CN115427014A - 牛奶外泌体的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及牛奶外泌体的新用途，并且更具体地讲，提供牛奶外泌体在比如功能性化妆品、具有各种功能(比如改善肠道健康和免疫)的功能性保健食品以及包括伤口愈合药物在内的药物中的各种用途。

Description

牛奶外泌体的新用途

技术领域

本发明涉及牛奶外泌体的新用途，并且更具体地讲，涉及牛奶外泌体在功能性化妆品、保健功能食品、药物等方面的各种用途。

背景技术

外泌体是大小为几十到数百纳米的囊泡，由与质膜结构相同的双层磷脂组成。外泌体含有蛋白、核酸(mRNA、miRNA等)等外泌体货物，并且在这种外泌体货物中包括广泛范围的信号传导因子，已知这些信号传导因子对细胞类型具有特异性，并根据分泌细胞的环境进行不同调控。已知外泌体为由细胞分泌的胞间信号传导介质，并且通过外泌体传递的各种细胞信号调控细胞行为，包括所靶向细胞的激活、生长、迁移、分化、去分化、凋亡和坏死。已知外泌体根据其来源细胞的性质和状态而含有特定的遗传物质和生物活性因子。

由于外泌体基本上来源于细胞，因此与其他纳米颗粒不同，它们具有生物相容性，并且由于其能够在内部或表面携带或标记药物或生物活性组分，因此一直在不断努力利用外泌体作为药物载体或者化妆品或药物的原料。

在这方面，韩国专利KR 2039302公开了用于增强和功能性改善角膜层皮肤屏障的化妆品组合物，其包含作为活性成分的源于干细胞的外泌体；韩国专利KR 1662405公开了用于治疗脑血管疾病的药用组合物，其包含作为活性成分的源于干细胞的外泌体；韩国专利KR 1894229公开了包含作为活性成分的源于鹿茸干细胞培养物的外泌体的组合物，用于预防或治疗脱发，或者生发或促进毛发生长；以及专利WO 2016039356A1公开了包含作为活性成分的乳源外泌体的抗炎药物。

然而，关于乳源外泌体，除了它们在WO2016039356A1中公开的作为抗炎药物的用途，和由Munagala等人(Cancer Lett., 371(1): 48-61, 2016)公开的作为药物载体的用途，乳源外泌体的其他用途鲜为人知。

同时，皮肤由以下组成：为复层鳞状上皮的表皮、由致密结缔组织组成的真皮、由松散结缔组织组成的皮下层。表皮位于皮肤的最外层，形成覆盖身体表面的防水保护膜，并且由鳞状上皮细胞层和下面的基底层组成。表皮不含血管，并且仅有少量与中枢神经系统相关的神经。构成表皮的主要细胞类型包括角质形成细胞、黑素细胞、郎格汉斯细胞和梅克尔细胞。真皮层为表皮下面的皮肤层，由结缔组织组成，并且提供保护身体免受压力和张力的缓冲作用。真皮经基底层与表皮紧密连接，从而支撑表皮并供给营养，且含有许多感应接触和热量的神经末梢。

皮肤会随着年龄的增长或者紫外线、外部污染物和压力而逐渐受到损伤，并且由于保护皮肤免受这种因素影响的功能下降，因此细胞保护和增殖能力也下降。在这种情况下，我们的身体会启动受损皮肤的皮肤再生过程。皮肤再生为组织针对损伤的任何反应，且其为复杂的生物过程，包括趋化性、细胞分化和复制、基质蛋白的合成、血管生成和伤口重建，作为一系列组织修复过程(Steed, D. L.等人, Clin.Plast.Surg.25:397, 1998)。

当皮肤受损时，细胞增殖过程遵循炎症反应，在皮肤损伤之后持续2天-3周。在此期间，成纤维细胞沉积胶原蛋白，填充受损皮肤，成纤维细胞增殖被诱导，并且新细胞和间质成分的重建在伤口区域发生。这种增殖过程，也被称为肉芽形成过程，在伤口形成之后持续2天-3周。在由新细胞形成的年轻皮肤中，皮肤细胞的活性高，使得真皮中的成纤维细胞在胶原蛋白的合成和代谢中高度活跃，这对于皮肤紧致和抑制皱纹形成很重要。另外，含有对皮肤保湿至关重要的透明质酸的糖蛋白GAG (葡糖胺聚糖)的合成也是活跃的，因此赋予皮肤紧致、水分和弹性。此外，在表皮层中，基底层细胞活跃地增殖，以及增强皮肤细胞之间连接的粘附蛋白(比如层粘连蛋白、整合素和桥粒)的平衡产生得以发生，从而增强细胞组织并保持皮肤健康。

然而，由于皮肤再生能力随着年龄的增长而下降，当由于紫外线、污染物或压力而发生皮肤损伤时，皮肤再生发生不完全。因此，皮肤失去紧致，形成皱纹，经历变色和色素沉着过度(比如老年斑、斑点、雀斑和黑斑)，并失去保水能力。

因此，为保持紧致、湿润和健康的皮肤，恢复随着年龄的增长而下降的皮肤再生能力可能是最重要的。涉及用于此类皮肤再生目的的功能性化妆品组合物的现有技术包括：韩国专利KR 1888258，其涉及用于皮肤再生的组合物，该组合物包含作为活性成分的从雏菊飞蓬花(Daisy fleabane flowers)中提取的精油；韩国专利KR 1422690，其涉及用于皮肤再生的组合物，该组合物包含源于胚胎干细胞的血管生成祖细胞的培养分泌物；和韩国专利KR 1663912，其涉及用于皮肤美白、皮肤皱纹减少或皮肤再生的化妆品组合物，该组合物包含作为活性成分的源于人类脂肪源性干细胞的外泌体。

然而，以上现有技术具有诸如生产成本过高、体内稳定性和安全性未经检验等问题。

同时，免疫为在生理上区分体内的外源性和内源性异物，并将其排除和代谢的自我防御反应。免疫可分为先天免疫(即初始免疫)和获得性免疫(即适应性免疫)。在初始免疫中，巨噬细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)的活动通过抑制异物(病原体)来保护宿主，并且在此，巨噬细胞在吞噬异物的同时产生并释放活性标志物TNF-α，而NK细胞产生和释放活性标志物穿孔素，以杀伤病原体感染的细胞。随后，参与获得性免疫的细胞毒性T淋巴细胞、辅助性T淋巴细胞和B淋巴细胞被激活以杀伤感染的细胞或产生抗体来保护宿主。细胞毒性T淋巴细胞就像NK细胞一样，产生并释放大量穿孔素以杀伤病原体感染的细胞，而B淋巴细胞产生抗体，依赖或独立于辅助性T淋巴细胞，以保护宿主。炎性细胞因子比如IL-6、IL-8和TNF-α为介导免疫的物质，并且已知特别是参与初始免疫。此外，由于先天免疫作为针对癌细胞的防御机制发挥极其重要的作用，因此近年来利用激活先天免疫比如以NK细胞和T细胞作为作用机制的细胞治疗产品已受到了更多关注。

通常，在免疫缺陷的情况下，对感染的抵抗力受损，并且具有抗体缺陷的患者无法防御细菌感染，且中性粒细胞的吞噬能力也受损。此外，在这种情况下，补体系统的激活也受损，不能产生白细胞迁移因子等，随后增加炎症率并引起病毒血症，扩散到中枢神经系统和其他部位。此外，在癌症患者的情况下，在化学疗法或放射疗法过程期间，不仅癌细胞而且正常细胞均会受到影响，从而导致严重降低患者免疫的不良反应。

在这种背景下，需要开发能够增强免疫的免疫增强剂，或用于增强免疫的功能性保健食品，以用于预防或治疗癌症或感染性疾病。

同时，根据2001年至2008年韩国国民健康保险公团(National Health InsuranceCorporation)健康保险政策研究院(Health Insurance Policy Research Institute)调查的健康保险医疗费用支付数据，2001年实际治疗“脱发”的患者数量为103,000人，2005年为142,000人，和2008年为165,000人，显示在过去7年中增长60%。按照年龄，20-49岁患者数量为114,000人，占总患者人数的69.5%，并且10-19岁或以下患者数量为22,000人或以上。截至2008年，在实际治疗的患者中，84,000人为男性而80,000人为女性，表明男性略多于女性，并且截至2008年，在自然健康保险实际治疗的患者中“脱发”的具体类型包括斑秃(130,000)、瘢痕性脱发(2,000)、雄激素性脱发(9,000)和其他非瘢痕性脱发(8,000)。同时，根据国际美发与化妆品研究论坛(International Hair and Cosmetics Research Forum)2003年6月的数据，存在2.5亿脱发患者，并且24-50岁之间的脱发发生率为30-65%。截至2008年，中国有约3亿人脱发，并且其中30%的30-39岁男性人口和50%的50-59岁男性人口显示脱发迹象，并且脱发患者数量每年增加10-15%。根据2007年日本销售假发和进行植发手术的企业调查的数据，日本人口中脱发的发生率为26.5%，并且脱发患者数量估计为约1293万。

目前，用于脱发治疗的制剂主要分为药物、准药物和化妆品。仅能凭医生处方购买的处方药包括默克公司在美国开发和销售的“保法止”。保法止的主要成分非那雄胺于1997年12月被美国FDA批准作为脱发治疗药物。非那雄胺为抑制将睾酮转化为双氢睾酮(DHT)的5α-还原酶的药物，并在将毫毛生长成浓密长发方面发挥作用。尽管非那雄胺在短期内能够有效减轻脱发，但其伴随副作用，比如男性勃起功能障碍、性功能下降和乳房增大。已经因其安全性和有效性而得到认可并因此无需医生处方即可购买的非处方药包括米诺地尔。米诺地尔于1997年12月被FDA批准为第一种局部脱发治疗药物。尽管该药物通过改善血液循环和打开钾通道而具有促进毛发生长的作用，但其可能会引起局部反应，比如可能发生瘙痒和皮疹，并可能引起心动过速等。

在已被韩国食品药品管理局(Korean Food and Drug Administration)批准用于脱发预防和毛发生长功能的产品中，根据保健福祉部长官(Minister of Health andWelfare)的公告，可在超市或便利店销售的准药品包括CJ Lion的“Hair PowerCompetent”、Moracle的“Hair Tonic”、LG Household & Health Care的“Mo & More”，以及作为化妆品，销售洗发水或者用于头皮或毛发以保持或促进皮肤和毛发健康的产品。

人类脱发周期主要分为生长期(毛发生长期)、过渡期(退行期)和静止期(休止期)。毛发生长期为其中毛囊真皮毛乳头细胞活跃、细胞分裂迅速和毛发快速生长的阶段。毛发生长期的持续时间尽管因毛发类型而异，但对于头发而言为约3-6年。毛发生长期的毛发占总毛发的80-90%，并且正在经历脱发的人往往有着毛发生长期缩短和休止期延长的毛发周期，总毛发中毛发生长期的毛发部分减少。退行期为其中毛发的生长期结束，并且毛发生成逐渐减慢，细胞分裂和生长最终结束的阶段。退行期持续约1-1.5个月，并且总毛发的约1%属于这一阶段。休止期为生长的最后阶段，其中毛囊和真皮毛乳头完全分离，且毛囊萎缩，并且毛囊进一步向上移动，导致毛发脱落。休止期持续约3-4个月，并且总毛发的4-14%属于此阶段。随着休止期结束和真皮毛乳头再次活跃，新毛发的真皮毛乳头形成，并且处于休止期的毛发被推出且完全脱离头皮。

由于常规脱发治疗剂或用于毛发生长的组合物的功效尚未得到充分验证或伴有各种副作用，因此迫切需要开发更安全和更有效的脱发治疗剂或毛发生长剂。

发明公开

技术问题

已设想本发明以解决包括上述问题在内的各种问题，并且本发明的目的为提供更有效且廉价的乳源外泌体在各种化妆品(比如用于皮肤再生的功能性化妆品组合物)、食品和药物方面的新用途。然而，本发明的范围不限于以上目的。

技术解决方案

根据本发明的一个方面，提供用于皮肤再生的化妆品组合物，其包括作为活性成分的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体。

根据本发明的另一方面，提供用于皱纹减少的化妆品组合物，其包括作为活性成分的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体。

根据本发明的另一方面，提供用于皮肤美白的化妆品组合物，其包括作为活性成分的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体。

根据本发明的另一方面，提供用于减轻和预防脱发的用于毛发的功能性化妆品，其包括作为活性成分的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体。

