CN107375944A - 一种靶向抗恶性黑色素瘤的达卡巴嗪和miR‑205共载外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种靶向抗恶性黑色素瘤的达卡巴嗪(DTIC)和miR‑205共载外泌体及其制备方法和应用。本发明发现DTIC和miR‑205联用对人黑色素瘤有协同抑制作用，进一步采用胆固醇修饰的核酸适体Ap16为靶头，来源于泌乳中期牛奶的外泌体(exosomes)包载DTIC和miR‑205，通过冻融法成功构建Ap16‑exosome/(DTIC/miR‑205)纳米给药系统，证实了DTIC和miR‑205的协同抗肿瘤作用，以及适体Ap16介导共载外泌体提高miR‑205增强DTIC抗恶性黑色素瘤效果的可行性。本发明为构建抗恶性黑色素瘤纳米给药系统开辟了新途径，也为基因治疗与化疗联用提供了理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种给药系统，具体地说，涉及一种靶向抗恶性黑色素瘤的达卡巴嗪和miR-205共载外泌体及其制备方法和应用。
背景技术
恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)是一种来源于黑色素细胞的恶性程度很高的肿瘤，多发生于体表皮肤，占皮肤恶性肿瘤的7％～20％，主要是由神经鞘细胞发生突变，酪氨酸代谢和色素生成异常所引起。早期的恶性黑色素瘤病人可通过手术治愈，但也有较多患者发生难以控制的侵袭和转移，这既是影响黑色素瘤患者生存的主要因素，又是治疗恶性黑色素瘤的最大障碍。恶性黑色素瘤一旦发生远处转移，其预后很差，5年内死亡率较高，其主要原因是转移性黑色素瘤对大多数细胞毒药物耐药，只有达卡巴嗪(Dacarbazine，DTIC)、替莫唑胺(Temozolomide)等少数几种药物可能有效，但它们的有效率也仅有10％～20％，无进展生存期约3～6个月。近年来MM的发病率有明显上升的趋势，包括原先发病率较低的地区也是如此，因此，亟需研究基因治疗、靶向治疗、生物化学治疗等以提高和改善转移性MM患者对化疗药物的敏感性和效果。
随着MM发生、发展的分子机制研究的深入，基因治疗已成为抗MM最有前景的治疗方法，具有靶向性好、毒副作用小及可特异性地杀伤肿瘤细胞等特点，但是外源基因自己不能主动进入细胞，而且不是很稳定，容易被酶降解，因此基因治疗应用于临床还需要一种安全、高效的传递载体进行递送。随着近年来靶向递药系统的发展，将基因治疗技术与靶向递药系统联合应用已逐渐成为生物技术药物领域的研究热点，也被认为是癌症治疗中最具前景的方向。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)已经发展成为一种非常有潜力的肿瘤基因治疗手段，即利用siRNA或shRNA等沉默特定的靶向基因，但是肿瘤的发生往往是多个基因表达失调综合作用的结果，单用siRNA靶向特定基因的效果常不显著，因此RNAi技术存在着明显的缺陷，而microRNA则可以很好地解决这些问题。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类内生的、长度约19-25个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。随着miRNA调控基因表达研究的逐步深入，大量研究已证明miRNA与MM的发生和发展有着密切的关系，发挥着类似于致癌基因或抑癌基因的功能。因此，miRNA作为一种新的调控基因表达的小分子，已成为抗MM等恶性肿瘤研究的新策略。
近来研究表明，miR-205在MM的发生、发展过程中起着至关重要的作用，其在原发或转移的MM组织中均低表达。miR-205可通过抑制E2F1等转录因子表达而抑制MM细胞株A375、A2058等的增殖、侵袭和迁移，E2F1能够诱导转运体ABCA2、ABCA5、ABCG2等表达引起肿瘤细胞的化疗抵抗。
外泌体(exosomes)是多种活细胞分泌的直径约为40～100nm的小囊泡体，分布于外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等体液中，其内容物含蛋白、脂质和核酸等，在免疫监视、炎症反应及癌症发生发展等许多生理和病理过程中有重要的功能。外泌体与质膜结构十分相似，具有天然稳定、纳米大小、能够穿透各种生物屏障，保护其内容物不被降解，并具有类似病毒侵入细胞的高效机制进入“受体细胞”等优点。与其它常用的基因治疗载体如病毒、脂质体、高分子聚合物等相比，exosomes作为基因运送载体还具有低免疫原性、无细胞毒性、无致突变性等优点，因此exosomes有望发展成为理想的基因递送载体。牛奶作为人们生活的日常消费品，具有获取容易、价格便宜、安全性高等优点，以此来源制备的exosomes能够包载基因药物、化疗药物等亲水性或亲脂性分子，可望成为一种非常有价值的临床载药工具。
