 60

Val Arg Glu Leu Lys Asp Ala Met Tyr Asp Ala Asp Asp Ile Leu Asp

65 70 75 80

Leu Phe Arg Ala Met Glu Gly Gly Glu Asp Pro Gly Ser Pro Pro Arg

85 90 95

Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Cys Trp Ser Ala Leu Cys Arg Arg Ser

100 105 110

Pro Ala Ala Thr Arg Lys Ile Gly Arg Lys Ile Gln Glu Leu Asn Arg

115 120 125

Arg Val Glu Glu Ile Ala Lys Arg Ser Ser Arg Phe Gly Phe Val Ser

130 135 140

Gln Val Ile His Ser Ser Ser Ala Leu Arg Leu Thr Asp Arg Pro Met

145 150 155 160

Cys Ser Cys Ser Ser Glu Ser Ser Arg Asn Ser Lys Thr Gly Pro Ser

165 170 175

Ile Ile Arg Ser Asp Val Val Gly Asp Lys Ile Asp Leu His Thr Arg

180 185 190

Asn Leu Val Asp Leu Leu Ile Gly Asn Lys Leu Ala Asp Gly Arg Thr

195 200 205

Arg Ala Arg Ser Ser Gly Asp Val Ile Ala Val Ala Ile Thr Gly Ala

210 215 220

Gly Gly Ile Gly Lys Thr Thr Leu Ala Arg Met Val Phe Asn Asp Ala

225 230 235 240

Val Leu Glu Ser His Phe Asp Lys Lys Val Trp Leu Ser Val Asn Gln

245 250 255

Glu Val Asn Glu Val His Leu Leu His Gly Val Ile Ala Ala Phe Gly

260 265 270

Gly Ser Tyr His Gly Cys Ala Gly Asp Lys Ala Leu Leu Glu Asp Thr

275 280 285

Leu Lys His Ala Val Arg Gln Lys Arg Phe Leu Leu Val Met Asp Asp

290 295 300

Val Trp Ser Asp Arg Val Trp Ser Asp Leu Leu Arg Ala Pro Leu Gly

305 310 315 320

Ala Cys Ala Pro Gly Ser Arg Val Leu Val Thr Thr Arg Asn Asp Gly

325 330 335

Val Ala Arg Gly Met Arg Ala Gln His Leu His Arg Val Glu Lys Leu

340 345 350

Asp Leu Gly Asp Ser Trp Ser Leu Leu Lys Lys Gln Val Val Leu Asn

355 360 365

Glu Gly Asp Glu Ser Glu Ile Asp Gly Leu Glu Asp Ile Gly Leu Lys

370 375 380

Ile Val Glu Arg Cys Asp Gly Leu Pro Leu Ala Ile Lys Val Val Gly

385 390 395 400

Gly Leu Leu Leu Asn Lys Gly Lys Thr Arg Asp Ala Trp Val Asn Val

405 410 415

Ser Asn His Phe Ala Trp Ser Met Thr Arg Ser Asn Asp Asp Ile Asn

420 425 430

Lys Ala Val Tyr Leu Ser Tyr Glu Glu Leu Pro Pro His Leu Lys Gln

435 440 445

Cys Phe Val Phe Cys Ser Leu Phe Pro Lys Asp Glu Leu Ile Ile Arg

450 455 460

Gly Val Ile Val Arg Met Trp Ile Ala Gln Gly Tyr Gly His Asp Ile

465 470 475 480

Met Arg Ser Thr Leu Pro Glu Asp Leu Gly Val Glu Tyr Tyr Asn Glu

485 490 495

Leu Val Ser Arg Asn Leu Leu Glu Pro Tyr Lys Arg Ser Tyr Asp Leu

500 505 510

Ser Ala Ser Thr Met His Asp Val Ile Arg Ser Phe Ala Gln Gln Ile

515 520 525

Val Lys Asp Glu Gly Leu Leu Val Asn Asp Arg Gln Asp Val His Gly

530 535 540

Ile Ala Gly Ala Ser Lys Leu Arg His Leu Ser Val Ser Lys Thr Ala

545 550 555 560

Ile Glu Arg Val Ala Ile Gln Lys Gln Val Ser Leu Arg Thr Leu Leu

565 570 575

Leu Phe Gly Arg Cys Ile Thr Glu Leu Thr Tyr Phe Arg Asn Asn Ile

