CN115418382A - 一种提高带鱼抗疲劳肽活性的加工方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高带鱼抗疲劳肽活性的加工方法，其是将带鱼经原料预处理、动态高压微射流处理、脉冲电场辅助酶解处理、非对称流场流处理、减压真空浓缩‑真空微波间歇干燥处理。其中，动态高压微射流技术可不损害带鱼细胞中的热敏性物质和活性物质，提高蛋白的活性；脉冲电场技术辅助酶解可避免带鱼鱼肉组织的空间结构发生不可逆改变；采用非对称流场流技术能实现快速的分离且得到的物质活性高；减压真空浓缩‑微波真空间歇干燥处理能大大降低温度对于肽结构和理化性质的影响，可以更好地保持带鱼抗疲劳肽的活性。因此，按本发明方法进行加工，可最大限度地保持带鱼抗疲劳肽的活性，为带鱼活性肽产品的开发提供了一条新途径。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种提高带鱼抗疲劳肽活性的加工方法。
背景技术
带鱼是我国盛产的四大经济鱼种之一。带鱼具有一定的药用价值，我国古今医学及水产药用书籍记载，带鱼有养肝、祛风、止血等功能，适宜久病体虚、血虚头晕、气短乏力、食少赢瘦、营养不良之人食用。
近年来的研究发现，带鱼含有的疏水氨基酸为40%，其中芳香族氨基酸为18%，支链氨基酸占32.7%，支链氨基酸具有减少运动过程中血乳酸积累、延缓疲劳等重要作用，因此从带鱼中提取的生物活性肽具有缓解体力疲劳、增强肌肉力量、维持并提高运动能力等良好功效。但是生物肽的加工过程中，例如层析过程中温度、pH值以及离子强度的改变，电泳过程中添加的表面活性剂，都有可能导致肽的空间结构变化，降低肽的活性，从而造成提取的带鱼抗疲劳肽的活性低、难以被吸收利用等问题。因此，通过一种方法来提高带鱼抗疲劳肽的活性是非常有意义的。
传统的提取生物活性肽的方法主要是通过酶解法将蛋白质分解为小分子肽，之后再通过滤膜进行分离，但是发明专利“一种活性肽的制备方法和应用”（公开号CN114032267A）和发明专利“一种定向酶切技术制备小分子乳清蛋白活性肽的方法”（公开号CN 113604528A），只单纯依靠酶的作用分解蛋白质，得到的肽含量较低且活性不高，同时，滤膜分离活性肽效率低且分离过程对肽的活性无法保证。为解决这一共性问题，亟需寻求一种新的提高带鱼抗疲劳肽活性的方法。
将带鱼鱼肉进行动态高压微射流处理时，由于机器内的高压作用并结合空穴作用、剪切力和高速率，可利用细胞壁内外的压力差将带鱼鱼肉的细胞组织破裂粉碎，达到均质破碎带鱼鱼肉细胞的作用。同时该处理方式温和的操作条件对带鱼蛋白质空间结构的影响较小，不易导致蛋白质变性失活，降低了损害带鱼肽中蛋白质活性的可能，提高了带鱼抗疲劳肽的活性。利用脉冲电场技术辅助带鱼蛋白酶解，适宜的电场强度可在保证带鱼蛋白活性的前提下，使得带鱼鱼肉的细胞膜在电场作用下被击穿，促使带鱼鱼肉细胞内的蛋白质渗出，提高蛋白酶与带鱼鱼肉的接触机会，还能改变蛋白酶的结构，从而使其活性中心暴露，促使蛋白酶活性升高，增加蛋白酶的酶解率。同时该处理对带鱼鱼肉温度没有明显影响，极大避免了带鱼鱼肉组织的空间结构发生不可逆改变，进而提高带鱼抗疲劳肽的活性。通过非对称流场流来处理带鱼抗疲劳肽，能将带鱼抗疲劳肽和其他杂质高效分离，避免了带鱼抗疲劳肽与固定相的作用，能很好地保持带鱼抗疲劳肽的稳定性和三维折叠形态，实现快速的分离纯化，且得到的物质活性高。通过减压真空，带鱼抗疲劳肽中的液体可以在低温下发生沸腾汽化现象，使部分水分从液相中除去从而达到浓缩的效果。同时，与蒸发浓缩相比，减压真空浓缩处理的温度较低，带鱼抗疲劳肽的热变性小，对蛋白质结构的变性影响低，避免了营养和香气成分的损失，可以更好地保持带鱼抗疲劳肽原有的活性。