黑色素瘤相关抗原(melanoma-associated antigen A3，MAGE-A3)表达于多种恶性肿瘤，而在正常组织中不表达(除睾丸和胎盘外)，具有肿瘤特异性，可降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，也是肿瘤特异性免疫治疗的理想靶点。
MAGE-A3在转移性黑色素瘤细胞中同样高表达，其适体Ap52、Ap16均能够特异性与黑色素瘤细胞表面MAGE-A3高度结合，可作为MM靶向治疗的特异性靶头。核酸适体(aptamer)作为一种新型的分子探针，具有抗体无法比拟的优点，如无免疫原性、生产成本低廉，与受体的亲和力高，特异性好，渗透性好，修饰后进入人体内稳定。
目前，专利文献CN102596177A，公开日2012.07.18，公开了来源于有核哺乳动物细胞的微囊泡，所述微囊泡比所述有核细胞小，可用于将治疗物质或诊断物质递送至特定组织或特定细胞，更具体地，该发明公开了来源于单核细胞、巨噬细胞、树枝状细胞、干细胞等等的微囊泡，所述微囊泡可用于递送治疗和/或诊断与癌症、血管疾病、炎症等相关的组织的特定治疗物质或诊断物质；专利文献CN102349998A，公开日2012.02.15，公开了一种以外泌体为基础的疏水性抗癌药物制剂，药物制剂采用载体负载药物的形式，制剂所使用的载体为外泌体，其来源于包括动物体的唾液、血液的体液以及细胞的培养液中，所述载药包括阿霉素、阿司匹林、替莫唑胺、紫杉醇、柔红霉素、秋水仙碱或长春新碱的所有的疏水性抗癌药物，制备方法为：将疏水性抗癌药物加入到外泌体溶液中，加入比例为1:10-1000(mg/ml)，药物沉淀于底部，搅拌溶液孵化0.5-24小时，取上清，得到包载药物的外泌体溶液，再将这种包载药物的外泌体溶液用作药物制剂。但还未见用exosomes作为化疗药物与基因药物的共载体，将其与特异性靶头Ap16适体结合，实现miR-205和DTIC等化疗药物协同抗肿瘤的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种治疗恶性黑色素瘤的药物组合物。
本发明的再一的目的是，提供一种靶向抗恶性黑色素瘤的达卡巴嗪和miR-205共载外泌体。
本发明的另一的目的是，提供所述靶向抗恶性黑色素瘤的达卡巴嗪和miR-205共载外泌体的制备方法。
本发明的第四个目的是，提供所述靶向抗恶性黑色素瘤的达卡巴嗪和miR-205共载外泌体的用途。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种治疗恶性黑色素瘤的药物组合物，所述的药物组合物以达卡巴嗪和miR-205为活性成分，并含有药学上可接受的载体。
优选地，所述的载体为牛奶外泌体，所述的达卡巴嗪和miR-205包载于牛奶外泌体的内部。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一种靶向抗恶性黑色素瘤的达卡巴嗪和miR-205共载外泌体，所述的靶向抗恶性黑色素瘤的达卡巴嗪和miR-205共载外泌体为外部结合胆固醇修饰的核酸适体Ap16，内部包载达卡巴嗪和miR-205的牛奶外泌体。
优选地，其制备方法包括以下步骤：
a)收集处于泌乳中期奶牛生产的牛奶，采用超速离心方法制备牛奶外泌体；
b)将胆固醇修饰的核酸适体Ap16和牛奶外泌体通过冻融法实现二者的结合，构建Ap16-牛奶外泌体；
c)通过电穿孔方法完成Ap16-牛奶外泌体对达卡巴嗪和miR-205的包载。
优选地，步骤a)所述的采用超速离心方法制备牛奶外泌体具体为：将牛奶10000-15000g低温2-6℃离心20-40min，取上清液继续80000-120000g低温2-6℃离心40-80min，分离上清液再次120000-150000g低温2-6℃离心80-100min，弃去上清液，收集沉淀，即得。
优选地，步骤b)具体为：将胆固醇修饰的核酸适体Ap16与牛奶外泌体按质量比1:6～1:10溶于PBS中，-30～-50℃低温快速冷冻40-80min，然后室温条件下缓慢融化，如此反复冻融2～3次，即得。
更优选地，所述的胆固醇修饰的核酸适体Ap16与牛奶外泌体质量比为1:9。
优选地，步骤c)具体为：将达卡巴嗪、miR-205和牛奶外泌体按40-60μg:8-12nmol:80-120μg的比例用电穿孔缓冲液混匀，电压750-1500V、脉冲宽度10-20ms条件下1次脉冲完成电穿孔载药，37℃孵育20-40分钟，8000-12000g离心5-15min除去游离的miRNA和达卡巴嗪，120000-150000g离心1.5-2.5h，即得。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
如上任一所述的靶向抗恶性黑色素瘤的达卡巴嗪和miR-205共载外泌体的制备方法，包括以下步骤：
