CN115429791A - 蛇床子素在制备预防和/或治疗肺癌药物中的应用及其药物组合物 - Google Patents

蛇床子素在制备预防和/或治疗肺癌药物中的应用及其药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蛇床子素在制备预防和/或治疗肺癌药物中的应用。属于医药技术领域。蛇床子素通过线粒体途径促进肺癌细胞的凋亡，同时伴随活性氧含量的下调，发挥抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用，进而发挥抗肺癌效果，为非小细胞肺癌的治疗提供了技术支持以及新的治疗方向。本发明还提供了一种含有蛇床子素活性成分，用于预防和/或治疗非小细胞肺癌的药物组合物，为肺癌药物的开发提供了技术支持。

Description

蛇床子素在制备预防和/或治疗肺癌药物中的应用及其药物 组合物
技术领域
本发明涉及医药技术领域，更具体的说涉及蛇床子素在制备预防和/或治疗肺癌药物中的应用及其药物组合物。
背景技术
肺癌是最常见的原发性和恶性肿瘤之一，绝大多数的肺癌起源于支气管粘膜上皮，故称支气管肺癌，包括鳞癌、腺癌、小细胞癌和大细胞癌几种主要类型，绝大多数起源于支气管黏膜上皮，源于支气管腺体或肺泡上皮细胞者较少。肺癌的发病率和死亡率正在迅速上升，而且是世界性的趋势，目前治疗肺癌常采用外科手术、肺脏移植、化学药物放射治疗等常规方法，但肺癌发病隐匿，早期临床症状不明显，大多数患者错过了最佳的手术治疗时期，肺脏移植又存在年龄限制，化学药物放射性治疗副作用大，给患者身心带来了巨大的伤害，且复发率高。
天然化合物，具有安全、高效、低毒、低残留的特点，可通过多途径、多靶点，提高机体的免疫力和抗应激能力，且现有技术表明，目前诸多学者研究发现从植物中提取得到了多种天然化合物具有抗肿瘤活性，如姜黄素具有治疗鼻咽癌的活性、从瑞香狼毒植物中提取出的香豆素等化合物具有良好的体外抗肝癌活性，因此寻找一种多靶点、低成本、毒副作用小的天然化合物，实现肺癌的靶向治疗，解决肺癌的增殖、迁移和侵袭问题是目前亟需解决的问题。
蛇床子素，又名甲氧基欧芹酚，英文名Osthole，其化学名称为7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素，是从伞形科植物蛇床子中提取出来的一种主要活性成分，蛇床子素具有广泛的药理活性，可用于温肾壮阳，燥湿，祛风，杀虫、阳痿、宫冷、不孕、寒湿带下、湿鼻腰痛；具有解痉、降血压、抗心律失常、增强免疫功能及广谱抗菌作用；以上结果均提示蛇床子素的临床使用价值很大，但蛇床子素在抗肺癌方面的应用尚未见报道。
因此，如何提供一种蛇床子素在制备预防和/或治疗肺癌药物中的应用及其药物组合物是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了蛇床子素在制备预防和/或治疗肺癌药物中的应用及其药物组合物。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
蛇床子素在制备预防和/或治疗肺癌药物中的应用。
优选地，蛇床子素作用于肺癌细胞增殖、迁移和侵袭阶段而发挥抗肺癌作用。
优选地，蛇床子素通过线粒体途径促进肺癌细胞的凋亡，同时伴随活性氧含量的下调，发挥抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用。
优选地，所述肺癌为人的非小细胞肺癌。
上述操作的有效效果为：蛇床子素通过线粒体途径促进肺癌细胞的凋亡，
同时伴随活性氧含量的下调，显著抑制非小细胞A549的增殖、迁移和侵袭，且存在剂量依赖性。
本发明的另一目的是提供一种预防和/或治疗肺癌的药物组合物，其活性成分包括蛇床子素。
优选地，蛇床子素作用于肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭阶段而发挥抗肺癌作用。
优选地，蛇床子素通过线粒体途径促进肺癌细胞的凋亡，同时伴随活性氧含量的下调，发挥抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用。
优选地，所述肺癌为人的非小细胞肺癌。