根据本发明的另一方面，提供功能性保健食品，其包括作为活性成分的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体。

根据本发明的另一方面，提供用于伤口治疗的药用组合物，其包括作为活性成分的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体。

根据本发明的另一方面，提供用于治疗脱发或生发或促进毛发生长的药用组合物，其包括作为活性成分的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体。

根据本发明的另一方面，提供加速受试者的受伤皮肤再生的方法，该方法包括将治疗有效量的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体应用于受试者的受伤皮肤。

根据本发明的一个方面，提供增强受试者免疫的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体。

根据本发明的一个方面，提供预防或治疗受试者脱发的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体。

根据本发明的另一方面，减少受试者皮肤皱纹的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体。

根据本发明的另一方面，美白受试者皮肤的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体。

根据本发明的另一方面，提供从牛奶或山羊奶中分离的外泌体在制备伤口愈合剂中的用途。

根据本发明的另一方面，提供从牛奶或山羊奶中分离的外泌体在制备用于减少皮肤皱纹的化妆品中的用途。

根据本发明的另一方面，提供从牛奶或山羊奶中分离的外泌体在制备用于美白的化妆品中的用途。

根据本发明的另一方面，提供从牛奶或山羊奶中分离的外泌体在制备用于预防和治疗脱发的药剂中的用途。

根据本发明的另一方面，提供从牛奶或山羊奶中分离的外泌体在制备毛发生长剂中的用途。

根据本发明的另一方面，提供从牛奶或山羊奶中分离的外泌体用于提高免疫的组合物的用途。

根据本发明的另一方面，提供从牛奶或山羊奶中分离外泌体的方法，该方法包括：第一离心步骤，通过离心从牛奶或山羊奶中去除脂肪和细胞；过滤器过滤步骤，用具有20-60 µm的筛孔尺寸的滤器过滤离心的牛奶或山羊奶，以进一步从中去除脂肪和细胞；稀释步骤，通过向其中添加等体积的蒸馏水来稀释过滤的牛奶或山羊奶；等电沉淀步骤，向稀释的牛奶或山羊奶中添加酸以将pH调至4-5，从而沉淀牛奶或山羊奶中的酪蛋白；二次离心步骤，对其中酪蛋白已经沉淀的牛奶或山羊奶进行另外离心，并从中收集上清液；以及过滤步骤，通过0.2 µm的过滤器过滤收集的上清液。

有利效果

根据本发明实例的用于皮肤再生的化妆品组合物不仅具有比从细胞培养基中分离的普通外泌体显著更高的皮肤再生效果，而且还具有低生产成本、显著高产量和高材料稳定性，从而可极为经济地进行生产。然而，本发明的范围不限于上述效果。

附图简述

图1为示意性显示根据本发明实例从牛奶或初乳中分离外泌体的过程的流程图。

图2为显示根据本发明实例分离的商业牛奶和初乳来源的外泌体以及作为对照组从HEK293细胞中分离的外泌体的产量的图表。

图3为一系列照片，显示根据本发明实例分离的商业牛奶和初乳来源的外泌体以及作为对照组从HEK293细胞中分离的外泌体的外泌体表面标志物的Western印迹分析结果。

图4展示显示根据本发明实例分离的牛奶来源的外泌体(A和B)、作为对照组的从HEK293细胞分离的外泌体(C和D)的粒度的动态光散射分析结果的直方图(A和C)和通过透射电子显微镜捕获的外泌体的照片(B和D)。

图5为通过透射电子显微镜捕获的根据本发明实例分离的牛奶来源的外泌体(上)和作为对照组的HEK293来源的外泌体(下)在两次冷冻/解冻循环前后的形状的一系列照片。照片中的红色方框表示右侧的放大区域。

图6为一系列直方图，显示根据本发明实例分离的牛奶来源的外泌体(A)和作为对照组的HEK293来源的外泌体(B)在两次冷冻/解冻循环前后粒度分布的动态光散射分析结果。

图7a为一系列图表，其显示确认冷冻和解冻前后根据本发明实施方案的初乳来源的外泌体(右下)、HaCat细胞来源的外泌体(HaCat Exo，左上)和B16黑色素细胞来源的外泌体(B16 Exo，右上)以及作为对照外泌体的人类真皮成纤维细胞来源的外泌体(HDF Exo，左下)的平均粒度的动态散射分析结果，动态散射分析的结果确认冷冻和解冻前后的粒度分布；图7b为根据本发明实施方案的初乳来源的外泌体在冷冻保存前(上)和解冻并重悬后(下)由透射电子显微镜所拍摄的一系列照片；和图7c是在免疫荧光染色后拍摄的一系列照片，用于分析用根据本发明实施方案的初乳来源外泌体处理的人类真皮成纤维细胞中I型胶原蛋白的表达水平。左侧的盐水表示仅用生理盐水处理而没有外泌体处理的对照组。

图8为表示分析初乳来源的外泌体(Col M-Exo)和各种对照外泌体(HaCat Exo、B16 Exo和HDF Exo)在重复冷冻/解冻五次后的平均粒度的结果的图。

图9为显示根据本发明实例分离的牛奶来源的外泌体当给予时被吸收到人类真皮成纤维细胞内的荧光显微术图像(右)。左图属于作为对照组的PBS治疗组。蓝色表示用于核复染的DAPI荧光信号。

图10为表示用根据本发明实施方案的初乳来源外泌体分别以0.1 mg/ml和0.3mg/ml的浓度处理人类真皮成纤维细胞(HDF)后测量凋亡程度结果的直方图。

图11a展示一系列荧光显微术图像，显示在经UV辐射损伤的人类真皮成纤维细胞中形成活性氧的水平上，在用本发明实例的商业牛奶来源的外泌体(Comm M-exo)和初乳外泌体(Col M-exo)处理之后，经DCF-DA捕获荧光强度的图像得出的分析结果，所述DCF-DA通过与活性氧反应表达荧光。图11b为显示图11a中鉴定的量化的相对荧光强度的图表。

图12a显示分别用根据本发明实例分离的源于商业牛奶和初乳的外泌体处理之后测量的人类角质形成细胞(HaCaT)的细胞增殖率的图表。图12b展示一系列图表，其显示分别用根据本发明实例分离的源于商业牛奶和初乳的外泌体处理之后测量的人类真皮成纤维细胞(HDF)的细胞增殖率。对照组表示仅用PBS缓冲液处理的细胞的增殖程度，并且增殖率代表当对照组的增殖率设为100%时的相对百分比。

图13展示一系列图像(A和C)，其显示在将根据本发明实例分离的商业牛奶和初乳来源的外泌体给予划伤诱导的人类角质形成细胞(HaCaT，A和B)和人类真皮成纤维细胞(HDF，C和D)之后观察到的细胞迁移程度，以及一系列图表(B和D)，其显示根据A和C的结果量化的细胞迁移程度。

图14展示(a) 一系列由显微镜捕获的图像，其显示在用本发明实例的商业牛奶来源的外泌体(Comm M-exo)和初乳外泌体(Col M-exo)处理之后，在基质胶中三维培养的鼠内皮细胞(SVEC4-10)中管形成的程度，以及显示(b) 在(a)中观察到的分支点的数量和(c)形成的管长度的一系列图表。

图15a展示通过全身体内荧光成像捕获的一系列图像，其显示标记有荧光材料(Flamma 675)并皮下注射的本发明实例的初乳外泌体的体内分布。图15b为通过体内成像系统捕获的照片，其显示在外泌体注射的第二天处死实验动物并收获主要器官之后器官中的荧光分布。图15c为图15b的量化结果的图表。

图16展示了显示在将本发明实例的商业牛奶来源的外泌体(Comm M-exo)和初乳外泌体(Col M-exo)应用于创伤模型小鼠的伤口部位之后随着时间的推移记录的伤口愈合程度的图表(上)，以及直接捕获的伤口部位的一系列照片。对于对照组，使用仅给予生理盐水(盐水)和从血清中获得的外泌体(Serum Exo)的组，并将初乳外泌体组分为第1、4和7天给予的组(Col M-Exo)和第4、7和10天给予的组(Col M-Exo-D4)。

图17为一系列照片，其显示在处死图16的实验动物之后，对切除自伤口部位的组织切片进行的使用抗弹性蛋白抗体的免疫组织化学测定的结果。

图18a为一系列荧光显微照片，其显示在用根据发明实例的商业牛奶来源的外泌体(Com M-exo)和初乳外泌体(Col M-exo)处理之后，通过免疫荧光测定分析的人类真皮成纤维细胞(HDF)中1型胶原蛋白的表达水平。图18b为显示在用根据本发明实例的商业牛奶来源的外泌体(Com M-exo)和初乳外泌体(Col M-exo)处理之后，通过Western印迹分析的人类真皮成纤维细胞(HDF)中基质金属蛋白酶-2 (MMP-2)的表达水平的图表。对照组为盐水治疗组(盐水)和HDF来源的外泌体治疗组。

图19展示(a) 在处理之后24小时从用UV辐射处理或未处理、用各种浓度本发明实例的初乳外泌体(Col M-exo)处理的黑色素瘤细胞中提取的黑色素的一系列照片，(b) 显示每10x6个细胞的黑色素量的测量结果的图表，和(c) 显示用本发明实例的商业牛奶来源的外泌体(Comm M-exo)和初乳外泌体(Col M-exo)处理的组和对照组(盐水，B16来源的外泌体处理(B16-exo))之间黑色素含量的比较结果的图表。

图20展示(a) 显示在用本发明实例的商业牛奶来源的外泌体(Comm M-exo)和初乳外泌体(Col M-exo)处理的骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)中，在处理之后24小时通过斑点印迹测定分析的各种细胞因子表达水平的照片，和(b) 显示其量化结果的图表。

图21展示(a) 比较分别用商业牛奶来源的外泌体(Comm M-exo)和初乳外泌体(Col M-exo)处理的NIH-3T3成纤维细胞中参与组织再生和血管生成的各种生长因子表达水平的斑点印迹测定结果，和(b) 显示斑点印迹测定的量化结果的图表。

图22a展示一系列荧光显微图像，其显示在用根据本发明实例的商业牛奶来源的外泌体(Comm M-exo)处理的人类真皮毛乳头细胞中不同处理持续时间下外泌体细胞内摄取模式的观察结果。图22B展示了显示在用根据本发明实例的初乳外泌体处理的人类真皮毛乳头细胞中不同初乳外泌体处理浓度下初乳外泌体对真皮毛乳头细胞增殖的影响的图表(左)，以及显示对用或不用脱发诱导物质处理的人类真皮毛乳头细胞增殖程度差异的分析结果的图表(右)。图22C展示一系列照片，其显示在通过经透皮给予来给予剃毛的试验动物根据本发明实例的商业牛奶来源的外泌体(Comm M-exo)之后随着时间的推移毛发生长程度的观察结果。

用于实施本发明的方式

术语的定义

本文使用的术语定义如下。

本文使用的术语“外泌体”是指可能存在于包括血液、尿液和细胞培养基在内的所有类型生物流体中的纳米级细胞衍生囊泡。已知外泌体的大小在30 nm-100 nm之间，并且从细胞中由多囊泡体与质膜融合而分泌，或者直接通过质膜分泌。已知外泌体在各种过程比如凝血、细胞间信号转导和代谢物管理中发挥重要作用。在这种背景下，本文使用的术语“乳源外泌体”是指源于哺乳动物乳汁(比如商业牛奶和初乳)的外泌体。同样，术语“初乳外泌体”是指源于幼崽出生之后立即由母亲产生的乳汁的乳源外泌体。

如本文所使用的术语“乳汁”主要是指牛奶，但包括来自诸如马、绵羊、奶山羊(山羊)和骆驼等其他哺乳动物的乳汁作为功能等效物。考虑到收购可用性、成本等因素，商业牛奶为最优选的，并且产自奶山羊(山羊)的商业“山羊奶”可为极好的替代品。特别是，山羊奶的组成与母乳相似，并且因此易于消化，且具有高营养价值，并且因此被认为是优质乳源。马奶(马奶)尽管不常见，但被中亚游牧部落用作牛奶替代品。同时，“初乳”为在怀孕后期和出生之后几天期间产生的乳汁形式。与普通乳汁不同，初乳含有更多生存和生长所需的营养素和抗体，而且与普通乳汁相比较含有更高量的抗氧化物质，比如乳铁蛋白和血红素结合蛋白，并且因此有时在健康改善和营养方面更为优选。