a)收集处于泌乳中期奶牛生产的牛奶，采用超速离心方法制备牛奶外泌体；
b)将胆固醇修饰的核酸适体Ap16和牛奶外泌体通过冻融法实现二者的结合，构建Ap16-牛奶外泌体；
c)通过电穿孔方法完成Ap16-牛奶外泌体对达卡巴嗪和miR-205的包载。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
如上任一所述的靶向抗恶性黑色素瘤的达卡巴嗪和miR-205共载外泌体在制备治疗恶性黑色素瘤的药物中的应用。
还需要说明的是，以上“药学上可接受的载体”是指能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系，具体地，其不仅可以是外泌体，还可以是病毒、脂质体、高分子聚合物等基因运送载体，还可以指代常规药用辅料，包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂和吸附剂等。
本发明优点在于：
1、本发明通过观察体外DTIC和miR-205联用对人黑色素瘤A375细胞活性的抑制效果，发现DTIC和miR-205表现出协同作用，进一步采用胆固醇(cholesterol，Chol)修饰的核酸适体Ap16为靶头，来源于泌乳中期牛奶的exosomes包载DTIC和miR-205，通过冻融技术构建Ap16-exosome/(DTIC/miR-205)纳米给药系统，对其协同抗肿瘤作用进行了评价，发现DTIC和miR-205联用，具有协同抑制A375和A2058细胞增殖、协同促进A375和A2058细胞凋亡以及协同降低A375和A2058细胞侵袭能力的作用。因此DTIC和miR-205联用将提高和改善MM患者对化疗药物的敏感性和效果。
2、针对化疗药物与基因治疗联合应用载体选择难的特点，将适体Ap16修饰来源于牛奶的exosomes作为共载体，达到了增强化疗药物的敏感性、避免水溶性miRNA的过早释药、提高药物靶向性的效果，进一步提高了联合用药的综合疗效，证实了使用适体Ap16修饰的牛奶外泌体作为共载体的可行性。
3、本发明Ap16-exosomes/(DTIC/miR-205)给药系统的制备方法，选择泌乳中期奶牛生产的牛奶，保证了较高的外泌体浓度；利用Chol-Ap16中胆固醇的亲脂性和exosomes中脂质的双分层结构，通过冻融技术实现两者的结合，整个过程中保证了适体Ap16的结构没有变化，因而可保持其生物学活性；并合理设置冻融和电穿孔等步骤的参数。以上技术特征均保证了制备的Ap16-exosomes/(DTIC/miR-205)给药系统具有很高的包封率和稳定性，靶向性能佳，协同抗肿瘤的作用十分显著。
综上，本发明发现了DTIC和miR-205具有协同作用，提出并验证了“适体Ap16介导共载外泌体可提高miR-205增强DTIC抗MM效果”的科学假说，从基因抑制、化疗增敏及联合用药等多角度发挥抗MM综合作用，实现了化疗治疗指数的提高，同时降低化疗药物的毒副作用，为构建抗MM纳米给药系统开辟了一条新途径，同时也为基因治疗与化疗联用提供了理论依据。
附图说明
图1.不同组别对黑色素瘤A375细胞抑制效果(n＝3)。
图2.牛奶来源exosomes电镜照片。
图3.Ap16-exosomes的体外靶向性评价。
图4.本发明的Ap16-exosome/(DTIC/miR-205)纳米给药系统示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1体外DTIC和miR-205联用对人黑色素瘤A375细胞活性的抑制效果
体外培养人黑色素瘤细胞株A375细胞(购自中国科学院细胞库)，分成DTIC组(0.5μg/ml)、miR-205组(100nmol/L)、DTIC+miR-205组、2×DTIC组(1μg/ml)、2×miR-205组(200nmol/L)对A375细胞进行干预，处理24小时后采用MTT法检测细胞活力。未用药物处理的细胞孔为对照孔，其细胞存活率设为100％。从结果(图1)中得出，DTIC和miR-205联用对A375细胞的抑制效果，要比单独使用DTIC和miR-205效果更明显(p<0.01)，更重要的是DTIC+miR-205组效果强于2×DTIC组(p<0.05)，这就提示，DTIC和miR-205具有协同作用，这为MM的治疗提供了一种新的综合治疗方法。
实施例2牛奶来源exosomes的制备和载药性能评价
①exosomes的制备：收集上海牛奶集团种奶牛场处于泌乳中期奶牛生产的牛奶，采用超速离心方法制备外泌体。具体步骤：13000g低温4℃离心30min，取上清液继续100000g低温4℃离心60min，小心分离上清液再次135000g低温4℃离心90min，弃去上清液，收集沉淀，即得外泌体exosomes。外泌体用PBS重悬，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-80℃保存备用。