580 585 590

Ser Cys Leu Arg Val Leu His Leu Gln Gly Val Asp Leu Val Asp Leu

595 600 605

Pro Asp Tyr Ile Cys His Leu Lys His Leu Arg Tyr Leu Gly Leu Ala

610 615 620

Asn Thr Gly Ile Ser Ala Ile Pro Arg Gly Ile Gly Asn Leu Lys Phe

625 630 635 640

Leu Gln Phe Ile Asp Leu Met Gly Cys Arg Asn Phe His Gln Leu Pro

645 650 655

Asp Ser Ile Leu Lys Leu Gln Asn Met Arg Phe Leu Asp Phe Arg Gly

660 665 670

Thr Arg Leu Thr Ser Ile Pro Pro Gly Met Gly Lys Leu Glu Asn Leu

675 680 685

Val Asn Met Leu Gly Phe Pro Thr Tyr Leu Asp Asp Arg Gly His Ala

690 695 700

Trp Ser Ser Leu Glu Glu Leu Arg Ser Leu Ser Asn Leu Lys Trp Leu

705 710 715 720

Asp Leu Arg Gly Leu Glu Leu Ala Ser Ser Gly Ser Met Ala Ala Thr

725 730 735

Ala Met Leu Asn Ser Lys Lys His Leu Lys Ile Leu Asp Leu Thr Phe

740 745 750

Ala Ser Arg Leu Thr Asp Asn Gly Met Ile Glu Gly Thr Ser Asn Val

755 760 765

Ile Glu Glu Gln Glu Arg Ala Glu Asp Val Leu Ser Asn Leu Cys Pro

770 775 780

Pro Pro Cys Val Glu Cys Leu Thr Val Asn Gly Tyr Phe Gly Tyr Arg

785 790 795 800

Leu Pro Arg Trp Met Arg Thr Met Ser Asp Phe Pro Ser Leu Arg Arg

805 810 815

Leu Glu Leu Lys Asp Tyr Val Cys Cys Lys Gln Leu Pro Val Gly Leu

820 825 830

Gly Gln Leu Pro Phe Leu Asp Tyr Ile Trp Ile Asp His Ala Pro Ser

835 840 845

Ile Val Ser Ile Gly His Asp Leu Leu Phe Leu Ser Ser Ser Ser Ala

850 855 860

Asp Asp Gln Lys Val Thr Thr Gly Thr Arg Ile Thr Arg Lys Leu Gln

865 870 875 880

Leu His Gly Leu Ser Arg Gly Asp Ala Gly Val Ala Phe Pro Lys Leu

885 890 895

Glu Thr Leu Gly Leu Lys Gly Met Leu Gly Trp Arg Val Trp Asn Trp

900 905 910

Asp Gln Gln Thr Pro Gly Met Pro Ala Leu Asp Val Val Thr Ile Thr

915 920 925

Gly Cys Lys Leu Arg Tyr Leu Pro Leu Gly Leu Val His His Ala Thr

930 935 940

Ala Leu Arg Val Leu Asn Leu Arg Asn Ala Pro His Leu Ile Ser Val

945 950 955 960

Glu Asn Phe Pro Ser Leu Val Glu Leu Thr Ser Ala Asp Asn Pro Lys

965 970 975

Leu Gln Arg Ile Ser Asn Ser Pro Arg Leu Arg His Ile Val Val Ile

980 985 990

Arg Cys Pro Gly Leu Lys Val Val Lys Asp Leu Gln Ser Leu Arg Ser

995 1000 1005

Val Ile Trp Lys Asp Leu Asp Ala Asp Ala Leu Pro Glu Tyr Leu Arg

1010 1015 1020

Glu Thr Glu Leu Asn Lys Leu Asp Val Tyr Cys Ser Leu Arg Leu Leu

1025 1030 1035 1040

Lys Leu Ile Ser Leu Gln Asp Gly Ser Tyr Glu Trp Glu Lys Ile Gln

1045 1050 1055

His Val Gln Leu Leu Lys Ala Tyr Gly Lys Arg Ser Thr Glu Asp Lys

1060 1065 1070

Val Asp Arg His Ile Phe Tyr Thr Lys Asp Pro Tyr Ser Phe Glu Ala

1075 1080 1085

Asp Met Gly Glu Asp Leu

1090

<210> 3

<211> 7860

<212> DNA

<213> 稻属(Oryza sativa L.)