如本文所使用的术语“原料奶”是指从未经历任何特定处理(比如灭菌)的牧场收集的牛奶，而如本文所使用的术语“商业牛奶”是指通过灭菌过程和均质过程以市售形式包装的牛奶。

如本文所使用的术语“皮肤再生”是指皮肤再生周期的过程，或者其中在伤口的情况下，细胞在基底层中形成，从而恢复皮肤的过程。在基底层形成的表皮细胞逐渐被推至更上层并到达角质层。此过程被称为皮肤再生周期或皮肤更新过程。通常，皮肤更新过程被认为平均花费28天，包括其中细胞在基底层形成并向上移动的14天时间段，以及其中遗留在角质层上的细胞死亡和脱落的另一个14天时间段。由于再生和脱落的过程随着年龄的增长而花费更长时间，因此皮肤更新周期可能花费长达42天，并且已知皮肤更新周期一般地在30岁之后变得更长。为此，皮肤随着年龄的增长而变得暗淡粗糙，也就是说，皮肤开始老化。

发明详述

根据本发明的一个方面，提供用于皮肤再生的化妆品组合物，该组合物包括作为活性成分从牛奶或山羊奶中分离的外泌体。

在用于皮肤再生的化妆品组合物中，牛奶或山羊奶可为原料奶，商业牛奶或山羊奶或者初乳。

根据本发明的另一方面，提供用于皱纹减少的化妆品组合物，该组合物包括作为活性成分从牛奶或山羊奶中分离的外泌体。

在用于皱纹减少的化妆品组合物中，牛奶或山羊奶可为原料奶，商业牛奶或山羊奶或者初乳。

根据本发明的另一方面，提供用于皮肤美白的化妆品组合物，该组合物包括作为活性成分的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体。

在用于皮肤美白的化妆品组合物中，牛奶或山羊奶可为原料奶，商业牛奶或山羊奶或者初乳。

根据本发明一个方面的化妆品组合物可被用于各种产品，比如功能性化妆品、清洁剂、洗发水等中。可向其添加本组合物的产品的实例包括各种类型的化妆品，比如爽肤水、护肤液、乳霜、精华、营养液、化妆品溶液和面膜，而且还包括肥皂、洗发水、护发产品、清洁剂、身体清洁剂、洗面奶、头发修护剂和美容液。

本发明的化妆品组合物可进一步包括选自水溶性维生素、脂溶性维生素、聚合物肽、多糖、鞘脂和藻类提取物的另外的功能性组分。

水溶性维生素可为能在化妆品中掺混的任何维生素，但可优选地为维生素B1、维生素B2、维生素B6、吡哆醇、盐酸吡哆醇、维生素B12、泛酸、烟酸、烟酰胺、叶酸、维生素C、维生素H等，并且上述组分的盐(盐酸硫胺素、抗坏血酸钠等)或其衍生物(抗坏血酸-2-磷酸酯钠、抗坏血酸-2-磷酸酯镁等)也包括在本发明中可用的水溶性维生素中。水溶性维生素可通过已知方法比如微生物转化法、化学合成法、酶法或从微生物培养物的纯化法等获得。

脂溶性维生素可为能在化妆品中掺混的任何维生素，但可优选地为维生素A、胡萝卜素、维生素D2、维生素D3、维生素E(d1-α-生育酚、d-α-生育酚、d-δ-生育酚)等，并且上述组分的衍生物(抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸硬脂酸酯、抗坏血酸二棕榈酸酯、dl-α-生育酚乙酸酯、dl-α-生育酚烟酸酯、维生素E、DL-泛醇、D-泛醇、泛酸醇乙基醚等)也包括在本发明中可用的油溶性维生素中。

脂溶性维生素可通过已知方法比如微生物转化法、化学合成法、酶法或纯化法从微生物培养物获得。

聚合物肽可为能在化妆品中掺混的任何聚合物肽，但可优选地为胶原蛋白、水解胶原蛋白、明胶、弹性蛋白、水解弹性蛋白、角蛋白等。聚合物肽可通过已知方法比如化学合成法、酶法或纯化法从微生物培养基中获得，或者可从天然产物比如猪、牛等的皮肤和蚕的蚕丝蛋白中纯化并且使用。

多糖可为能在化妆品中掺混的任何多糖，但可优选地为羟乙基纤维素、黄原胶、透明质酸钠、硫酸软骨素或其盐(钠盐等)。例如，硫酸软骨素或其盐等可从已知哺乳动物或鱼类中纯化并使用。

鞘脂可为能在化妆品中掺混的任何鞘脂，但可优选地为神经酰胺、植物鞘氨醇、鞘糖脂等。鞘脂可通过已知方法从哺乳动物、鱼类、贝类、酵母或植物等中纯化，或者可通过化学合成法获得。

藻类提取物可为能在化妆品中掺混的任何藻类提取物，但可优选地为褐藻提取物、红藻提取物、绿藻提取物等，并且从上述藻类提取物中纯化的卡拉胶、海藻酸、海藻酸钠、海藻酸钾等也包括在本发明中使用的藻类提取物中。藻类提取物可通过已知方法经纯化从藻类中获得。

在本发明的化妆品材料中，通常在化妆品材料中掺混的其他成分可与上述基本成分掺混在一起。

可添加的其他成分包括油脂成分、保湿剂、润肤剂、表面活性剂、有机和无机颜料、有机颗粒、UV吸收剂、防腐剂、消毒剂、抗氧化剂、植物提取物、pH调节剂、酒精、颜料、香料、血液循环促进剂、冷却剂、止汗剂、纯化水等。

油脂成分可包括酯基油脂、烃基油脂、硅酮基油脂、氟基油脂、动物油脂、植物油脂等。酯基油脂可包括以下酯类，比如：甘油基三(2-乙基己酸)酯、鲸蜡基2-乙基己酸酯、肉豆蔻酸异丙酯、肉豆蔻酸丁酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸乙酯、棕榈酸辛酯、异硬脂酸异鲸蜡酯、硬脂酸丁酯、亚油酸乙酯、亚油酸异丙酯、油酸乙酯、肉豆蔻酸异鲸蜡酯、肉豆蔻酸异硬脂酯、棕榈酸异硬脂酯、肉豆蔻酸辛基十二烷基酯、异硬脂酸异鲸蜡酯、癸二酸二乙酯、己二酸二异丙酯、异烷基新戊酸酯、三(癸酰、癸酸)甘油酯、三羟甲基丙烷三(2-乙基己酸)酯、三羟甲基丙烷三异硬脂酯、四(2-乙基己酸)季戊四醇酯、辛酸鲸蜡酯、月桂酸癸酯、月桂酸己酯、肉豆蔻酸癸酯、肉豆蔻酸肉豆蔻酯、肉豆蔻酸鲸蜡酯、硬脂酸硬脂酯、油酸癸酯、蓖麻油酸鲸蜡酯、月桂酸异硬脂酯、肉豆蔻酸异十三烷基酯、棕榈酸异鲸蜡酯、硬脂酸辛酯、硬脂酸异鲸蜡酯、油酸异癸酯、油酸辛基十二烷基酯、亚油酸辛基十二烷基酯、异硬脂酸异丙酯、2-乙基己酸鲸蜡硬脂酯、2-乙基己酸硬脂酯、异硬脂酸己酯、乙二醇二辛酸酯、乙二醇二油酸酯、丙二醇二癸酸酯、二(癸酰癸酸)丙二醇酯、丙二醇二辛酸酯、新戊二醇二辛酸酯(neopentylglycol dicaprylate)、新戊二醇二辛酸酯(neopentyl glycol dioctanoate)、三辛酸甘油酯、三-十一烷酸甘油酯、三异棕榈酸甘油酯、三异硬脂酸甘油酯、新戊酸辛基十二烷基酯、辛酸异硬脂酯、异壬酸辛酯、新癸酸己基癸酯、新癸酸辛基十二烷基酯、异硬脂酸异鲸蜡酯、异硬脂酸异硬脂酯、异硬脂酸辛基十二烷基酯、聚甘油油酸酯、聚甘油异硬脂酸酯、三异鲸蜡基柠檬酸酯、三异烷基柠檬酸酯、三异辛基柠檬酸酯、乳酸月桂酯、乳酸肉豆蔻酯、乳酸鲸蜡酯、乳酸辛基十二烷基酯、柠檬酸三乙酯、乙酰柠檬酸三乙酯、乙酰柠檬酸三丁酯、柠檬酸三辛酯、苹果酸二异硬脂酯、羟基硬脂酸2-乙基己酯、琥珀酸二(2-乙基己)酯、己二酸二异丁酯、癸二酸二异丙酯、癸二酸二辛酯、硬脂酸胆固醇酯、异硬脂酸胆固醇酯、羟基硬脂酸胆固醇酯、油酸胆固醇酯、二氢胆固醇油酸酯、植物甾醇异硬脂酸酯、植物甾醇油酸酯、12-硬脂酰羟基硬脂酸异鲸蜡酯、12-硬脂酰羟基硬脂酸硬脂酯、12-硬脂酰羟基硬脂酸异硬脂酯等。

烃基油脂可包括以下烃基油脂，比如：角鲨烯、液体石蜡、α-烯烃低聚物、异石蜡、地蜡、石蜡、液体异石蜡、聚丁烯、微晶蜡、凡士林等。

硅酮基油脂可包括聚甲基硅酮、甲基苯基硅酮、甲基环聚硅氧烷、八甲基聚硅氧烷、十甲基聚硅氧烷、十二甲基环硅氧烷、二甲基硅氧烷/甲基鲸蜡氧基硅氧烷共聚物、二甲基硅氧烷/甲基硬脂氧基硅氧烷共聚物、烷基改性硅酮油、氨基改性硅酮油等。

氟基油脂可包括全氟聚醚等。

动植物脂肪和油类可包括以下动植物脂肪和油类，比如：鳄梨油、杏仁油(almondoil)、橄榄油、芝麻油、米糠油、藏红花油、大豆油、玉米油、菜籽油、杏仁油(apricot kerneloil)、棕榈仁油、棕榈油、蓖麻油、葵花油、葡萄籽油、棉籽油、棕榈油、库奎坚果油、小麦胚芽油、大米胚芽油、乳木果油、月见草油、澳洲坚果油、白池花籽油、蛋黄油、兽脂、马油、貂油、胸棘鲷油、荷荷巴油、分支烛台蜡(candelabra wax)、巴西棕榈蜡、液体羊毛脂和氢化蓖麻油。

保湿剂可包括水溶性低分子量保湿剂、脂溶性分子保湿剂、水溶性聚合物、脂溶性聚合物等。

水溶性低分子量保湿剂可包括丝氨酸、谷氨酰胺、山梨醇、甘露醇、吡咯烷酮羧酸钠、甘油、丙二醇、1,3-丁二醇、乙二醇、聚乙二醇(聚合度n=2或更高)、聚丙二醇(聚合度n =2或更高)、聚甘油(聚合度n = 2或更高)、乳酸、乳酸盐等。

脂溶性低分子量保湿剂可包括胆固醇、胆固醇酯等。

水溶性聚合物可包括羧基乙烯基聚合物、聚天冬氨酸、黄蓍胶、黄原胶、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、水溶性甲壳质、壳聚糖、糊精等。脂溶性聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮/二十碳烯共聚物、聚乙烯吡咯烷酮/十六碳烯共聚物、硝基纤维素、糊精脂肪酸酯、高分子量硅酮等。

润肤剂可包括长链酰基谷氨酸胆固醇酯、羟基硬脂酸胆固醇酯、12-羟基硬脂酸、硬脂酸、松香酸、羊毛脂脂肪酸胆固醇酯等。

表面活性剂可包括非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂等。

非离子表面活性剂可包括自乳化单硬脂酸甘油酯、丙二醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、失水山梨醇脂肪酸酯、POE (聚氧乙烯)失水山梨醇脂肪酸酯、POE山梨醇脂肪酸酯、POE甘油脂肪酸酯、POE烷基醚、POE脂肪酸酯、POE氢化蓖麻油、POE蓖麻油、POE/POP (聚氧乙烯/聚氧丙烯)共聚物、POE/POP烷基醚、聚醚改性硅酮、月桂酸烷醇酰胺、烷基氧化胺、氢化大豆磷脂等。