采用超微量分光光度计测定外泌体蛋白含量，调节蛋白浓度为1-6mg/ml；采用动态激光散射法测定粒径和Zeta电位，平均粒径73±5nm，PDI 0.12；Zeta电位-14.5±3.2mv。外泌体电镜照片见图2。
②miRNA-205的合成：参照文献【Noguchi S,et al.Vet Comp Oncol,2013,11(2):113-23】报道序列5’-UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG-3’(SEQ ID NO:1)，由上海吉玛制药技术有限公司合成miRNA-205和Cy3标记的miRNA-205(Cy3标记在5’端)。
③药物的包载：按下列比例：将DTIC 50μg、miR-205 10nmol、exosomes100μg(按蛋白浓度计算)用电穿孔缓冲液(美国Gibco)混匀(200μl反应体系)，采用Invitrogen公司电穿孔仪，1300V、10ms条件下1次脉冲完成电穿孔载药，37℃孵育30分钟；10000g离心10min除去游离的miRNA和DTIC，135000g离心2h获得载药外泌体，然后用PBS重悬，0.22μm滤膜过滤，-80℃贮存。
利用动态激光散射法测定载药外泌体的粒径和Zeta电位，采用HPLC方法测定DTIC的含量、包封率，将包裹miR-205的外泌体加入血浆中37℃孵育不同时间，采用RNA荧光(RiboGreen)定量检测试剂盒(购于上海杰美基因医药科技有限公司)测定miRNA-205的包封率以及抗血清酶解能力和稳定性，具体操作见试剂盒说明书。结果：平均粒径93±9nm，PDI 0.15；DTIC的包封率为(74.2±3.7)％；miRNA-205的包封率为(86.3±4.9)％；Cy3-miR-205抗血清酶解能力和稳定性检测结果为48小时内保持稳定。
实施例3Ap16-exosomes/(DTIC/miR-205)共载纳米给药系统的制备及体外协同抗肿瘤作用评价
(1)人恶性黑色素瘤细胞培养
人MM细胞株A375细胞、A2058细胞(购自中国科学院细胞库)，以含10％FBS、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml的MEM培养基为培养液，置37.0℃、5％CO2培养箱中培养，每日观察细胞形态和生长情况，每2日更换培养液，按常规进行消化和传代。
(2)exosomes的制备
具体操作同实施例2。
(3)Ap16-exosomes的构建和靶向性能评价
①Ap16适体的合成：参照文献【Wang CY,et al.Int J Cancer,2016,138(4):918-26】报道序列5’-AGCACTCAATATTCCC-3’(SEQ ID NO:2)，由广州市锐博生物科技有限公司合成胆固醇(Chol)修饰的适体Chol-Ap16(结构式可参见CN 101605908A的附图7)。其中，氟基团(F)取代胞嘧啶(C)碱基上的2’-羟基(OH)以增强该适体的核酸酶抗性，采用胆固醇三甘醇amidite将胆固醇结合到5’-端以增强适体的亲脂性。
②Ap16-exosomes的构建：将Chol-Ap16与exosomes按质量比1:9比例溶于PBS中，通过冻融技术实现Ap16与exosomes的结合。冻融参数是：-40℃低温冰箱快速冷冻1小时后，然后室温条件下缓慢融化，如此反复冻融2次，即得。
③体外靶向性评价：取对数生长期A375细胞，重悬至1×106/ml密度，取100μl接种到12孔板，分别加入PKH染色的Ap16-exosomes和exosomes干预，利用激光共聚焦显微镜观察细胞与适体的结合情况，评价其体外靶向性。结果(图3)表明，Ap16适体连接的外泌体具有主动靶向性，细胞具有更强的荧光强度。
(4)Ap16-exosomes/(DTIC/miR-205)共载纳米给药系统(图4)的制备及体外协同抗肿瘤作用评价
①共载纳米给药系统的制备：采用电穿孔方法分别制备Ap16-exosomes/(DTIC)、Ap16-exosomes/miR-205及Ap16-exosomes/(DTIC/miR-205)共载纳米给药系统，按下列比例：将DTIC 50μg(和/或miR-205 10nmol)、Ap16-exosomes 100μg(按蛋白浓度计算)用电穿孔缓冲液混匀(200μl反应体系)，1300V、10ms条件下1次脉冲完成电穿孔载药，37℃孵育30分钟；10000g离心10min除去游离的DTIC(和/或miRNA)，135000g离心2h获得载药外泌体，然后用PBS重悬，0.22μm滤膜过滤，-80℃贮存。