浓缩后的带鱼抗疲劳肽通过真空微波间歇干燥处理，在真空环境下带鱼抗疲劳肽内水分以低温形式蒸发，大大降低了温度对于肽的结构和理化性质的影响，进一步提高了带鱼抗疲劳肽的活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高带鱼抗疲劳肽活性的加工方法，其集成原料预处理、动态高压微射流处理、脉冲电场辅助酶解处理、非对称流场流处理、减压真空浓缩-真空微波间歇干燥处理，相较于传统的活性肽提取方法，在提取、分离和干燥技术上进行改进，有效提高了带鱼抗疲劳肽的活性。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种提高带鱼抗疲劳肽活性的加工方法，其是将带鱼经原料预处理、动态高压微射流处理、脉冲电场辅助酶解处理、非对称流场流处理、减压真空浓缩-真空微波间歇干燥处理，最终得到一种高活性的带鱼抗疲劳肽；其各处理步骤的具体操作如下：
（1）原料预处理：
挑选新鲜、无变质的带鱼放入水中清洗沥干后，去除鱼鳞、鱼头、鱼尾、内脏、鱼鳍，将鱼肉经高速组织匀浆机斩拌制成带鱼鱼糜，-20℃冷藏备用；
（2）动态高压微射流处理：
将制得的带鱼鱼糜调节pH至7-8，之后在38℃-42℃、压力值为40Mpa-160Mpa的条件下高压微射流处理20min；
（3）脉冲电场辅助酶解处理：
在步骤（2）处理后的带鱼鱼糜中按1000-2000U/g的量加入中性蛋白酶，于55-65℃、pH 6.0-7.0的条件下酶解2-6h；酶解过程采用脉冲电场进行辅助，所述脉冲电场的脉冲数为8、电场强度为18kV/cm；酶解后于90℃水浴中灭酶处理10min，再冷却至室温，于4℃、10000 r/min条件下离心15 min，取上清液，即得带鱼抗疲劳肽溶液；
（4）非对称流场流处理：
将步骤（3）处理后的带鱼抗疲劳肽溶液送入非对称流场流分离仪进行纯化处理；非对称流场流的横向流速为5mL/min，进检测器的流速为0.2mL/min，聚焦时间为6min，截留膜为再生纤维素膜，缓冲盐浓度为20 mmol/L，分离腔室厚为0.35mm；
（5）减压真空浓缩-真空微波间歇干燥处理：
将步骤（4）得到的带鱼抗疲劳肽处理液于真空度-0.08Mpa的条件下60℃水浴加热浓缩至1.2g·ml-1，之后将其进行真空微波间歇干燥处理，其真空度为-0.08 Mpa，微波功率为500-700w，温度为50-70℃，干燥时间为2-4h，期间每加热30min间歇5min，至干基含水率≤7%。
本发明的显著优点在于：
（1）本发明采用动态高压微射流技术处理带鱼鱼肉，可利用细胞壁内外巨大的压力差将细胞组织中的有效成分溶出，同时其温和的操作条件不损害蛋白质的结构，能有效地保留带鱼抗疲劳肽中的营养成分，提高带鱼抗疲劳肽活性。
（2）脉冲电场辅助酶解处理，能使得带鱼鱼肉的细胞膜在电场作用下被击穿，促使带鱼鱼肉细胞内的蛋白质渗出。同时适宜的电场强度和温和的处理温度尽可能的避免了带鱼鱼肉组织的空间结构发生不可逆改变，在保证带鱼蛋白活性的前提下，对带鱼蛋白质活性进行充分保护，进而提高带鱼抗疲劳肽的活性。
（3）采用非对称流场流技术处理纯化带鱼抗疲劳肽，其温和的分离条件能实现快速的分离纯化，很好地保持肽的稳定性和三维折叠形态，有效地保留带鱼抗疲劳肽中的营养成分，提高带鱼抗疲劳肽活性，全面提升产品品质，突破现有工艺的局限性。
（4）减压真空浓缩-真空微波间歇干燥处理时温度较低，热变性小，大大降低了温度对于肽的结构和理化性质的影响，可以更好地保持带鱼抗疲劳肽原有的活性，同时还大幅度缩短干燥时间。
附图说明
图1为不同处理方式对带鱼抗疲劳肽活性的影响情况图。由图1可知，采用非对称流场流法处理得到的带鱼抗疲劳肽的活性超过70%，明显大于其他三种方法，且其与碱提酸沉法的差异最显著，该结果表明，非对称流场流处理相比于几种常见的提取活性肽的方法来说，可有效改善带鱼肽的活性。
图2为对比例与实施例所得带鱼抗疲劳肽抗疲劳作用的对比图。由图2可知，通过小鼠力竭游泳时间发现，灌胃带鱼抗疲劳肽的小鼠的肝糖原和肌糖原含量明显高于正常组和对比例组，该结果表明本发明制备的带鱼抗疲劳肽具有显著抗疲劳功效。
具体实施方式
一种提高带鱼抗疲劳肽活性的加工方法，其具体操作如下：