阴离子表面活性剂可包括脂肪酸肥皂、α-酰基磺酸盐、烷基磺酸盐、烷基烯丙基磺酸盐、烷基萘磺酸盐、烷基硫酸盐、POE烷基醚硫酸盐、烷基酰胺硫酸盐、烷基磷酸盐、POE烷基磷酸盐、烷基酰胺磷酸盐、烷酰基烷基牛磺酸盐、N-酰基氨基酸盐、POE烷基醚羧酸盐、烷基磺基琥珀酸盐、烷基磺基乙酸钠、酰化水解胶原蛋白肽盐、全氟烷基磷酸酯等。

阳离子表面活性剂可包括烷基三甲基氯化铵、硬脂基三甲基氯化铵、硬脂基三甲基溴化铵、鲸蜡硬脂基三甲基氯化铵、二硬脂基二甲基氯化铵、硬脂基二甲基苄基氯化铵、山嵛基三甲基溴化铵、苯扎氯铵、二乙基氨基乙基酰胺硬脂酸盐、二甲基氨基丙基酰胺硬脂酸盐、羊毛脂衍生物、季铵盐等。

两性表面活性剂可包括羧基甜菜碱型、酰胺甜菜碱型、磺基甜菜碱型、羟基磺基甜菜碱型、酰胺磺基甜菜碱型、磷酸甜菜碱型、氨基羧酸盐型、咪唑啉衍生物型、酰胺-胺型等。

有机和无机颜料可包括无机颜料，比如硅酸、硅酸酐、硅酸镁、滑石、绢云母、云母、高岭土、三氧化二铁、粘土、膨润土、覆钛云母、氯氧化铋、氧化锆、氧化镁、氧化锌、钛氧化物、氧化铝、硫酸钙、硫酸钡、硫酸镁、碳酸钙、碳酸镁、氧化铁、群青蓝、氧化铬、氢氧化铬、炉甘石、炭黑及其复合物；和有机颜料，比如聚酰胺、聚酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氨酯、乙烯基树脂、尿素树脂、酚醛树脂、氟树脂、硅树脂、丙烯酸树脂、三聚氰胺树脂、环氧树脂、聚碳酸酯树脂、二乙烯基苯-苯乙烯共聚物、丝粉、纤维素、CI颜料黄、CI颜料橙等；以及此类无机颜料和有机颜料的复合颜料等等。

有机颗粒可包括金属皂，比如硬脂酸钙；烷基磷酸盐金属盐，比如鲸蜡酸钠、月桂酸锌和月桂酸钙；酰基氨基酸多价金属盐，比如N-月桂酰-β-丙氨酸钙、N-月桂酰-β-丙氨酸锌和N-月桂酰甘氨酸钙；酰胺磺酸多价金属盐，比如L-月桂酰牛磺酸钙和N-棕榈酰牛磺酸钙；N-酰基碱性氨基酸，比如Nε-月桂酰-L-赖氨酸、Nε-棕榈酰四肽(palmitoylizine)、Nα-paritoylolnithine、Nα-月桂酰精氨酸和Nα-氢化牛肉脂肪酸酰基精氨酸；N-酰基多肽，比如N-月桂酰甘氨酰甘氨酸；α-氨基脂肪酸，比如α-氨基辛酸和α-氨基月桂酸；以及聚乙烯、聚丙烯、尼龙、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、二乙烯基苯-苯乙烯共聚物、四氟乙烯等。

UV吸收剂可包括对氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸乙酯、对氨基苯甲酸戊酯、对氨基苯甲酸辛酯、乙二醇水杨酸酯、水杨酸苯酯、水杨酸辛酯、水杨酸苄酯、水杨酸丁基苯酯、水杨酸高孟酯、肉桂酸苄酯、对甲氧基肉桂酸2-乙氧基乙酯、对甲氧基肉桂酸辛酯、单-2-乙基己烷甘油基二对甲氧基肉桂酸酯、甘油基、异丙基对甲氧基肉桂酸酯、二异丙基-二异丙基肉桂酸酯混合物、尿刊酸、尿刊酸乙酯、羟基甲氧基二苯甲酮、羟基甲氧基二苯甲酮磺酸及其盐、二羟基甲氧基二苯甲酮、二羟基甲氧基二苯甲酮二磺酸钠、二羟基二苯甲酮、四羟基二苯甲酮、4-叔丁基-4’-甲氧基二苯甲酰甲烷、2,4,6-三苯胺基-对-(羰-2’-乙基己基-1’-氧基)-1,3,5-三嗪、2-(2-羟基-5-甲基苯基)苯并三唑等。

消毒剂可包括扁柏酚、三氯生、三氯羟基二苯醚、葡萄糖酸氯己定、苯氧乙醇、间苯二酚、异丙基甲苯酚、薁、水杨酸、吡啶硫酮锌、苯扎氯铵、301号光敏剂、单硝基愈创木酚钠、十一烯酸等。

抗氧化剂可包括丁基羟基茴香醚、没食子酸丙酯、异抗坏血酸(elisorbic acid)等。

pH调节剂可包括柠檬酸、柠檬酸钠、苹果酸、苹果酸钠、富马酸、富马酸钠、琥珀酸、琥珀酸钠、氢氧化钠、磷酸氢二钠等。

醇可包括高级醇，比如鲸蜡醇。

另外，可添加的成分不限于以上。此外，可在不对本发明的目的和效果产生不利影响的范围内添加任何上述成分，但可相对于总重量优选地以0.01-5 wt%的量添加，更优选地以0.01-3 wt%的量添加。

本发明的化妆品材料可采取溶液、乳液、粘性混合物等形式。

化妆品材料形式的实例不受特别限制，但可包括乳液、护肤霜、化妆水、面膜、粉底、护肤液、美容液、发用化妆品材料、肥皂等。

本发明化妆品材料的具体实例可包括洁面霜、洁面泡沫、清洁霜、清洁乳、洁面乳、按摩霜、冷霜、保湿霜、乳液、化妆水、涂抹式面膜(facial pack)、剃须后用霜(after-shaving cream)、防晒霜、晒黑油、肥皂、沐浴露、洗发水、护发素(hair rinse)、头发修护剂(hair treatment)、护发精(hair conditioner)、头发生长材料、发乳、整发液(hairliquid)、头发定型液、发胶、桥型染发剂(hair bridge)、染发剂(color rinse)、彩喷(color spray)、烫发液(permanent wave solution)、粉饼、散粉、眼影、护手霜、口红等。

本发明的化妆品组合物可根据已知方法，例如公开于Matsumoto Michio编辑的「Manual for Percutaneous Application Preparation Development」第1版(由SeishiShoin于1985年出版)等的方法，通过制备选自以下的成分而得到：水溶性维生素、脂溶性维生素、聚合物肽、多糖、鞘脂和藻类提取物(除上述成分以外，可根据需要添加的其他成分)以及作为本发明活性成分的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体。

根据本发明的另一方面，提供用于减轻和预防脱发的用于头发的功能性化妆品，其包括作为活性成分的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体。

根据本发明一个方面的用于减轻和预防脱发的用于头发的功能性化妆品可作为洗发水配方提供，或者可作为局部配方(比如用于头皮应用的软膏剂、乳膏剂和凝胶剂)提供。

根据本发明的另一方面，提供功能性保健食品，其包括作为活性成分的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体。

功能性保健食品的健康相关功能可为(但不限于)减轻皮肤过敏性、改善免疫功能、改善肠道健康、改善皮肤健康、调节血糖水平、抗氧化功能或改善肝脏健康。

根据本发明一个方面的功能性保健食品的类型不受特别限制。功能性保健食品的类型非限制性地可为以下任何一种：乳制品、甜食制品、调味品、饮料和饮品、零食、糖果、冰淇淋和冷冻甜点、早餐谷物、营养棒、零食条状巧克力制品、加工食品、谷物制品和意式面食、汤、调味汁和调料、甜食制品、油脂制品、含乳饮料和乳饮料、豆乳类制品、冷冻食品、烹调和替代性食品、肉类制品、干酪、酸奶、面包、面包卷、酵母制品、蛋糕、曲奇饼和薄脆饼干。此外，所有一般意义上被视为功能性食品的项目都包括在内。

根据本发明一个方面的功能性保健食品可被配制为并用作胶囊剂、片剂、粉剂、液体混悬剂、丸剂、颗粒剂等。此类配方为将功能性保健食品按原样或者通过适当的方法与赋形剂、粘合剂、崩解剂等均匀混合成颗粒并使颗粒尽可能均匀而形成。进一步地，可根据需要添加矫味剂、苦味剂等。当功能性保健食品为呈饮料制剂的功能性保健食品时，功能性保健食品可含有各种矫味剂或天然碳水化合物等作为附加成分，就像普通饮料一样。天然碳水化合物的实例包括单糖(比如葡萄糖和果糖)、二糖(比如麦芽糖和蔗糖)、多糖(比如糊精和环糊精)以及糖醇(比如木糖醇、山梨醇和赤藓糖醇)。对于甜味剂，可使用天然甜味剂(比如奇异果甜蛋白和甜菊糖苷提取物)或人工甜味剂(比如糖精和阿斯巴甜)。可添加功能性材料，比如鹿茸提取物、助于钙吸收和排便的低聚果糖、洋槐蜂蜜、作为天然防腐剂的复合黄芩提取物、作为抗沉降增稠剂的结冷胶等，但不限于此，可适当使用任何适合于功能性保健食品的功能性材料。

作为本发明功能性保健食品的活性成分的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体为极其安全的材料，因为来源(即牛奶或山羊奶)为已被人类长期用作食物来源的食品材料。因此，根据本发明实例的牛奶或初乳来源的外泌体可被用作各种保健功能中安全且极其有效的源材料。

根据本发明的另一方面，提供用于伤口治疗的药用组合物，该组合物包括作为活性成分的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体。

在药用组合物中，牛奶或山羊奶可为原料奶、商业牛奶或山羊奶或者初乳。

在本发明的药用组合物中，活性成分可以相对于组合物总重量0.1-100 wt%的量被包括在内。

本发明的组合物可进一步包括通常用于制备药用组合物的适当的载体、赋形剂和稀释剂。另外，在药用组合物的制备中，可使用用于配制的固体或液体添加剂。用于配制的添加剂可为有机和无机添加剂中的任何一种。

赋形剂的实例可包括乳糖、蔗糖(sucrose)、蔗糖(saccharose)、葡萄糖、玉米淀粉、淀粉、滑石、山梨糖醇、结晶纤维素、糊精、高岭土、碳酸钙、二氧化硅等。粘合剂的实例可包括聚乙烯醇、聚乙烯醚、乙基纤维素、甲基纤维素、阿拉伯橡胶、黄蓍胶、明胶、虫胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、柠檬酸钙、糊精、果胶等。润滑剂的实例可包括硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇、二氧化硅、氢化植物油等。可使用通常允许用于药物的任何着色剂。药用组合物的片剂和颗粒剂可根据需要通过糖包衣、明胶包衣等适当地进行包衣。另外，可根据需要添加防腐剂、抗氧化剂等。

本发明的药用组合物可以相应行业通常生产的任何配方制备(例如文献[Remington's Pharmaceutical Science,新版; Mack Publishing Company, EastonPA)，并且剂型形式不受特别限制，但可优选地为局部制剂。本发明的局部制剂可包括常见形式的局部制剂，比如片状制剂、液体局部制剂、喷雾制剂、乳液制剂、乳膏制剂、粉扑制剂、粉末制剂、渗透垫制剂、喷雾制剂、凝胶制剂(包括水凝胶)、糊状制剂、搽剂制剂、软膏制剂、气雾剂、粉末制剂、混悬制剂、透皮制剂等。文献[Remington’s Pharmaceutical Science,第15版, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042 (87章:Blaug, Seymour)中描述了这种配方，所述文献为所有制药和化学领域中通常已知的配方集。

作为本发明的实例，组合物可直接施用于伤口。也就是说，组合物可分布于伤口部位。当被施用于伤口部位时，片状形式的组合物用于适当地敷裹施用部位以保护伤口并防止活性成分的治疗效果降低。可使用市售或通常已知的任何辅料。市售辅料的实例可包括Compeel、Duoderm、Tagaderm和Opsite。