利用动态激光散射法测定载药外泌体的粒径和Zeta电位，采用HPLC方法测定DTIC的含量、包封率，将包裹miR-205的外泌体加入血浆中37℃孵育不同时间，采用RNA荧光(RiboGreen)定量检测试剂盒测定miRNA-205的包封率以及抗血清酶解能力和稳定性。结果：Ap16-exosomes/(DTIC/miR-205)平均粒径106±9nm，PDI 0.15；Zeta电位-15.7±4.7mV；DTIC的包封率为(75.6±3.9)％；miRNA-205的包封率为(85.9±4.1)％；Cy3-miR-205抗血清酶解能力和稳定性检测结果为48小时内保持稳定。
②协同抗肿瘤作用评价：体外培养人MM细胞株A375细胞、A2058细胞，分别用上述5种纳米给药系统进行干预(DTIC浓度为50、100μg/ml，miR-205浓度为10、20nmol/ml)，通过细胞增殖抑制实验、细胞凋亡实验、细胞克隆形成实验等考察DTIC和miR-205的协同作用机制。
③细胞增殖抑制实验：将处于对数生长期的人MM细胞株A375细胞或A2058细胞(3×104/ml，100μl)，接种到96孔培养板中，培养至大约90％的细胞融合时，弃去含血清培养液，PBS冲洗两遍。对照组加入不含药的无血清培养基100μl培养；其他各组加入上述5种含不同药物的exosomes和无血清培养基100μl，培养24h后予MTT检测细胞生长抑制率。结果(表1)表明，DTIC和miR-205联用，具有协同抑制A375细胞、A2058细胞等肿瘤细胞的增殖作用。
表1不同处理对细胞生长的抑制率
④细胞凋亡实验：按照上述5种不同干预措施处理培养人MM细胞株A375细胞或A2058细胞，给药后各组继续培养24h；收集细胞，采用预冷PBS缓冲液漂洗，按1×106/ml密度重悬细胞，接着取100μl细胞置于流式管中，加入Annexin V-FITC和碘化丙啶各5μl，于避光下孵育15min后采用流式细胞术检测10000个细胞，最后采用Cell Quest软件分析细胞凋亡的结果。结果(表2)表明，DTIC和miR-205联用，具有协同促进A375细胞、A2058细胞等肿瘤细胞的凋亡作用。
表2不同处理组的细胞凋亡率
⑤细胞克隆形成实验：将对数生长期细胞消化并制成单个细胞悬液，将细胞悬液以每孔200个细胞密度接种于6孔细胞培养板，细胞贴壁生长24h后吸取上清液，加入3ml无胎牛血清培养液，分成对照组、Ap16-exosomes/(DTIC)组、Ap16-exosomes/(2×DTIC)组、Ap16-exosomes/miR-205组、Ap16-exosomes/2×miR-205组、Ap16-exosomes/(DTIC/miR-205)组。当培养板中出现肉眼可见克隆时停止培养，弃培养液，PBS小心清洗2次，加甲醛固定15min后，Giemsa染色3min，流水缓慢冲去染色液，空气中干燥，倒置显微镜下计数≥50个细胞。把培养板放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数，计数＞50个细胞的克隆数。克隆形成率＝克隆数/接种细胞数×100％。结果(表3)表明，DTIC和miR-205联用，具有协同抑制A375细胞、A2058细胞等肿瘤细胞克隆形成作用，即协同降低肿瘤细胞的侵袭能力。
表3不同处理组的细胞克隆形成率
实施例4Ap16-exosomes/(DTIC/miR-205)共载纳米给药系统抗肿瘤作用的影响因素研究
发明人按照实施例3的研究路线，设置了更多的组别，以研究可能影响Ap16-exosomes/(DTIC/miR-205)共载纳米给药系统抗肿瘤作用的相关因素。其中包含以下组别：
实验组1：
①exosomes的制备：收集上海牛奶集团种奶牛场处于泌乳中期奶牛生产的牛奶，采用超速离心方法制备外泌体。具体步骤：10000g低温2℃离心40min，取上清液继续120000g低温6℃离心40min，小心分离上清液再次150000g低温2℃离心100min，弃去上清液，收集沉淀，即得外泌体exosomes。外泌体用PBS重悬，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-80℃保存备用。
②Ap16-exosomes的构建：将Chol-Ap16与exosomes按质量比(1:6)溶于PBS中，通过冻融技术实现Ap16与exosomes的结合。冻融参数是：-30℃低温冰箱快速冷冻80min后，然后室温条件下缓慢融化，如此反复冻融2次，即得。
③药物的包载：按下列比例：将DTIC 40μg、miR-205 12nmol、exosomes 80μg(按蛋白浓度计算)用电穿孔缓冲液混匀(200μl反应体系)，采用Invitrogen公司电穿孔仪，1500V、20ms条件下1次脉冲完成电穿孔载药，37℃孵育40分钟；8000g离心15min除去游离的miRNA和DTIC，120000g离心2.5h获得载药外泌体，然后用PBS重悬，0.22μm滤膜过滤，-80℃贮存。
实验组2：