<400> 3

atggcggcgg cgctggaagc attcgcggcc aagctggcga acgtcctggt ggggatggcg 60

aaggaggagg tggagacgct cctgggcgtg cccggcgcga tcgccaagct cgagacgacg 120

ctcggcgacc tgagcagcat cctggccgac gccgaccgga ggcgcatcca cgacccgggc 180

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ctcttccgcg ccatggaggg cggagaagac cccggctcgc cgccaagagc tgctccggcg 300

ccgtcggcgt gctggagcgc cctctgccgc cgcagccctg ccgctacgcg caagatcggg 360

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ctgtggaggc tagaaatttc cacattaatc ggagaaaaag aaaaaaaaga aaaagagagt 1260

ccaactagaa atacaatcta aaaaagagct gaaattcgaa attaaaaata agcaatattg 1320

acagaaattt ctatataaga acccaatacg agattaatta aaattcgaaa taaaaataaa 1380

ataaaattca aaattagaaa aagaaaaggt gagtccatgt aggaatacaa tctaaaaaaa 1440

gctgaaattc ggaattaaaa ataagcaata ttgaaagaat ttttcatata agaacccaat 1500

tcgaaattaa tcaaaattcg aaataaaaat aaaataaaat ctaaaattag aaaagaaaag 1560

gagaatccaa gtaggaatac aatttaaaaa cagctgaaat tcgaaattaa aaataaggaa 1620

tattaaaaga agaatccaaa taagaatcca atacgagatt aattaaattt cggaataaaa 1680

ataaaaataa atccaaaatt agcaaaagaa aataaaagaa gagttcaagt aggaatacaa 1740

tttaaaatta gctggaatta ggaattgaaa ataagcaata ttaaaagaag aatccatata 1800

agaacccaat acgagattaa ttaaaattta gaataaaaaa taaaataata accaaaatta 1860

gaaaaattaa aagagagttc aagtaggaat acaattataa aacaactaaa attgaaaata 1920

aaaaaataaa aacattaaaa gaacacaata cagtattaac taatttttta tgaaataaat 1980

tctggaatta gaaaaagaaa aataaaattt caattaggaa tacaattttt aaataactaa 2040

aatttgtgat aaaaataaag actattaaaa taaaagacca tctaaaacac atgacgaaat 2100

aaattaagta acatgcctat aaagaagtag agtggtggcg gttgatacga catataaaaa 2160

ttgttaataa aacatcaaat aaaatcctaa tgacgattaa aaggagggac gtcaggcaga 2220

ccgtgaagca gacaagtaag gtggtggcca ggacttctag aaagtaaaaa aaaacattga 2280

taatcatttc gatttttaaa atctcaatga caataaaaag gagaagcagc gggcggggtg 2340

tataagagta tagttgcaga gccgccgacg gttgatggga cttctagaaa ataaaaaatg 2400

aattccaatg atagttatgt tcaattttta gaatcacaat gacaataaag agtatgcggt 2460

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gccatagagg agtacaatgg caaagctact gacggtttgg cgggacttct aaaaagtaaa 2700

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taaaaatgaa acttaacgtg acaataaact ctaaaaacta caaaatccaa tttttaaagg 2880