当本发明的药用组合物作为局部制剂提供时，药学上可接受的载体尽管根据药用组合物的配方而变化，但可包括烃类，比如凡士林、液体石蜡和胶凝烃类(被称为Plastibase)；动植物油类，比如中链脂肪酸甘油三酯、猪脂、硬脂和可可脂等；高级脂肪酸醇类、脂肪酸类及其酯，比如鲸蜡醇、硬脂醇、硬脂酸和棕榈酸异丙酯；水溶性碱类，比如聚乙二醇(macrogol) (聚乙二醇(polyethylene glycol))、1,3-丁二醇、甘油、明胶、蔗糖和糖醇；乳化剂，比如甘油脂肪酸酯、聚氧硬脂酸酯(polyoxylstearate)和聚氧乙烯氢化蓖麻油；粘着剂，比如丙烯酸酯和海藻酸钠；推进剂，比如液化石油气二氧化碳；以及防腐剂，比如对氧基苯甲酸酯类，并且本发明的局部制剂可利用上述组分中的任何一种，按照已知方法制造。除上述组分以外，还可根据需要在其中进一步掺混稳定剂、香料、着色剂、pH调节剂、稀释剂、表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂等。本发明的局部制剂可通过经已知方法施用于局部伤口部位来使用。

另外，本发明的局部制剂可粘附于固体支持物上使用，所述固体支持物比如有伤口剥离覆盖物的普通绷带。作为本发明的实例，首先用粘着层涂覆固体支持物，以增加液体介质对固体支持物的附着。粘着剂的实例可包括聚丙烯酸酯和氰基丙烯酸酯。

这种类型的配方在市场上广泛可用，实例包括：呈穿孔塑料膜形式的非胶粘伤口剥离覆盖物的绷带(Smith & Nephew Ltd.)、Johnson & Johnson的呈细条、贴片、斑点和塑料条形式的BAND-AID；Colgate-Palmolive Co. (Kendall)的Curity CURAD绷带；以及American WhiteCross Laboratories, Inc.的STIK-TITE弹性条等。

作为本发明的实例，根据本发明的药用组合物可通过以一定体积比将根据本发明实例的牛奶或山羊奶来源的外泌体与盐水混合而以液体局部制剂的形式进行配制。作为本发明的实例，根据本发明的药用组合物可通过将根据本发明实例的牛奶或山羊奶来源的外泌体与水溶性软膏基质混合并向其中添加盐水而以软膏剂形式配制。

根据本发明的另一方面，提供加速受试者的受伤皮肤再生的方法，该方法包括将治疗有效量的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体施用于受试者的受伤皮肤。

在该方法中，牛奶或山羊奶可为原料奶、商业牛奶或山羊奶或者初乳。

治疗有效量可根据患者伤口的类型、施用部位、治疗频率、治疗持续时间、剂型、患者状态、辅助类型等而变化。使用量不受特别限制，但当将细胞培养基施用于伤口时，本发明药用组合物的每日有效剂量可为1-50 µl/cm²，优选地为5-20 µl/cm²。

1天的剂量可每天给予一次，或者可以适当的间隔每天分两次或三次给予，或者可每隔几天间歇性给予。

给予步骤可通过口服给予、皮下给予、静脉内给予、肌内给予或鼻内给予进行，但优选的是静脉内给予或皮下给予，并且如果被配制为适当的皮肤施用型剂型，则直接施用于伤口部位也是可能的。

根据本发明的另一方面，提供增强受试者免疫的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体。

在该方法中，牛奶或山羊奶可为原料奶、商业牛奶或山羊奶或者初乳。

根据本发明的另一方面，提供预防或治疗受试者脱发的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体。

在该方法中，牛奶或山羊奶可为原料奶、商业牛奶或山羊奶或者初乳。

给予步骤可通过口服给予、皮下给予、静脉内给予、肌内给予或鼻内给予进行，但优选的是静脉内给予或皮下给予，并且如果被配制为适当的皮肤施用型剂型，则直接施用于伤口部位也是可能的。

根据本发明的另一方面，提供减少受试者皮肤皱纹的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体。

在该方法中，牛奶或山羊奶可为原料奶、商业牛奶或山羊奶或者初乳。

给予步骤可通过口服给予、皮下给予、静脉内给予、肌内给予或鼻内给予进行，但优选的是静脉内给予或皮下给予，并且如果被配制为适当的皮肤施用型剂型，则直接施用于伤口部位也是可能的。

根据本发明的另一方面，提供美白受试者皮肤的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体。

在该方法中，牛奶或山羊奶可为原料奶、商业牛奶或山羊奶或者初乳。

给予步骤可通过口服给予、皮下给予、静脉内给予、肌内给予或鼻内给予进行，但优选的是静脉内给予或皮下给予，并且如果被配制为适当的皮肤施用型剂型，则直接施用于伤口部位也是可能的。

根据本发明的另一方面，提供从牛奶或山羊奶中分离的外泌体用于制备伤口愈合剂的用途。

根据本发明的另一方面，提供从牛奶或山羊奶中分离的外泌体用于制备用于皱纹减少的化妆品的用途。

根据本发明的另一方面，提供从牛奶或山羊奶中分离的外泌体用于制备用于美白的化妆品的用途。

根据本发明的另一方面，提供从牛奶或山羊奶中分离的外泌体用于制备用于预防和治疗脱发的药剂的用途。

根据本发明的另一方面，提供从牛奶或山羊奶中分离的外泌体用于制备毛发生长促进·毛发生长剂的用途。

根据本发明的另一方面，提供从牛奶或山羊奶中分离的外泌体用于制备用于提高免疫的组合物的用途。

根据本发明的另一方面，提供从牛奶或山羊奶中分离外泌体的方法，该方法包括：第一离心步骤，离心牛奶或山羊奶以从中去除脂肪和细胞；滤器过滤步骤，用具有20-60 µm的筛孔尺寸的滤器过滤离心的牛奶或山羊奶，以进一步从中去除脂肪和细胞；稀释步骤，通过向其中添加等体积的蒸馏水来稀释过滤的牛奶或山羊奶；等电沉淀步骤，通过向其中添加酸而将稀释的牛奶或山羊奶调至pH 4-5，以沉淀牛奶或山羊奶中的酪蛋白；二次离心步骤，对其中酪蛋白已经沉淀的牛奶或山羊奶进行另外离心，并从中收集上清液；以及过滤步骤，通过0.2 µm的过滤器过滤收集的上清液。

在以上方法中，第一离心步骤可在4℃的温度条件下以4,000-6,000 xg实施20-40分钟，并且更优选地可在4℃的温度条件下以4,000-5,000 xg实施30分钟。

在以上方法中，滤器可为具有30-50 μm筛孔尺寸的滤器，更优选地可为具有35-45μm筛孔尺寸的滤器，并且最优选地可为具有40 μm筛孔尺寸的滤器。

在以上方法中，酸可为盐酸、硝酸、乙酸或硫酸，更优选地可为盐酸，并且最优选地可为6N盐酸。

在以上方法中，第二离心步骤可在室温下以4000-6000 xg实施15-30分钟，更优选地可在室温下以4500-5500 xg实施15-25分钟，并且最优选地可在室温下以5000 xg实施20分钟。

已知外泌体大量存在于牛奶中。此外，由于牛奶可充当能够以与干细胞相比较降低的成本来大量生产外泌体的外泌体生产平台，因此建立了用于从牛奶或初乳大量生产外泌体的方法(图1a)。此外，通过以上建立的方法，可以证实与从HEK293细胞中分离时相比较，当从牛奶中分离外泌体时，分离出外泌体的量明显更大(参见图2a)，并且特别是，发现了当使用初乳作为原料时，产生的外泌体具有转化为蛋白含量时为0.45-1.5 mg/ml的极高产量。可以看出，当与HEK293细胞的产量相比较，该值高达100倍或更高(参见图2)。此外，本发明人试图提高来自牛奶的外泌体产量，已开发了不利用超滤的更简单的方法(图1b)，并且还证实与常规超滤技术相比较，使用这种改进方法从牛奶中分离外泌体能够实现将产量显著提高400-1000倍或者更多(图2b)。同时，为证实通过以上方法制备的外泌体是否为正常外泌体，通过Western印迹分析来分析外泌体标志物CD8、CD63、CD81和TSG 101的表达，并通过动态散射分析来分析外泌体的粒度分布。作为结果，如图3中可见，外泌体标志物被鉴定为正常的，尽管略低于充当对照的HEK293来源的外泌体，并且如图4中可见，发现牛奶来源的外泌体为纳米级颗粒，平均粒径为68.05 nm，且粒度分布为30-100 nm。这是与对照外泌体相似的大小分布，并且从这一结果可以证实，外泌体可从牛奶中正常分离出来。

本发明人进行了稳定性分析，以研究从细胞培养基中分离的外泌体作为化妆品原料的效用。具体地讲，将从HEK293细胞(通常被用于生产重组外泌体的人类细胞系)中分离的外泌体冻干和解冻两次，并通过动态散射分析和透射电子显微镜检查其形状(参见图3和图4)。作为结果，发现源于HEK293细胞的外泌体在第二次冻干和解冻时，由于聚集而无法保持其初始形状。因此，可以证实，源于普通细胞系的外泌体以冻干原料的形式使用，并且为不适合用于预期稍后于室温下储存的化妆品组合物中的成分的原料。

在这种背景下，本发明人在从牛奶中分离的外泌体和源于其他细胞的外泌体的稳定性之间进行了比较分析。具体地讲，在冷冻保存前后，通过动态光散射在根据本发明实例的初乳来源的外泌体和源于其他细胞的外泌体(HaCat Exo、B16 Exo和HDF Exo)之间进行粒度分析。发现与对照外泌体不同，尽管进行冻干和解冻，但牛奶来源的外泌体仍保持其形状完整(图7a和7b)，以及将冷冻前后的初乳外泌体给予人类真皮成纤维细胞，并且作为结果，可证实诱导1型胶原蛋白表达的能力保持完整。这表明根据本发明实例的牛奶外泌体的生物活性尽管经过冷冻保存处理仍保持完整。

此外，尽管发现根据本发明实例的牛奶外泌体即使反复冷冻和解冻仍保持其大小，但发现其他细胞来源的外泌体的粒度随着冷冻和解冻循环次数的增加而增大，从而引起聚集或融合，表现出不稳定的外观(参见图8)。

此外，为证实从牛奶中分离的外泌体是否能够成功地递送至皮肤细胞，本发明人用荧光标记的牛奶来源的外泌体处理人类真皮成纤维细胞(HDF)，并通过荧光显微镜鉴定外泌体的位置(参见图9)。结果表明，本发明牛奶来源的外泌体良好地转移至真皮成纤维细胞的细胞质。

同时，为证实本发明实例的牛奶外泌体是否潜在地能够引起细胞毒性，本发明人以0.1 mg/ml和0.3 mg/ml的高浓度将牛奶外泌体给予人类真皮成纤维细胞，并且结果表明没有发生凋亡(参见图10)。

另外，为证实本发明实例的牛奶外泌体是否具有针对UV诱导的氧化细胞损伤的抑制活性，在通过UV光对人类真皮成纤维细胞诱导损伤之后，向其给予根据本发明实例的初乳外泌体以证实活性氧的形成。结果表明，与源于其他细胞的对照外泌体不同，根据本发明实例的初乳外泌体显著抑制UV诱导的活性氧的形成(图11a和11b)。

此外，本发明人研究了根据本发明实例分离的牛奶来源的外泌体是否具有皮肤再生能力。为此，用商业牛奶和初乳来源的外泌体处理人类角质形成细胞HaCaT细胞和人类真皮成纤维细胞(HDF)，以检查细胞增殖的程度(参见图6)。结果表明，与对照组(PBS处理)相比较，本发明牛奶来源的外泌体具有更好的细胞增殖效果。具体地讲，发现初乳来源的外泌体比商业牛奶来源的外泌体具有甚至更高的细胞增殖能力。此外，本发明人研究了对细胞迁移能力的影响，其为细胞再生能力的量度之一(参见图13)。结果表明，与对照相比较，当给予时，本发明牛奶来源的外泌体增加人类真皮成纤维细胞(HDF)以及人类角质形成细胞HaCaT细胞的细胞迁移，并且初乳来源的外泌体特别地表现出显著高的细胞迁移能力。