优选地，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或乳剂。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本申请提供了一种蛇床子素在制备预防和/或治疗肺癌药物中的应用及其药物组合物，经研究发现天然化合物-蛇床子素具有抗非小细胞肺癌的活性，通过线粒体途径促进肺癌细胞的凋亡，实现肺癌的靶向治疗，解决非小细胞A549肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭问题，为非小细胞肺癌的治疗提供了新的治疗方向。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为蛇床子素高效液相色谱图；
图2附图为蛇床子素处理A549肺癌细胞72h的剂量--反应曲线；
图3附图为蛇床子素和顺铂处理A549肺癌细胞不同时间点对A549肺癌细胞增殖的影响，组间差异用GraphPad PrismTM 5.0软件中的t-test，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；数据采用Mean±Standard Errors Mean(SEM)的形式表示；
图4附图为蛇床子素和顺铂处理A549肺癌细胞72h时对其迁移率的影响，其中Bar＝100μm，数据通过GraphPadPrismTM 5.0软件，多组之间采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，不同的字母表示组间有显著差异，P＜0.05，数据采用SEM的形式表示；
图5附图为蛇床子素处理A549肺癌细胞48h时对其侵袭数量的影响，不同的字母表示组间有显著差异，P＜0.05，数据采用SEM的形式表示；
图6附图为蛇床子素和顺铂处理A549肺癌细胞48h时对其细胞凋亡率的影响；
图7附图为蛇床子素和顺铂处理A549肺癌细胞48h时对其细胞线粒体膜电位(MMP)变化的影响；
图8附图为蛇床子素和顺铂处理A549肺癌细胞48h对其ROS的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所用原材料如下：
蛇床子素纯品，购于南京泽朗生物科技有限公司，纯度≥98％，批号为ZL2021082010。
顺铂，购于北京索莱宝科技有限公司，Purity≥98.5％，CAS为1566-27-1。
肺癌细胞：非小细胞A594肺癌细胞。
实施例1
对购于南京泽朗生物科技有限公司，纯度≥98％，批号为ZL2021082010的蛇床子素进行HLPC定性和定量分析，定性分析结果如图1附图所示，结果显示，所购产品确为蛇床子素，产品纯度为99.49％。
实施例2
MTT法检测Osthole对A549肺癌细胞的细胞毒性。
细胞培养：取对数期的A594肺癌细胞，接种到96孔板中，细胞接种密度为1×106个/mL，37℃、5％的CO2条件下进行细胞培养，培养至细胞长至单层备用。
将Osthole采用2％FBS细胞维持液2倍倍比稀释成八个浓度梯度作为试验组，并设置顺铂阳性药物对照组和加入细胞维持液的A594空白细胞对照组，进行细胞毒性实验，将Osthole、顺铂、细胞维持液，分别加入到96孔细胞板中，加入量均为100μL/孔，每个浓度设置4个复孔，进行3次重复，每天观察细胞病变情况，培养72h后，计算细胞病变率、最大安全浓度(MNTC)和半数安全浓度(CC50)。
细胞病变率(CR)＝[(OD control-OD test)/OD]×100％，其中，对于细胞细胞OD值：采用培养至72h的细胞液，弃上清，用MTT法测得。
最大安全浓度(MNTC)和半数安全浓度(CC50)：采用GraphPad PrismTM 5.0软件分析确定。
结果分析：
供试品作用72h后，显微镜观察细胞状态，并记录蛇床子素处理A594肺癌细胞72h的剂量-反应结果，如图2附图所示，结果显示：当蛇床子素浓度为0.02mg/mL时，细胞折光性好，生长状态良好，根据MTT法所测OD值，计算各组细胞存活率，得出蛇床子素在A549细胞上的MNTC为0.02mg/mL；
根据OD值计算出各组细胞的存活率，带入GraphPad PrismTM 5.0软件计算蛇床子素的CC50值为：0.03084±0.001691mg/mL；蛇床子素和顺铂均呈现“S”型剂量依赖关系，随着浓度的增加，细胞出现不同程度皱缩、破裂、脱落等病变。
实施例3
MTT法检测Osthole对A549肺癌细胞增殖能力的影响。
细胞培养：取对数期的A594肺癌细胞，接种到96孔板中，细胞接种密度为1×106个/mL，37℃、5％的CO2、10％DMEM条件下进行细胞培养，培养至细胞长至单层备用。