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cataagaggt agcaactggt gtgacttttc aaaactatat aattagaaac acgatgatga 3000

taagttttgg tctttcaaag tcttaataca atgagatagc tattaaataa attttaagta 3060

aaatcatact taaaaaatat atgattttgt ttgggtgcta gccgggcaat tgcgcgggct 3120

acccagctag ttaattacta attagtactg agatgcacat tactaattac tctctccatc 3180

taattttgat agtcatattt tattttggca tactgaccaa ggataagtaa ttctacttat 3240

catccattta aacatgttat ttctcgttaa caagcgatta attaatattt acatttctcg 3300

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tcattaagat gataggttgt tggattgaaa tatgcctatt aaaaataaat ttttcggatt 3420

tggaaatatg cctatcaaaa ctagatggag ggagtactaa ttattactcc ctccatccca 3480

taatataagg gattttgagt ttttccttgc aacgtttgac cactcatctt attcaatttt 3540

ttttgaaatt attaattatt ttatttgtga cttaatttat tatctatagt actttaagca 3600

taacttttcg ttttttatat ttgaaaaaaa atttgaataa gacgagtagt caaatgttac 3660

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ttgaatatag aatagaaatg tgcatctctg tactactccg tcccaaaata taagaacacc 3780

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tatagcctgt ctagattcgt agtactagga aatgtcctat ccggtgttct tattgggacg 3900

gaggaagtac taattagtga gatgcacatt actattctat attcaattaa gagagaatcc 3960

actcagtgcc actgagttta tcacacctct acaatttacc atcgactttg tcaagttcca 4020

caatatacca ttctgctttc ttcaacctct actctctgcc atcaccgtgc actagctgtc 4080

agttaacctc tagttaacct ctgttagcgc tttgaaaaga cctatttgcc cctaactcat 4140

tccacaaggt aattagttgt attttatgca acctcaggac acacataata aaggtatgta 4200

aaccatcaaa cggtttcagc caactagata gggaaaaaaa atcacacatt ttgcttattt 4260

tagctatcca atcaaaaaat tttcaacatg atggatgaca ctaagctcct atagatatag 4320

gagtgaagac caaaatattt cagtatatta gccaactcca tacagtttag taccataata 4380

tgaagagata tttcattaca ttagccaact agaaagtcaa cacacgttca tatagttcac 4440

acattagcca actccatgca gttcagccat acatgttgag gcatacagtt tagaatcaca 4500

gtgaatacgc gcgtccggtt gctgccgcat tggggacgga agtgccagta caacggcggt 4560

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tggggagagg gctcatcggc ggtggcacat ttcggtgggg agaggggaac gatggggaat 5220