此外，为鉴定根据本发明实例的牛奶外泌体的各种用途，本发明人研究了以下内容：当在血管内皮细胞中处理时是否存在管形成(图14)；当体内给予时随着时间推移的体内分布模式分析(图15a-15c)；在给予实际创伤模型动物中人工引入的伤口时伤口愈合能力的比较(图16)；对伤口部位进行处理时弹性蛋白表达的分析(图17)；当在人类真皮成纤维细胞中处理时，经诱导I型胶原蛋白表达和抑制MMP-2表达的皮肤皱纹减少效果(图18a和18b)；经抑制黑色素瘤细胞中黑色素合成的皮肤美白效果(图19)；以及通过在骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)中处理时诱导与免疫激活相关的细胞因子表达的能力(图20)、在成纤维细胞中处理时诱导与炎症相关的生长因子表达的能力(图21)、摄取到人类真皮毛乳头细胞中(图22a)、正常和脱发诱导条件下人类真皮毛乳头细胞的增殖能力(图22b)及动物实验中对毛发生长促进和毛发生长的分析(图22c)而对脱发的治疗效果。作为结果，可以证实，根据本发明实施例的牛奶外泌体为表现出诸如伤口愈合、皱纹减少、美白效果、免疫增强效果、脱发预防效果等各种生物活性的物质。

根据该结果，本发明人能够证实，根据本发明实例的牛奶来源的外泌体可非常有效地用于各种各样的目的，包括皮肤再生和伤口愈合，并且还可用于生产功能性化妆品，比如美白和皱纹减少、脱发治疗和免疫增强。

实施本发明的模式

在下文中，将通过实施例和试验实施例更详细地描述本发明。然而，本发明不限于以下公开的实施例和试验实施例，而是可以各种不同的形式实施，并且提供以下实施例和试验实施例以使本发明的公开完整，并且充分告知本发明范围内的那些本领域普通技术人员。

比较实施例：从HEK293细胞中分离外泌体

为了从HEK293细胞中分离外泌体，将HEK293T细胞(6 x 10⁶)在补充有10% FBS和1%抗生素的高葡萄糖培养基(Dulbecco改良Eagle培养基，DMEM，4,500 mg/L葡萄糖)中，维持在37℃、5% CO₂条件下进行培养，并且当在15 cm培养皿上观察到80-90%融合时，以及为了分离外泌体，通过差速离心法获得细胞培养上清液。具体方法如下。

首先，为了从含有外泌体的培养基中去除细胞碎片和其他细胞组分，离心依序在300 g下进行10分钟、在2,000 g下进行10分钟和在10,000 g下进行30分钟，并在通过0.22µm过滤器过滤培养基之后，在36,900 rpm下进行超速离心2小时。将随后获得的外泌体重新悬浮于含有蛋白酶抑制剂(Roche)的PBS中。

实施例1：从商业牛奶中分离外泌体

本发明人通过以下方法从商业牛奶中分离外泌体。

首先，商业牛奶在3,000 g下进行离心30分钟，并然后依序在12,000 g下进行超速离心1小时，在35,000 g下进行1小时，并然后在70,000 g下进行3小时。然后，所得产物通过0.8 µm过滤器进行第一次过滤，和通过0.45 µm过滤器进行二次过滤，并然后通过0.2 µm过滤器进行三次过滤。滤液在100,000 g下进行超速离心1小时，并收集沉淀且将其悬浮于含有蛋白酶抑制剂(Roche)的PBS中(图1)。对于以上从牛奶中分离的外泌体，如以上对于比较实施例所述地使用BCA蛋白分析试剂盒(Bio-Rad)测量所分离外泌体的蛋白浓度。

实施例2：从初乳中分离外泌体

除使用初乳(得自Lee Sung Young Chang-buk Ranch，位于20, Bongsangwandong1-ro, Gyeseon-myeon, Changnyeong-gun, Gyeongsangnam-do)替代商业牛奶之外，本发明人通过与以上实施例1中所述的相同的方法从初乳中分离外泌体。

实施例3：外泌体分离方法的改进

实施例1和2中使用的方法需要超速离心并进行几次依序离心，因此具有耗时的缺点。在这种背景下，本发明人试图开发更简单和更有效的外泌体分离方法。

为此，特别地，本发明人已通过修改先前报道的从牛奶中分离外泌体的方法(Yamauchi等人, Drug Dev. Ind. Pharm. 45(3): 359-364, 2019)而构思出新的外泌体分离方法。以上Yamauchi等人报告的方法利用以下过程：在4℃下以2,000 ×g对原料奶进行离心20分钟以去除脂肪和细胞(初级离心)，通过添加等量蒸馏水进行稀释(蒸馏水稀释)，通过添加6N HCl进行滴定至pH 4.6，从而通过等电沉淀去除酪蛋白(等电沉淀)，在室温下以5,000 ×g进行离心20分钟(二次离心)，并使用1.0、0.45和0.2 µm过滤器依序进行过滤(依序过滤)。本发明人已对以上方法进行了修改，以在4℃下以5,000 xg实施第一次离心过程30分钟，引入在用蒸馏水稀释之前通过用40 μm滤器(Falcon®, Corning, USA)预过滤进一步去除脂肪和细胞的过程，并在二次离心之后利用使用0.2 μm过滤器的单次过滤过程替代进行依序过滤。

试验实施例1：外泌体分离产量分析

使用BCA蛋白测定试剂盒(Bio-Rad)分析根据以上比较实施例分离的HEK293来源的外泌体和根据本发明实施例1和2分别从商业牛奶和初乳中分离的外泌体的产量。

作为结果，如图2a所示，发现从HEK293细胞中分离的外泌体显示极低的产量，而根据本发明的实施例1，商业牛奶来源的外泌体的分离产量为0.05 mg/ml，是HEK293来源的外泌体的分离产量0.01 mg/ml的约5倍高。具体地讲，初乳的情况显示基于蛋白的产量为至少0.45 mg/ml，即使当与商业牛奶的情况相比较也非常高。

同时，作为使用实施例3的方法从牛奶中分离外泌体的结果，如图2b中可见，可以证实，与使用超滤方法时相比较，使用根据本发明实施例的非超滤外泌体分离方法导致产量显著更高。具体地讲，初乳外泌体表现出的产量为超滤法的1000倍或者更多。该结果表明，根据本发明实施例从牛奶中分离外泌体的方法在生产率方面为高度合乎期望的方法。

试验实施例2：外泌体标志物的鉴定

为证实从商业牛奶和初乳中分离的外泌体是否保持外泌体的完整特征，本发明人使用对外泌体标志物CD9、CD63、CD81和TSG 101的特异性抗体进行了Western印迹分析。

作为结果，如图3中可见，在根据本发明实施例的商业牛奶或初乳来源的外泌体中，外泌体特异性标志物被鉴定为正常的。

试验实施例3：外泌体大小和形状的表征

随后，本发明人通过使用动态光散射(DLS)分析装置(Malvern zetasizer nanoZS, UK)分析根据本发明实施例分离的外泌体的粒度，并通过透射电子显微镜对所产生的外泌体拍照(图4)。结果，如图4所示，发现根据本发明实施例制备的牛奶来源的外泌体具有在68.05 nm附近的特别窄的粒度谱，这与对照外泌体相似，而且在形状方面与对照外泌体没有显著差异。

试验实施例4：冷冻/解冻稳定性分析

为利用在实施例1和2中分别分离的商业牛奶和初乳来源的外泌体作为化妆品原料，本发明人评估了储存稳定性，特别是冷冻/解冻稳定性。

为此，将对照外泌体和在实施例1中分离的商业牛奶来源的外泌体在-85℃下冷冻并在室温下解冻，并将解冻的外泌体通过透射电子显微镜成像，且然后再次将解冻的外泌体在-85℃下冷冻并在室温下二次解冻，并通过透射电子显微镜成像(图5)和通过动态光散射分析粒度分布(图6)。

作为结果，如图5中可见，发现尽管对照外泌体失去初始外泌体形状，因为在第一次冷冻之后解冻时已经发生外泌体之间的聚集，但根据本发明实施例分离的牛奶来源的外泌体即使当二次冷冻/解冻时仍保持其初始形状。

此外，为证实以上差异是否可归因于对照外泌体的细胞类型，本发明人与更广泛范围的对照进行了比较分析。为此，具体地讲，本发明人使用动态光散射测量了实施例2中制备的初乳外泌体，以及从人类角质形成细胞(HaCaT)、小鼠黑色素瘤细胞(B16)和人类真皮成纤维细胞(HDF)中提取的外泌体在冻干前后的颗粒大小(图7a)。作为结果，如图7a中可见，发现尽管源于3种类型细胞的外泌体的粒度在冻干前后有变化，但根据本发明实施例的初乳外泌体的粒度显示几乎没有变化。另外，用透射电子显微镜鉴定了根据本发明实施例的初乳外泌体在冻干前后的形状，并且如图7b中可见，冻干前后在形状方面没有显著变化。由此可见，初乳外泌体在冻干期间具有极好的结构稳定性。另外，本发明人用根据本发明实施例的初乳外泌体在冻干前后以0.1 mg/ml的浓度处理了人类真皮成纤维细胞，以及24小时之后，通过经免疫荧光染色和用荧光显微镜鉴定了1型胶原蛋白的表达水平(图7c)。如图7C中可见，发现即使在冻干之后解冻时，胶原蛋白合成能力仍在一定程度上得以保持，表明初乳外泌体在冻干期间也具有功能稳定性。

此外，为证实牛奶外泌体的冷冻-解冻结构稳定性，本发明人通过冷冻-解冻循环比较了粒度(图8)。使用动态光散射分析，测量伴随冷冻-解冻循环次数增加，从初乳中提取的外泌体以及从人类角质形成细胞(HaCat)、小鼠黑色素瘤细胞(B16)和人类真皮成纤维细胞(HDF)中提取的外泌体的粒度。发现细胞外泌体的粒度随着冷冻-解冻循环次数的增加而增加，而初乳外泌体在多达5次冷冻-解冻循环之后显示粒度几乎没有变化。由此可见，初乳外泌体在冷冻-解冻期间具有极好的结构稳定性。

试验实施例5：递送至皮肤细胞内的能力的评估

本发明人研究了根据本发明实施例分离的牛奶来源的外泌体是否成功地递送到皮肤细胞中。

具体地讲，在用红色荧光染料NHS-Cy5.5对根据本发明实施例分离的牛奶来源的外泌体的质膜染色之后，将外泌体给予人类真皮成纤维细胞HDF细胞，并在30分钟之后通过共聚焦荧光显微镜观察到荧光信号。DAPI被用于核复染(图9)。

作为结果，如图9中可见，发现根据本发明实施例的牛奶来源的外泌体被良好地吸收到真皮成纤维细胞的细胞质中。

试验实施例6：细胞毒性评估

本发明人试图通过计算用初乳外泌体处理的人类真皮成纤维细胞HDF中的坏死/凋亡比率来评估初乳外泌体的细胞毒性。以0、0.1和0.3 mg/ml的浓度给予初乳外泌体之后24小时，用染色坏死细胞的DNA并显示荧光的碘化丙啶(PI)和用可与凋亡细胞中的磷脂酰丝氨酸反应并显示荧光的AnnexinV/FITC染色人类真皮成纤维细胞HDF，并用流式细胞仪对其进行分析。作为结果，如图10中可见，发现与对照相比较，鉴于观察到的坏死或凋亡细胞的比率，初乳外泌体在高达0.3 mg/ml的浓度下没有显示出细胞毒性。这表明根据本发明实施例的初乳外泌体为安全物质。

试验实施例7：在UV损伤的细胞的抗氧化作用分析

本发明人试图通过将初乳外泌体给予被UV照射损伤的人类角质形成细胞HaCaT时发生的活性氧减少来证实牛奶外泌体的抗氧化作用。在用商业牛奶来源的外泌体和初乳来源的外泌体以0.05 mg/ml的浓度处理HaCaT细胞之后24小时，通过UV辐射对细胞诱导损伤。6小时之后，使用与活性氧反应并显示荧光的DCF-DA，通过荧光显微镜分析细胞中产生的活性氧水平。作为结果，如图11a和11b中可见，商业牛奶来源的外泌体和初乳外泌体两者均在UV损伤的细胞中显示出显著的抗氧化作用，并且证实了这种抗氧化活性优于干细胞来源的外泌体。

试验实施例8：皮肤细胞再生和伤口愈合功效的评估

随后，本发明人研究了根据本发明实施例分离的牛奶来源的外泌体是否具有皮肤细胞再生能力。

8-1：皮肤细胞增殖能力的评估

具体地讲，HaCaT人类角质形成细胞(一类皮肤细胞)和在以上试验实施例5中使用的HDF以每孔1 x 10⁴个细胞的浓度进行接种，并用商业牛奶来源的外泌体或初乳来源的外泌体以0.2 mg/ml进行处理，且在48小时之后计数细胞以测量细胞增殖的程度。对照仅用等量的盐水进行处理(图12a和12b)。