设置0.02mg/mL、0.01mg/mL、0.005mg/mL三个浓度梯度的Osthole作为对照组、同时设置浓度为0.016mg/mL的顺铂阳性药物对照组和加入细胞维持液A594空白细胞对照组，进行A549肺癌细胞增殖能力影响实验，将Osthole、顺铂和细胞维持液，分别加入到96孔细胞板中，加入量均为100μL/孔，每个浓度设置4个复孔，进行3次重复，待细胞培养至24h、48h和72h时采用MTT法，用酶标仪测OD值，计算细胞增值率，采用GraphPad PrismTM5.0软件分析结果，实验结果如图3附图所示。
细胞增殖率(Cell proliferation rate，PR)＝1-[(OD control-OD test)/OD]×100％
结果分析：
结果表明Osthole对A549肺癌细胞的增殖具有显著的抑制作用(p＜0.05)且具有剂量依懒性。
实施例4
细胞划痕法检测Osthole对A549肺癌细胞迁移率的影响。
细胞培养：取对数期的A549肺癌细胞，接种到6孔板中，细胞接种密度为1×106个/mL，37℃、5％的CO2条件下培养至融合率达80％～90％。
设置0.02mg/mL、0.01mg/mL、0.005mg/mL三个浓度梯度的Osthole作为对照组、同时设置浓度为0.016mg/mL的顺铂阳性药物对照组和加入细胞维持液的A594空白细胞对照组，进行A549肺癌细胞迁移率影响实验，用移液器黄枪头，垂直六孔板均匀施力划线，并用无菌的PBS洗去漂浮的细胞，将Osthole、顺铂和细胞维持液分组进行细胞给药，每个浓度设3个复孔，用倒置显微镜观察拍照记录给药0h、24h、48h、72h的细胞迁移情况，用Image J软件分析给药各时间点的划痕面积，并计算迁移率，实验结果如图4附图所示。
结果分析：
实验结果表明Osthole对A549肺癌细胞的迁移具有显著的抑制作用(p＜0.05)且具有剂量依懒性。
实施例5
基质胶侵袭实验评价Osthole对A549肺癌细胞侵袭能力的影响。
设置0.02mg/mL、0.01mg/mL、0.005mg/mL三个浓度梯度的Osthole作为对照组、同时设置浓度为0.016mg/mL的顺铂阳性药物对照组和加入细胞维持液的A594空白细胞对照组，进行A549肺癌细胞侵袭能力影响实验。
(1)把Transwell小室放在24孔板内，与高压灭菌过的枪头一起放入-20℃预冷；
(2)在冰上用DMEM培养基10倍稀释基质胶(Matrig，康宁)，在每个小室的上室内分别垂直加入100uL稀释后的基质胶，37℃恒温培养箱中放置2小时，凝固基质胶；
(3)将下室加入500mL含有20％胎牛血清的完全培养基，再将对数生长期的A549肺癌细胞，以2.5×105个/mL的细胞密度接种到24孔板的上室中，100μL/孔，使细胞均匀分布在Transwell的上室
(4)同时将Osthole、顺铂和细胞维持液依次加入24孔的上室中，100μL/孔，置于37℃、5％CO2环境下培养48h后，冷丙酮固定、结晶紫染色，在100x或200x显微镜下拍照，实验结果如图5附图所示。
结果分析：
实验结果表明Osthole对A549肺癌细胞的侵袭具有显著的抑制作用(p＜0.05)且具有剂量依懒性。
实施例6
细胞流式术检测Osthole对A549肺癌细胞凋亡的影响。
细胞培养：取对数期的A549肺癌细胞，接种至6孔细胞培养板中，细胞接种密度为1×106个/mL，37℃、5％的CO2条件下培养单层备用。
设置0.02mg/mL、0.01mg/mL、0.005mg/mL三个浓度梯度的Osthole作为对照组、同时设置浓度为0.016mg/mL的顺铂阳性药物对照组和加入细胞维持液的A594空白细胞对照组，进行A549肺癌细胞凋亡影响实验。
(1)将Osthole、顺铂和细胞维持液，加至6孔细胞培养板中，2mL/孔，每个浓度设置4个复孔，进行3次重复，37℃、5％的CO2条件下培养48h，观察细胞生长情况；
(2)采用不含EDTA的胰酶消化液进行消化、收获悬液并离心。按照AnnexinV-/FITC-PI检测试剂盒说明书操作，采用流式细胞仪检测各组结果；
(3)使用FLOW JO软件分析存活细胞，早期凋亡细胞(AnnexinV/PI)，晚期凋亡细胞和坏死细胞所占百分比，所有数据用GraphPad PrismTM 5.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)确定各组之间的差，实验结果如图6附图所示。