taggtcaggg gtggtggtat ctagggttac aaaggttatt ttagtcaata cgagaaaatt 5280

aacagcgcaa aatgtatcct aactgacggt tcgtgacggc gatggcagag agtggaggtt 5340

gaagaaagca ggatggtata ttgtggaact tgacaaagtc gatggtagat tgtagagatg 5400

tgataaactc agtggcactg agtggattct ctcttcaatt attcacagca gcacatacat 5460

gcgttggtgg atggtatttc tcttgctcct acaaaatgtg aggctgttac tagtatttct 5520

gctcagagga aaacaagtgt ttttagcaca aattaagccg ttgaaaccaa cggaaaacaa 5580

cttgatgcaa tatattttac tagtactagg ttttttctcc ctagttttgt tcctctcttg 5640

ctctctgatg tggcaattct ccaacaggta gttctgaacg agggcgatga atctgagatt 5700

gatggactag aggacatcgg attgaagatc gtagaaagat gtgatggctt gccacttgcg 5760

attaaggttg tgggtggact cttactgaac aagggcaaaa cgagagatgc ttgggtgaac 5820

gtctctaatc actttgcatg gtcaatgaca agaagcaatg acgacatcaa caaagcggtc 5880

tatctgagct acgaagagct gcctccgcat ttgaaacagt gcttcgtgtt ctgctcactt 5940

ttccctaaag atgaactgat cataagagga gtaatagtca ggatgtggat tgcacaaggt 6000

tacggacatg acataatgag atcgacgcta cctgaagatt tgggagttga atattacaat 6060

gagttggtgt cacggaatct tctagagcca tacaaacgat cctatgatct atcagcaagc 6120

acaatgcatg atgttattcg ctcctttgct caacagatag ttaaagatga aggactactt 6180

gtcaatgaca gacaagatgt gcatggtatt gcaggtgctt caaagctgcg tcacttgtct 6240

gtatccaaaa ctgcaataga gcgggtcgct atacaaaagc aagtgtcatt gaggacattg 6300

ttgctctttg ggagatgtat aactgagttg acgtatttca ggaacaatat ctcttgccta 6360

agagtactac atttacaagg tgtagatctt gttgacctgc cggactatat atgccatctc 6420

aagcatctaa gatacttggg gcttgcaaat acaggcatat ctgcaatccc tcgaggcata 6480

ggaaatctaa aatttctaca gttcattgac cttatggggt gtcggaattt tcatcagctt 6540

cctgacagca tcttgaagct acagaatatg aggtttctcg acttcagggg cacgaggtta 6600

acctcaattc ctccaggtat gggaaagcta gaaaacttgg tgaacatgtt ggggttccca 6660

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acagcaatgc tcaacagtaa aaagcacttg aaaatcttag acttgacatt tgccagtagg 6840

ctcaccgaca acgggatgat cgaaggaacc agcaatgtca tcgaggagca ggaacgagcc 6900

gaggatgtgt tgagtaatct ctgtcctccg ccttgcgtag aatgtcttac ggtcaatggt 6960

tactttggat atcgactacc ccgatggatg agaacaatgt cggactttcc aagcttaagg 7020

cgtttggagc tgaaggacta cgtatgctgc aagcagctgc ctgtcggctt gggccagctc 7080

ccttttcttg attatatttg gattgatcat gctccatcca tcgtgagcat tggccatgat 7140

ctcctcttcc tctcctcctc tagtgctgat gaccagaaag tcacaactgg aacaaggatc 7200

actaggaagc tgcagctcca tggtctttct cgcggtgatg ctggtgttgc atttccgaag 7260

ctagaaacac tgggtttaaa ggggatgttg ggatggagag tgtggaactg ggatcagcaa 7320

acaccaggga tgcccgcctt agacgttgtt accatcaccg gttgtaaact acgttatctt 7380

ccgcttggac ttgtacacca tgcaaccgca ctaagggtgc tgaatctcag aaatgcgccg 7440

cacctgatct ccgtagagaa cttcccgtca cttgtggagc tcacgtcagc tgacaacccg 7500

aagctgcaga ggatctccaa cagtccaaga ctgcgacata tcgtcgttat cagatgccca 7560

gggctgaagg tagtgaagga tttgcaatca cttaggagcg tcatttggaa ggatttggat 7620

gctgatgccc tcccagagta cctacgagag acagagctaa ataagctgga cgtgtactgc 7680

agtctaagat tgcttaaact catatccttg caagatggca gctatgagtg ggaaaagatc 7740

cagcacgtcc agctactgaa ggcatatggg aagagatcaa cggaggataa ggttgaccgg 7800

cacatcttct acactaagga tccgtactcg tttgaagcag atatgggcga agatctatga 7860

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 4

gatgggagag gttcatg 17

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

atgtcatgtc cgtaacc 17

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

cgatcggtat aacagcaaaa c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

tctgatcatg catgttctgt g 21

Claims

1.一种增强禾本科植物的抗菌能力的方法，其特征在于，所述方法包括：在植物中引入Xa46基因、表达具有抗菌活性的Xa46蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述在植物中引入Xa46基因包括：

将Xa46基因或含有该基因的表达构建物体引入植物中；或

对Xa46基因进行功能获得性突变、能表达具有抗菌活性的Xa46蛋白。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物还包含其它抗菌基因，其表达具有抗菌活性的抗菌蛋白；较佳地，所述包含其它抗菌基因的植物为：内源存在其它抗菌基因，外源引入有其它抗菌基因；其中，所述其它抗菌基因包括选自：Xa1～Xa45的抗菌基因；较佳地包括选自：Xa21，Xa1，Xa3/Xa26，Xa4，xa5，Xa7,Xa10，xa13，Xa23，xa25，Xa27，xa41，Xa2，Xa14，Xa31，Xa45，xa8，xa15，xa19，xa20等；更佳地所述其它抗菌基因为Xa21。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将引入有Xa46基因的植物与包含所述其它抗菌基因的植物进行杂交，获得能表达活性Xa46蛋白和活性的其它抗菌蛋白的子代植物；