如图12a和12b中可见，结果表明，与对照相比较，根据本发明实施例牛奶来源的外泌体在两者皮肤细胞中的增殖能力都显著提高。具体地讲，发现源于初乳的外泌体显示比商业牛奶来源的外泌体更优异的皮肤细胞增殖能力。

8-2：皮肤细胞迁移的评估

在皮肤再生过程中，已知皮肤细胞的迁移发挥最重要作用。因此，本发明人为了鉴定根据本发明实施例分离的牛奶来源的外泌体对细胞迁移具有的影响而进行了划伤测定。

具体地讲，培养HaCaT人类角质形成细胞和HDF，直至在第7次传代培养时于100 mm培养皿中达到80%的融合。将24孔板中的孔中心进行标记并添加0.1%明胶溶液。将板在37℃下温育2小时并用DPBS冲洗一次，以制备明胶包被的24孔板。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA分离细胞，并以每孔9 x 10⁴个细胞的浓度将细胞接种于包被的板中。将细胞在37℃下培养过夜，并然后使用200 µL移液管吸头对细胞进行划伤，且用DPBS把孔冲洗两次以去除碎片。随后，向每孔中添加1 mL含0.5% FBS的培养基，并通过显微镜(Leica, Wetzlar, Germany)捕获图像，以测量划伤时间0h。接下来，除以下的组[阳性对照(10% FBS DMEM 1 mL)、阴性对照(0.5% FBS DMEM 1 mL)、EGF (10 ng/mL, EGF 0.5% FBS DMEM 1 mL)]之外，在每孔中更换800 µL含有0.5% FBS的培养基。将分别在实施例1和2中分离的外泌体置于transwell插入物中，并向插入物中添加200 µL在DMEM中含有1% FBS的培养基。在37℃下培养细胞8小时之后，对划伤部分进行成像。使用Image Pro Plus软件(Media Cybernetics, USA)测量划伤宽度，并根据以下方程式1进行计算。

[方程式1]

相对伤口面积= {(A0-At)/A0}/阴性对照的结果值

(在该方程式中，A0为初始伤口面积，At为48小时之后的伤口面积。)

作为结果，如图11中可见，与对照组相比较，根据本发明实施例的牛奶来源的外泌体增加皮肤细胞的迁移。特别是，发现与牛奶来源的外泌体相比较，源于初乳的外泌体显著增加皮肤细胞的迁移。然而，由于商业牛奶在材料供给和成本方面可为更加有利的，因此这些发现并没有削弱源于商业牛奶的外泌体作为用于功能性化妆品的原料的效用。

8-3：血管内皮细胞的管形成率分析

本发明人以200 µg/ml的浓度用初乳、商业牛奶和血清来源的外泌体处理小鼠源性内皮细胞(SVEC4-10)，并比较各组之间的血管形成程度。

首先，为允许在内皮细胞中形成管，将充当细胞外基质的基质胶(Corning #356237)以50 µL移液到96孔板中，并允许其在37℃下硬化约30分钟。随后，将经外泌体处理的细胞贴附于其上并培养约8小时。在此，使用显微镜(DIC)图像观察和比较管形成的程度，将三根或更多根管相交的分支点以及管的长度数字化且显示于图表中(图14)。

作为测量结果，如图14中可见，与未处理的对照组相比较，用牛奶来源的外泌体(比如商业牛奶和初乳)处理的组显示更高的管形成程度，以及血清来源的外泌体组显示与对照组没有显著差异并且相似的结果。由此可以证实，根据本发明实施例的牛奶来源的外泌体可加速血管形成，并且因此可有利地用于伤口愈合。

8-4：通过体内成像证实牛奶外泌体的体内分布

本发明人通过小鼠体内成像(IVIS)分析了所给予初乳外泌体的体内分布。

使用PBS缓冲液将初乳外泌体的浓度调至1 μg/μl，并且每100 μl外泌体添加1 μlFlamma 675 NHS酯(BioActs #PWS1515)，且在4℃下标记过夜。之后，通过每小时进行两次空气熔断(air fuse)来去除未附着于外泌体的染料材料。将每只小鼠100 µg外泌体皮下注射到小鼠左大腿上部，并且每天同一时间使用IVIS®体内成像系统(PerkinElmer, USA)进行体内成像，从注射当天开始持续7天(图15a)。在此，在第二天，提取5个器官和皮肤组织，并鉴定每个器官的初乳外泌体分布程度(图15b和15c)。作为结果，如图15a中可见，发现大部分初乳外泌体在3天之后离开身体，并且完全离开身体需要约7天。作为器官摘取的结果，如图15B和15C所示，在皮肤中检测到最高强度的荧光，然后依序为肝脏、肺部和肾脏。从该结果还可证实，初乳外泌体在保持在体内之后，随后通过肾脏排出体外。

8-5：使用创伤模型动物的功效分析

本发明人继续进行创伤动物建模，以证实牛奶来源的外泌体的实际皮肤组织再生作用。

作为动物，使用雄性Balb/c 7周龄小鼠，并使用8 mm直径的皮肤活检穿孔器在背部诱导伤口。实验组被分为总计5种类型(对照、血清、商业牛奶、初乳和初乳-4天)，并基于试验实施例8-4的体内分布结果，以3天的间隔通过皮下注射给予外泌体。除初乳-4天组外，其余4组在第1、4和7天给予相应的物质，而初乳-4天组在第4、7和10天给予初乳外泌体。在此，所给予物质的浓度为1 µg/µl，并且每只动物给予总体积为100 µl，且在约25天内观察进展情况(图16)。

结果，如图16中可见，在给予初乳外泌体的组和初乳-4天组中，皮肤伤口明显快速再生，并且特别是初乳-4天组在第4天和第10天之间显示出比其他组更快的再生速率。皮肤再生在初乳处理组后依序为商业牛奶外泌体处理组、PBS处理对照组和血清来源的外泌体处理组，并且由此证实，牛奶来源的外泌体比其他实验组具有更高的皮肤再生效果。

8-6：免疫组织化学分析

在创伤模型动物实验之后，本发明人采用免疫组织化学方法进行组织分析。

具体地讲，在动物实验的第25天处死小鼠之后，切除伤口部位组织，并留在固定液中过夜以固定组织。为用石蜡渗透组织，从二甲苯到100%、90%、80%和70%乙醇依序进行脱水过程，然后用石蜡包埋以形成块。使用组织切片机，制备6 µm厚的石蜡组织切片，并根据由DAB试剂盒(Abcam #ab64264)提供的实验方法对其进行测试。首先，在从载玻片上的组织中去除石蜡成分并诱导在室温下与过氧化氢酶封闭缓冲液反应10分钟之后，将载玻片在95℃下于修复溶液中煮沸10分钟以断开蛋白之间的交联。然后，诱导在室温下与蛋白封闭缓冲液反应10分钟之后，用抗弹性蛋白一抗(santacruz #sc-58756)处理载玻片，并允许其在4℃下反应过夜。第二天，添加生物素化山羊抗一抗溶液和链霉亲和素-过氧化物酶溶液，并允许其在室温下反应10分钟，且将DAB色原和DAB底物以1:50的比率混合，并置于抗体处理的组织切片上，且在室温下观察颜色变化10分钟。最后，进行复染以染色细胞核，并用甲苯固定载玻片。

作为组织显微检查的结果，如图17中可见，发现与其他组相比较，在牛奶来源的外泌体中，特别是在用初乳外泌体处理组的组织中表现出较深的棕色，并且这可能结论性地表明弹性蛋白成分在该特定组的组织中检测到最多。另外，牛奶外泌体的这种弹性蛋白表达增强效果与以下所述的皱纹减少效果密切相关。

试验实施例9：皱纹减少效果分析

胶原蛋白为真皮的细胞外基质的主要成分，其在皮肤再生周期期间在被分解之后通常由胶原蛋白形成酶再生，并且皮肤皱纹的形成为由于不能恢复真皮的细胞外基质的不成功的胶原蛋白生物合成而表现的症状。在这种背景下，本发明人通过测量胶原酶、金属蛋白酶2 (MMP-2)表达的抑制程度和胶原蛋白生物合成的增强作为皮肤皱纹减少的量度来进行研究。

为此，具体地讲，本发明人将人类皮肤成纤维细胞(HDF)接种于35π玻底培养皿中(3x10⁵个细胞)，并在37℃和5% CO₂的温育箱中培养24小时。然后，在分别以0.1 mg/ml的浓度用实施例1和2中分离的商业牛奶来源的外泌体和初乳来源的外泌体处理之后24小时，使用免疫荧光方法对1型胶原蛋白进行染色并通过荧光显微镜对其进行检查，且通过Western印迹测量金属蛋白酶2的蛋白表达水平。结果，如图18a和18b中可见，发现在用商业牛奶来源的外泌体和初乳外泌体处理的HDF中1型胶原蛋白的表达水平提高和MMP-2蛋白的表达水平降低，并且该发现与试验实施例8-6的结果一起表明，牛奶外泌体具有极好的皮肤皱纹减少效果。

试验实施例10：美白活性分析

本发明人研究了作为美白活性的典型指标的黑素生成抑制，以证实根据本发明实施例的牛奶来源的外泌体是否具有皮肤美白活性。

具体地讲，本发明人试图通过测量B16F10小鼠黑色素瘤细胞在用牛奶外泌体(商业牛奶来源的外泌体和初乳外泌体)处理之后产生的黑色素的量来证实黑色素的减少效果。作为对照组，使用从B16F10细胞分离的外泌体。以0、0.002、0.005、0.01和0.02 mg/ml的浓度用相应的外泌体处理B16F10细胞，并在24小时之后，通过UV辐射刺激细胞。然后，24小时之后，从等量的细胞中提取黑色素，并在490 nm的波长下测量和分析提取的黑色素。作为结果，如图19中可见，与对照组相比较，初乳外泌体浓度至高达到0.002 mg/ml时产生的黑色素的量没有显著差异，而在0.005 mg/ml-0.02 mg/ml的初乳外泌体处理浓度下观察到黑色素减少效果。另外，以0.1 mg/ml的浓度用从B16F10中提取的外泌体、商业牛奶来源的外泌体和初乳外泌体处理B16F10，以比较24小时之后黑色素产生的量(图19中的C)。作为结果，在用紫外线刺激细胞时和不施加刺激时，在用牛奶外泌体处理的细胞中均观察到黑色素产生的量减少幅度最大。

试验实施例11：免疫功能活性分析

本发明人在用50 µg/ml商业牛奶来源的外泌体和初乳外泌体处理BMDM (骨髓来源的巨噬细胞)之后分析了细胞培养基中的细胞因子。

具体地讲，本发明人使用1 ml细胞培养基来分析细胞培养基中的细胞因子，并利用细胞因子阵列试剂盒(ARY006)中提供的实验方法。首先，将与针对各种细胞因子的一抗结合的膜在室温下用封闭缓冲液封闭30分钟，并然后将1 ml细胞培养基给予该膜，并允许其在4℃下反应过夜。之后，用生物素缀合的二抗鸡尾酒处理该膜，并允许其在4℃下反应过夜，然后为在室温下与HRP-链霉亲和素反应2小时，并通过化学发光(Bio-Rad)使其结果可视化。作为结果，如图19中可见，与未处理的对照组相比较，发现在用商业牛奶和初乳处理的组中，参与T细胞和树突状细胞激活和炎症反应的因子CD54、CXCL1、CCL3、CCL5和TNF-α的表达相对高。该结果表明，根据本发明实施例的牛奶外泌体激活免疫。

试验实施例12：增强生长因子表达能力的分析

本发明人分别以100 µg/ml的浓度用市售油来源的外泌体和初乳外泌体处理NIH-3T3成纤维细胞，并在24小时之后分析了来自细胞培养基和细胞裂解物的各种生长因子的表达水平。为了该实验，基于等量蛋白制备了500 µg细胞裂解物，并添加细胞培养基直至样品溶液的总体积达到1 ml。根据生长因子阵列试剂盒(RayBiotech #AAM-GF-3-4)中提供的实验方法进行蛋白表达水平分析。首先，将与针对生长因子的一抗结合的膜在室温下用封闭缓冲液处理30分钟，并向其中添加1 ml制备的样品，且允许其在4℃下反应过夜。第二天，充分地冲洗膜，并然后用生物素化二抗鸡尾酒处理，且允许其在室温下反应2小时，然后为在室温下与HRP-链霉亲和素反应2小时，并通过化学发光(Bio-Rad)使其结果可视化。作为结果，如图21中可见，与对照组相比较，在用商业牛奶来源的外泌体和初乳外泌体处理的实验组中，参与抗炎反应和组织再生或血管生成的HGF、IGF-1、PDGF-AA和VEGF-A以较高水平表达。