①exosomes的制备：收集上海牛奶集团种奶牛场处于泌乳中期奶牛生产的牛奶，采用超速离心方法制备外泌体。具体步骤：15000g低温6℃离心20min，取上清液继续80000g低温2℃离心80min，小心分离上清液再次120000g低温6℃离心100min，弃去上清液，收集沉淀，即得外泌体exosomes。外泌体用PBS重悬，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-80℃保存备用。
②Ap16-exosomes的构建：将Chol-Ap16与exosomes按质量比(1:10)溶于PBS中，通过冻融技术实现Ap16与exosomes的结合。冻融参数是：-50℃低温冰箱快速冷冻40min后，然后室温条件下缓慢融化，如此反复冻融3次，即得。
③药物的包载：按下列比例：将DTIC 60μg、miR-205 8nmol、exosomes 120μg(按蛋白浓度计算)用电穿孔缓冲液混匀(200μl反应体系)，采用Invitrogen公司电穿孔仪，750V、10ms条件下1次脉冲完成电穿孔载药，37℃孵育20分钟；12000g离心5min除去游离的miRNA和DTIC，150000g离心1.5h获得载药外泌体，然后用PBS重悬，0.22μm滤膜过滤，-80℃贮存。
实验组3：
①exosomes的制备：收集上海牛奶集团种奶牛场处于泌乳中期奶牛生产的牛奶，采用超速离心方法制备外泌体。具体步骤：10000g低温2℃离心40min，取上清液继续120000g低温6℃离心40min，小心分离上清液再次150000g低温2℃离心100min，弃去上清液，收集沉淀，即得外泌体exosomes。外泌体用PBS重悬，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-80℃保存备用。
②Ap16-exosomes的构建：将Chol-Ap16与exosomes按质量比(1:6)溶于PBS中，通过冻融技术实现Ap16与exosomes的结合。冻融参数是：-30℃低温冰箱快速冷冻80min后，然后室温条件下缓慢融化，如此反复冻融2次，即得。
③药物的包载：按下列比例：将DTIC 60μg、miR-205 8nmol、exosomes 120μg(按蛋白浓度计算)用电穿孔缓冲液混匀(200μl反应体系)，采用Invitrogen公司电穿孔仪，750V、10ms条件下1次脉冲完成电穿孔载药，37℃孵育20分钟；12000g离心5min除去游离的miRNA和DTIC，150000g离心1.5h获得载药外泌体，然后用PBS重悬，0.22μm滤膜过滤，-80℃贮存。
实验组4：
①exosomes的制备：收集上海牛奶集团种奶牛场处于泌乳中期奶牛生产的牛奶，采用超速离心方法制备外泌体。具体步骤：10000g低温2℃离心40min，取上清液继续120000g低温6℃离心40min，小心分离上清液再次150000g低温2℃离心100min，弃去上清液，收集沉淀，即得外泌体exosomes。外泌体用PBS重悬，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-80℃保存备用。
②Ap16-exosomes的构建：将Chol-Ap16与exosomes按质量比(1:10)溶于PBS中，通过冻融技术实现Ap16与exosomes的结合。冻融参数是：-50℃低温冰箱快速冷冻40min后，然后室温条件下缓慢融化，如此反复冻融3次，即得。
③药物的包载：按下列比例：将DTIC 60μg、miR-205 8nmol、exosomes 120μg(按蛋白浓度计算)用电穿孔缓冲液混匀(200μl反应体系)，采用Invitrogen公司电穿孔仪，750V、10ms条件下1次脉冲完成电穿孔载药，37℃孵育20分钟；12000g离心5min除去游离的miRNA和DTIC，150000g离心1.5h获得载药外泌体，然后用PBS重悬，0.22μm滤膜过滤，-80℃贮存。
对比组1：
①exosomes的制备：收集上海牛奶集团种奶牛场处于泌乳盛期奶牛生产的牛奶，采用超速离心方法制备外泌体。具体步骤：13000g低温4℃离心30min，取上清液继续100000g低温4℃离心60min，小心分离上清液再次135000g低温4℃离心90min，弃去上清液，收集沉淀，即得外泌体exosomes。外泌体用PBS重悬，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-80℃保存备用。
②Ap16-exosomes的构建：将Chol-Ap16与exosomes按质量比(1:9)溶于PBS中，通过冻融技术实现Ap16与exosomes的结合。冻融参数是：-40℃低温冰箱快速冷冻1h后，然后室温条件下缓慢融化，如此反复冻融2次，即得。