结果分析：
实验结果表明Osthole能显著促进A549肺癌细胞的凋亡(p＜0.05)，且具有剂量依懒性。
实施例7
细胞流式术检测Osthole对A549肺癌细胞MMP的影响。
设置0.02mg/mL、0.01mg/mL、0.005mg/mL三个浓度梯度的Osthole作为对照组、同时设置浓度为0.016mg/mL的顺铂阳性药物对照组和加入细胞维持液的A594空白细胞对照组，进行A549肺癌细胞线MMP影响实验。
(1)将Osthole、顺铂和细胞维持液，加至6孔细胞培养板中，2mL/孔，每个浓度设置4个复孔，进行3次重复，37℃、5％的CO2条件下培养48h，观察细胞生长情况；
(2)采用不含EDTA的胰酶消化液进行消化、收获悬液并离心。按照JC-1检测试剂盒说明书操作，采用流式细胞仪检测各组结果；
(3)使用FLOW JO软件分析所有数据用GraphPad PrismTM 5.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，实验结果如图7附图所示。
结果分析：
实验结果表明Osthole能通过线粒体凋亡途径显著促进A549肺癌细胞的凋亡(p＜0.05)，且具有剂量依懒性。
实施例8
细胞流式术检测蛇Osthole对A549肺癌细胞ROS的影响。
设置0.02mg/mL、0.01mg/mL、0.005mg/mL三个浓度梯度的Osthole作为对照组、同时设置浓度为0.016mg/mL的顺铂阳性药物对照组和加入细胞维持液的A594空白细胞对照组，进行A549肺癌细胞ROS影响实验。
(1)将Osthole、顺铂和细胞维持液，加至6孔细胞培养板中，2mL/孔，每个浓度设置4个复孔，进行3次重复，37℃、5％的CO2条件下培养48h，观察细胞生长情况；
(2)采用不含EDTA的胰酶消化液进行消化、收获悬液并离心。按照ROS检测试剂盒说明书操作，采用流式细胞仪检测各组结果；
(3)使用FLOW JO软件分析所有数据用GraphPad PrismTM 5.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，实验结果如图8附图所示。
结果分析：
实验结果表明Osthole能显著下调ROS水平(p＜0.05)，且具有剂量依懒性。
综上，本申请发现天然化合物-蛇床子素具有抗非小细胞肺癌的活性，并通过线粒体途径促进肺癌细胞的凋亡，同时伴随活性氧含量的下调，实现肺癌的靶向治疗，解决非小细胞A549细胞的增殖、迁移和侵袭问题。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.蛇床子素在制备预防和/或治疗肺癌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述蛇床子素在制备预防和/或治疗肺癌药物中的应用，其特征在于，蛇床子素作用于肺癌细胞增殖、迁移和侵袭阶段而发挥抗肺癌作用。
3.根据权利要求1所述的蛇床子素在制备预防和/或治疗肺癌药物中的应用，其特征在于，蛇床子素通过线粒体途径促进肺癌细胞的凋亡，同时伴随活性氧含量的下调，发挥抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用。
4.根据权利要求1-3任一所述的蛇床子素在制备预防和/或治疗肺癌药物中的应用，其特征在于，所述肺癌为人的非小细胞肺癌。
5.一种预防和/或治疗肺癌的药物组合物，其特征在于，活性成分包括蛇床子素。
6.根据权利要求5所述的一种预防和/或治疗肺癌的药物组合物，其特征在于，蛇床子素作用于肺癌细胞增殖、迁移和侵袭阶段而发挥抗肺癌作用。
7.根据权利要求6所述的一种预防和/或治疗肺癌的药物组合物，其特征在于，蛇床子素通过线粒体途径促进肺癌细胞的凋亡，同时伴随活性氧含量的下调，发挥抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用。
8.根据权利要求5-7任一所述的一种预防和/或治疗肺癌的药物组合物，其特征在于，所述肺癌为人的非小细胞肺癌。
9.根据权利要求5-8任一所述的一种预防和/或治疗肺癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或乳剂。
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