试验实施例13：肝细胞增殖分析

本发明人研究了人源肝细胞的活性，以评估根据本发明实施例的牛奶来源的外泌体作为用于改善肝脏健康的功能性保健食品的原料的功效。

将人源肝细胞以每孔1x10⁴个细胞的浓度接种于96孔板中，并在37℃和5% CO₂浓度的温育箱中培养24小时。将(0.2) mg/ml的分别在实施例1和2中分离的商业牛奶和初乳来源的外泌体添加至无血清DMEM培养基中，持续24小时，并使用CCK-8测定(Dojindomolecular technologies, Japan)评估细胞增殖。对照仅用等量盐水处理。向每孔添加10μl的CCK-8测定溶液，并在培养4小时之后，测量并比较450 nm处的吸光度值。

试验实施例14：脱发预防、毛发生长促进和毛发生长效果的分析

14-1：真皮毛乳头细胞对牛奶外泌体摄取的分析

为了根据本发明实施例的牛奶外泌体能够对脱发表现出预防或治疗作用，牛奶外泌体需要表现出被真皮毛乳头细胞吸收并促进增殖的真皮毛乳头细胞增殖活性，所述真皮毛乳头细胞为助于毛发生长的细胞。在这种背景下，本发明人研究了根据本发明实施例的牛奶外泌体是否易于被培养的真皮毛乳头细胞吸收。

具体地讲，本发明人用100 μg/ml标记有Cy5.5荧光染料的商业牛奶来源的外泌体分别处理培养的人类真皮毛乳头细胞1小时、4小时、12小时和24小时，并用荧光显微镜观察细胞摄取的程度(图22a)。作为结果，如图22a中可见，证实了根据本发明实施例的牛奶外泌体易于与处理持续时间成比例地被人类真皮毛乳头细胞吸收。

14-2：真皮毛乳头细胞增殖分析

本发明人研究了根据本发明实施例的牛奶来源的外泌体对人类真皮毛乳头细胞增殖具有的影响，以评估改善毛发健康和减轻脱发的效果。

为此，具体地讲，本发明人首先用100、250和500 µg/ml在实施例1中制备的商业牛奶来源的外泌体处理人类真皮毛乳头细胞48小时，并利用细胞计数试剂盒-8 (CK04-20)中提供的实验方法对细胞进行计数。将20 µl细胞计数试剂盒的反应溶液添加至200 µl细胞培养基中，并允许其在37℃和5%二氧化碳条件下反应30分钟。之后，在450 nm波长下进行测量并将测量可视化。另外，人类真皮毛乳头细胞与100 µM脱发诱导物质(双氢睾酮，DHT)在一起24小时，并然后将细胞用500 µg/ml商业牛奶来源的外泌体处理48小时，且然后将20 µl细胞计数试剂盒的反应溶液添加至200 µl细胞培养溶液中，并允许其在37℃和5%二氧化碳条件下反应30分钟。之后，在450 nm波长下进行测量并将测量可视化(图22b)。作为结果，如图22b中可见，发现与未处理的对照组相比较，用500 µg/ml商业牛奶来源的外泌体处理的组活跃地诱导细胞增殖。同时，发现与对照组相比较，仅用脱发诱导物质处理的组显示细胞增殖活性降低，但在用脱发诱导物质处理之后以500 µg/ml商业牛奶来源的外泌体处理的组中，细胞增殖活性恢复至DHT处理之前的水平。这表明根据本发明实施例的牛奶外泌体在预防脱发方面也有效。

14-3：毛发生长促进和毛发生长效果分析

基于以上试验实施例14-2的结果，本发明人利用试验动物研究了毛发生长促进和毛发生长效果，以证实根据本发明实施例的牛奶外泌体除预防脱发之外是否在促进毛发生长和生发方面有效。

具体地讲，本发明人将雄性C57BL/6 7周龄小鼠的整个背部区域剃短，并涂抹Veet乳膏且用Kimtech擦干净剩余的毛发(第0天)，并从第1天开始每隔一天通过皮内注射向背部中部(沿脊柱)的5个部位给予20 µl商业牛奶来源的外泌体，总共100 µl (200 µg)。然后，每3-4天一次监测毛发生长的外观。作为结果，如图22c中可见，发现在给予根据本发明实施例的商业牛奶来源的外泌体的组中毛发以更快的速率生长。

因此，可以证实，本发明实施例的牛奶外泌体在促进头发生长和生发以及预防脱发方面也高度有效。

制备实施例1：护肤液

含有根据本发明实施例而得到的源于商业牛奶或初乳的外泌体的护肤液通过按以下表1所示的组成比混合来制备。

表1

护肤液的混合比率

成分	含量(单位: Wt%)
		牛奶来源的外泌体	0.5
硬脂酸甘油酯SE	1.5
		鲸蜡硬脂醇	1.5
羊毛脂	1.5
		聚山梨酯60	1.3
失水山梨醇硬脂酸酯	0.5
		氢化棕榈油	4.0
矿物油	5.0
		三辛酸甘油酯	2.0
二甲基硅油	0.8
		生育酚乙酸酯	0.5
羧基乙烯基聚合物	0.12
		甘油	5.0
1,3-丁二醇	3.0
		透明质酸钠	5.0
三乙醇胺	0.12
		Uniside-U 13	0.02
蒸馏水	其余部分
		总共	100

制备实施例2：营养霜

含有根据本发明实施例而得到的商业牛奶或初乳来源的外泌体的营养霜通过按以下表2所示的比率混合成分来制备。

表2

营养霜的混合比率

成分	含量(单位: Wt%)
		牛奶来源的外泌体	0.5
亲脂性单硬脂酸甘油酯	1.5
		鲸蜡硬脂醇	1.5
硬脂酸	1.0
		聚山梨酯60	1.5
失水山梨醇硬脂酸酯	0.6
		异硬脂酸异硬脂酯	5.0
角鲨烯	5.0
		矿物油	35.0
二甲基硅油	0.5
		羟乙基纤维素	0.12
三乙醇胺	0.7
		甘油	5.0
Uniside-U 13	0.02
		蒸馏水	其余部分
总共	100

制备实施例3：用于减轻脱发的洗发水的制备

含有根据本发明一个实施例而得到的源于初乳或商业牛奶的外泌体的用于减轻脱发的洗发水通过按以下表3所示的混合比率混合成分来制备。

表3

用于减轻脱发的洗发水的混合比率

成分	含量(单位: Wt%)
		牛奶来源的外泌体	1.0
月桂基醚硫酸钠	0.7
		月桂基硫酸钠	0.7
聚季铵盐-7	1
		水解蚕丝	0.5
泛醇	1.0
		甘油	2.5
椰油酰胺丙基甜菜碱	0.7
		聚季铵盐-10	0.5
乙基己基甘油	3.5
		EDTA二钠	1.0
柠檬酸	0.7
		丁二醇	0.7
苯氧乙醇	0.5
		香料	0.2
蒸馏水	其余部分
		总共	100

制备实施例4：功能性保健食品(软胶囊制剂)的制备

含有根据本发明一个实施例而得到的源于初乳或商业牛奶的外泌体的软胶囊制剂通过按以下表4所示的混合比率混合来制备。将以下量的成分混合并均质化，且然后根据已知方法填充于预定重量的软胶囊中。

表4

软胶囊制剂的制备

成分	含量(单位: mg)
		源于冻干牛奶的外泌体	1000
透明质酸	75
		胶原蛋白肽	75
维生素C	75
		维生素B2	4
维生素B6	3
		生育酚	50
膳食纤维	100
		小麦胚芽油	3,500
蜂蜡	500
		蜡	500

发现根据本发明实例的源于商业牛奶和初乳的外泌体不仅显示与源于常规培养细胞的外泌体相比较极高的产量，而且还显示常规培养细胞所不具备的储存稳定性以及极高的皮肤细胞再生能力。因此，根据本发明实例的牛奶或初乳来源的外泌体可极有效地用作用于皮肤再生的功能性化妆品的原料。尽管本发明已参考上述实施例进行了描述，但这些实施例仅为示例性的，并且本领域的技术人员应当理解，由此的各种修改和等效的其他实施方案是可能的。因此，应基于所附权利要求的技术概念来确定本发明技术保护的真正范围。

工业可用性

根据本发明实例用于皮肤再生的化妆品组合物不仅具有显著高于从细胞培养基中分离的常规外泌体的皮肤再生效果，而且还具有低生产成本、显著高的产量和高材料稳定性，并且因此可极为经济地生产。因此，根据本发明实例的牛奶外泌体可被用于伤口愈合、免疫功能增强、脱发预防和制备用于毛发生长和毛发生长促进的药用组合物以及制备用于皮肤皱纹减少或美白的各种功能性化妆品。

Claims (20)

1.用于皮肤再生的化妆品组合物，其包含作为活性成分的源于牛奶或山羊奶的外泌体。

2.权利要求1的用于皮肤再生的化妆品组合物，其中所述牛奶或山羊奶为原料奶、商业牛奶或山羊奶或者初乳。

3.用于皱纹减少的化妆品组合物，其包含作为活性成分的源于牛奶或山羊奶的外泌体。

4.权利要求3的用于皱纹减少的化妆品组合物，其中所述牛奶或山羊奶为原料奶、商业牛奶或山羊奶或者初乳。

5.用于皮肤美白的化妆品组合物，其包含作为活性成分的源于牛奶或山羊奶的外泌体。

6.权利要求5的用于皮肤美白的化妆品组合物，其中所述牛奶或山羊奶为原料奶、商业牛奶或山羊奶或者初乳。

7.用于减轻脱发的功能性洗发水，其包含作为活性成分的源于牛奶或山羊奶的外泌体。

8.权利要求7的用于减轻脱发的功能性洗发水，其中所述牛奶或山羊奶为原料奶、商业牛奶或山羊奶或者初乳。

9.功能性保健食品，其包含作为活性成分的源于牛奶或山羊奶的外泌体。

10.权利要求9的功能性保健食品，其中所述牛奶或山羊奶为原料奶、商业牛奶或山羊奶或者初乳。

11.权利要求9或10的功能性保健食品，其被用于减轻皮肤过敏性、改善免疫、改善肠道健康、改善皮肤健康、调节血糖水平、抗氧化功能或改善肝脏健康。

12.用于治疗伤口的药用组合物，其包含作为活性成分的源于牛奶或山羊奶的外泌体。

13.权利要求12的药用组合物，其中所述牛奶或山羊奶为原料奶、商业牛奶或山羊奶或者初乳。

14.加速受试者受伤皮肤再生的方法，所述方法包括将治疗有效量的从牛奶或山羊奶中分离的外泌体应用于所述受试者的受伤皮肤。

15.权利要求14的方法，其中所述牛奶或山羊奶为原料奶、商业牛奶或山羊奶或者初乳。

16.从牛奶或山羊奶中分离外泌体的方法，所述方法包括：

第一离心步骤，通过离心从牛奶或山羊奶中去除脂肪和细胞；

过滤器过滤步骤，用具有20-60 µm的筛孔尺寸的滤器过滤所述离心的牛奶或山羊奶，以进一步从中去除脂肪和细胞；

稀释步骤，通过向其中添加等体积的蒸馏水来稀释所述过滤的牛奶或山羊奶；

等电沉淀步骤，通过向所述稀释的牛奶或山羊奶中添加酸来将pH调至4-5，从而沉淀所述牛奶或山羊奶中的酪蛋白；

二次离心步骤，对其中酪蛋白已经沉淀的所述牛奶或山羊奶进行另外离心，并从中收集上清液；和

过滤步骤，通过0.2 µm的过滤器过滤所述收集的上清液。

17.权利要求16的方法，其中所述第一离心步骤在4℃的温度条件下以4,000-6,000 xg进行20-40分钟。

18.权利要求16的方法，其中所述滤器为具有30-50 μm的筛孔尺寸的滤器。

19.权利要求16的方法，其中所述酸为盐酸、硝酸、乙酸或硫酸。

20.权利要求16的方法，其中所述第二离心步骤在室温下以4000-6000 xg进行15-30分钟。

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