③药物的包载：按下列比例：将DTIC 50μg、miR-205 10nmol、exosomes 100μg(按蛋白浓度计算)用电穿孔缓冲液混匀(200μl反应体系)，采用Invitrogen公司电穿孔仪，1300V、10ms条件下1次脉冲完成电穿孔载药，37℃孵育30分钟；10000g离心10min除去游离的miRNA和DTIC，135000g离心2h获得载药外泌体，然后用PBS重悬，0.22μm滤膜过滤，-80℃贮存。
对比组2：
①exosomes的制备：收集上海牛奶集团种奶牛场处于泌乳中期奶牛生产的牛奶，采用超速离心方法制备外泌体。具体步骤：10000g低温2℃离心40min，取上清液继续120000g低温6℃离心40min，小心分离上清液再次150000g低温2℃离心100min，弃去上清液，收集沉淀，即得外泌体exosomes。外泌体用PBS重悬，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-80℃保存备用。
②Ap16-exosomes的构建：将Chol-Ap16与exosomes按质量比(1:6)溶于PBS中，通过冻融技术实现Ap16与exosomes的结合。冻融参数是：-30℃低温冰箱快速冷冻80min后，然后室温条件下缓慢融化，如此反复冻融2次，即得。
③药物的包载：按下列比例：将DTIC 40μg、miR-205 12nmol、exosomes 80μg(按蛋白浓度计算)用电穿孔缓冲液混匀(200μl反应体系)，采用Invitrogen公司电穿孔仪，1600V、25ms条件下1次脉冲完成电穿孔载药，37℃孵育40分钟；8000g离心15min除去游离的miRNA和DTIC，120000g离心2.5h获得载药外泌体，然后用PBS重悬，0.22μm滤膜过滤，-80℃贮存。
对比组3：
①exosomes的制备：收集上海牛奶集团种奶牛场处于泌乳中期奶牛生产的牛奶，采用超速离心方法制备外泌体。具体步骤：15000g低温6℃离心20min，取上清液继续80000g低温2℃离心80min，小心分离上清液再次120000g低温6℃离心100min，弃去上清液，收集沉淀，即得外泌体exosomes。外泌体用PBS重悬，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-80℃保存备用。
②Ap16-exosomes的构建：将Chol-Ap16与exosomes按质量比(1:10)溶于PBS中，通过冻融技术实现Ap16与exosomes的结合。冻融参数是：-60℃低温冰箱快速冷冻40min后，然后室温条件下缓慢融化，如此反复冻融3次，即得。
③药物的包载：按下列比例：将DTIC 60μg、miR-205 8nmol、exosomes 120μg(按蛋白浓度计算)用电穿孔缓冲液混匀(200μl反应体系)，采用Invitrogen公司电穿孔仪，750V、10ms条件下1次脉冲完成电穿孔载药，37℃孵育20分钟；12000g离心5min除去游离的miRNA和DTIC，150000g离心1.5h获得载药外泌体，然后用PBS重悬，0.22μm滤膜过滤，-80℃贮存。
对比组4：
①exosomes的制备：收集上海牛奶集团种奶牛场处于泌乳中期奶牛生产的牛奶，采用超速离心方法制备外泌体。具体步骤：10000g低温2℃离心40min，取上清液继续120000g低温6℃离心40min，小心分离上清液再次150000g低温2℃离心100min，弃去上清液，收集沉淀，即得外泌体exosomes。外泌体用PBS重悬，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-80℃保存备用。
②Ap16-exosomes的构建：将Chol-Ap16与exosomes按质量比(1:5)溶于PBS中，通过冻融技术实现Ap16与exosomes的结合。冻融参数是：-30℃低温冰箱快速冷冻80min后，然后室温条件下缓慢融化，如此反复冻融2次，即得。
③药物的包载：按下列比例：将DTIC 60μg、miR-205 8nmol、exosomes 120μg(按蛋白浓度计算)用电穿孔缓冲液混匀(200μl反应体系)，采用Invitrogen公司电穿孔仪，750V、10ms条件下1次脉冲完成电穿孔载药，37℃孵育20分钟；12000g离心5min除去游离的miRNA和DTIC，150000g离心1.5h获得载药外泌体，然后用PBS重悬，0.22μm滤膜过滤，-80℃贮存。
各组别的载药外泌体药物包封率和稳定性测试结果(表4)显示，实验组1-4均具有较高的药物包封率和稳定性，而对比组1-4的药物包封率较低，与实验组1-4分别比较，差异均具有统计学意义(p<0.05)，对比组1-4的载药外泌体其稳定性也较差。
表4各组别载药外泌体的药物包封率和稳定性
细胞增殖抑制实验结果(表5)表明，实验组1-4对A375细胞和A2058细胞生长的抑制率均显著高于对比组1-4(p<0.05)。
表5各组Ap16-exosomes/(DTIC/miR-205)对细胞生长的抑制率