较佳地，所述方法还包括：将子代植物进一步杂交或自交，获得能表达活性活性Xa46蛋白和活性的其它抗菌蛋白的子代植物。

5.一种Xa46基因或其编码的蛋白用途，用于：增强禾本科植物的抗菌能力；或用于制备增强禾本科植物的抗菌能力的制剂。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的禾本科植物是引入有其它抗菌基因或其它抗菌基因被上调、表达具有抗菌活性的其它抗菌蛋白的植物；较佳地，含有所述其它抗菌基因的植物为：内源存在其它抗菌基因，外源引入有其它抗菌基因；其中，所述其它抗菌基因包括选自：Xa1～Xa45的抗菌基因；较佳地包括选自：Xa1～Xa45的抗菌基因；较佳地包括选自：Xa21，Xa1，Xa3/Xa26，Xa4，xa5，Xa7,Xa10，xa13，Xa23，xa25，Xa27，xa41，Xa2，Xa14，Xa31，Xa45，xa8，xa15，xa19，xa20等；更佳地为Xa21。

7.如权利要求1～6任一所述，其特征在于，所述Xa46蛋白包括：

(a)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；

(c)氨基酸序列与(a)限定的氨基酸序列有80％以上相同性且具有(a)多肽功能的多肽；或

(d)具有(a)多肽功能的SEQ ID NO:2的片段；较佳地包括其含有选自下组区域的片段：CC结构域，NBS结构域，LRR 3结构域，CC结构域截短仅保留NBS和LRR的N端截短，或截短LRR仅保留CC和NBS的C端截短片段。

8.如权利要求1～6任一所述，其特征在于，所述植物包括下组或所述Xa46来自包括下组：水稻、小麦、黍、粟、玉米、高粱、小米、大麦、黑麦、燕麦、二穗短柄草。

9.如权利要求1～7任一所述，其特征在于，所述的菌包括：稻黄单胞菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzae)。

10.如权利要求1～7任一所述，其特征在于，所述抗菌能力包括对白叶枯病菌的抗性。

11.一种植物Xa46基因或其编码的蛋白的用途，用于作为鉴定禾本科植物抗菌能力的分子标记。

12.一种鉴定禾本科植物性状的方法，所述方法包括：鉴定测试植物中Xa46基因或其编码的蛋白的序列，若所述Xa46基因编码具有抗菌活性的Xa46蛋白，未发生导致抗菌活性丧失的变异，则所述植物为具有抗菌能力的植物；较佳地，所述导致抗菌活性丧失的变异包括：基因移码或蛋白提前终止；更佳地，包括鉴定测试植物Xa46基因序列中相应于SEQ IDNO:1所示核苷酸序列第673位碱基是否发生缺失，若发生缺失、则所述植物为不具有抗菌能力的植物，若未缺失、且其他处序列无缺失则所述植物为具有抗菌能力的植物。

13.一种植物细胞、组织或器官，其特征在于，其中引入有外源的Xa46基因；较佳地，其中引入了含有Xa46基因的表达构建物。

14.如权利要求13所述的植物细胞、组织或器官，其特征在于，其中还包含其它抗菌基因，其表达具有抗菌活性的抗菌蛋白；较佳地，所述包含其它抗菌基因的植物细胞、组织或器官为：内源存在其它抗菌基因，外源引入有其它抗菌基因或其它抗菌基因被上调；其中，所述其它抗菌基因包括选自：Xa1～Xa45的抗菌基因；较佳地包括选自：Xa21，Xa1，Xa3/Xa26，Xa4，xa5，Xa7,Xa10，xa13，Xa23，xa25，Xa27，xa41，Xa2，Xa14，Xa31，Xa45，xa8，xa15，xa19，xa20等；更佳地为Xa21。