细胞凋亡实验结果(表6)表明，实验组1-4促进A375细胞和A2058细胞凋亡的作用均显著强于对比组1-4(p<0.05)。
表6各组Ap16-exosomes/(DTIC/miR-205)处理的细胞凋亡率
细胞克隆形成实验结果(表7)表明，实验组1-4抑制A375细胞和A2058细胞克隆形成的作用均显著强于对比组1-4(p<0.05)。
表7各组Ap16-exosomes/(DTIC/miR-205)处理的细胞克隆形成率
以上结果表明外泌体来源、Ap16-exosomes构建过程中Chol-Ap16与exosomes的比例和冻融参数以及药物包载过程电穿孔参数的设置对于外泌体载药率、稳定性和抗肿瘤作用存在一定的影响。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市皮肤病医院
<120> 一种靶向抗恶性黑色素瘤的达卡巴嗪和miR-205共载外泌体及其制备方法和
应用
<130> /
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
uccuucauuc caccggaguc ug 22
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agcactcaat attccc 16
Claims (10)
1.一种治疗恶性黑色素瘤的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物以达卡巴嗪和miR-205为活性成分，并含有药学上可接受的载体。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的载体为牛奶外泌体，所述的达卡巴嗪和miR-205包载于牛奶外泌体的内部。
3.一种靶向抗恶性黑色素瘤的达卡巴嗪和miR-205共载外泌体，其特征在于，所述的靶向抗恶性黑色素瘤的达卡巴嗪和miR-205共载外泌体为外部结合胆固醇修饰的核酸适体Ap16，内部包载达卡巴嗪和miR-205的牛奶外泌体。
4.根据权利要求3所述的靶向抗恶性黑色素瘤的达卡巴嗪和miR-205共载外泌体，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
a)收集处于泌乳中期奶牛生产的牛奶，采用超速离心方法制备牛奶外泌体；
b)将胆固醇修饰的核酸适体Ap16和牛奶外泌体通过冻融法实现二者的结合，构建Ap16-牛奶外泌体；
c)通过电穿孔方法完成Ap16-牛奶外泌体对达卡巴嗪和miR-205的包载。
5.根据权利要求4所述的靶向抗恶性黑色素瘤的达卡巴嗪和miR-205共载外泌体，其特征在于，步骤a)所述的采用超速离心方法制备牛奶外泌体具体为：将牛奶10000-15000g低温2-6℃离心20-40min，取上清液继续80000-120000g低温2-6℃离心40-80min，分离上清液再次120000-150000g低温2-6℃离心80-100min，弃去上清液，收集沉淀，即得。
6.根据权利要求4所述的靶向抗恶性黑色素瘤的达卡巴嗪和miR-205共载外泌体，其特征在于，步骤b)具体为：将胆固醇修饰的核酸适体Ap16与牛奶外泌体按质量比1:6～1:10溶于PBS中，-30～-50℃低温快速冷冻40-80min，然后室温条件下缓慢融化，如此反复冻融2～3次，即得。
7.根据权利要求6所述的靶向抗恶性黑色素瘤的达卡巴嗪和miR-205共载外泌体，其特征在于，所述的胆固醇修饰的核酸适体Ap16与牛奶外泌体质量比为1:9。
8.根据权利要求4所述的靶向抗恶性黑色素瘤的达卡巴嗪和miR-205共载外泌体，其特征在于，步骤c)具体为：将达卡巴嗪、miR-205和牛奶外泌体按40-60μg:8-12nmol:80-120μg的比例用电穿孔缓冲液混匀，电压750-1500V、脉冲宽度10-20ms条件下1次脉冲完成电穿孔载药，37℃孵育20-40分钟，8000-12000g离心5-15min除去游离的miRNA和达卡巴嗪，120000-150000g离心1.5-2.5h，即得。
9.权利要求3-8任一所述的靶向抗恶性黑色素瘤的达卡巴嗪和miR-205共载外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)收集处于泌乳中期奶牛生产的牛奶，采用超速离心方法制备牛奶外泌体；
b)将胆固醇修饰的核酸适体Ap16和牛奶外泌体通过冻融法实现二者的结合，构建Ap16-牛奶外泌体；
c)通过电穿孔方法完成Ap16-牛奶外泌体对达卡巴嗪和miR-205的包载。
10.权利要求3-8任一所述的靶向抗恶性黑色素瘤的达卡巴嗪和miR-205共载外泌体在制备治疗恶性黑色素瘤的药物中的应用。
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