（1）原料预处理：
挑选新鲜、无变质的带鱼放入水中清洗沥干后，去除鱼鳞、鱼头、鱼尾、内脏、鱼鳍，将鱼肉经高速组织匀浆机斩拌制成带鱼鱼糜，-20℃冷藏备用；
（2）动态高压微射流处理：
将制得的带鱼鱼糜调节pH至7-8，之后在38℃-42℃、压力值为40Mpa-160Mpa的条件下高压微射流处理20min；
（3）脉冲电场辅助酶解处理：
在步骤（2）处理后的带鱼鱼糜中按1000-2000U/g的量加入中性蛋白酶，于55-65℃、pH 6.0-7.0的条件下酶解2-6h；酶解过程采用脉冲电场进行辅助，所述脉冲电场的脉冲数为8、电场强度为18kV/cm；酶解后于90℃水浴中灭酶处理10min，再冷却至室温，于4℃、10000 r/min条件下离心15 min，取上清液，即得带鱼抗疲劳肽溶液；
（4）非对称流场流处理：
将步骤（3）处理后的带鱼抗疲劳肽溶液送入非对称流场流分离仪进行纯化处理；非对称流场流的横向流速为5mL/min，进检测器的流速为0.2mL/min，聚焦时间为6min，截留膜为再生纤维素膜，缓冲盐浓度为20 mmol/L，分离腔室厚为0.35mm；
（5）减压真空浓缩-真空微波间歇干燥处理：
将步骤（4）得到的带鱼抗疲劳肽处理液于真空度-0.08Mpa的条件下60℃水浴加热浓缩至1.2g·ml-1，之后将其进行真空微波间歇干燥处理，其真空度为-0.08 Mpa，微波功率为500-700w，温度为50-70℃，干燥时间为2-4h，期间每加热30min间歇5min，至干基含水率≤7%。
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
（1）原料预处理：
挑选新鲜、无变质的带鱼放入水中清洗沥干后，去除鱼鳞、鱼头、鱼尾、内脏、鱼鳍，将鱼肉经高速组织匀浆机斩拌制成带鱼鱼糜，-20℃冷藏备用。
（2）动态高压微射流处理：
将步骤（1）处理的带鱼鱼糜抽吸进料，并调节pH至7，之后将物料在柱塞增压泵内增压到40Mpa，在38℃条件下高压微射流处理20min；
（3）脉冲电场辅助酶解处理：
在步骤（2）处理后的带鱼鱼糜中按1000U/g的量加入中性蛋白酶，于55℃、pH为6.0的条件下酶解2h，酶解过程采用脉冲电场进行辅助，其脉冲数为8、电场强度为18kV/cm；酶解后于90℃水浴中灭酶处理10min，再冷却至室温，于4℃、10000 r/min条件下离心15 min，取上清液，即得带鱼抗疲劳肽溶液；
（4）非对称流场流处理：
将步骤（3）处理后的带鱼抗疲劳肽溶液送入非对称流场流分离仪进行纯化处理，其横向流速为5mL/min，进检测器的流速为0.2mL/min，聚焦时间为6min，截留膜为再生纤维素膜，缓冲盐浓度为20 mmol/L，分离腔室厚为0.35mm；
（5）减压真空浓缩-真空微波间歇干燥处理：
将步骤（4）得到的带鱼抗疲劳肽处理液于真空度-0.08Mpa的条件下60℃水浴加热浓缩至1.2g·ml-1，之后将其进行真空微波间歇干燥处理，其真空度为-0.08 Mpa，微波功率为500w，温度为50℃，干燥时间为2h，期间每加热30min间歇5min，至干基含水率≤7%。
实施例2
（1）原料预处理：
挑选新鲜、无变质的带鱼放入水中清洗沥干后，去除鱼鳞、鱼头、鱼尾、内脏、鱼鳍，将鱼肉经高速组织匀浆机斩拌制成带鱼鱼糜，-20℃冷藏备用。
（2）动态高压微射流处理：
将步骤（1）处理的带鱼鱼糜抽吸进料，并调节pH至8，之后将物料在柱塞增压泵内增压到160Mpa，在42℃条件下高压微射流处理20min；
（3）脉冲电场辅助酶解处理：
在步骤（2）处理后的带鱼鱼糜中按2000U/g的量加入中性蛋白酶，于65℃、pH为7.0的条件下酶解6h，酶解过程采用脉冲电场进行辅助，其脉冲数为8、电场强度为18kV/cm；酶解后于90℃水浴中灭酶处理10min，再冷却至室温，于4℃、10000 r/min条件下离心15 min，取上清液，即得带鱼抗疲劳肽溶液；
（4）非对称流场流处理：
将步骤（3）处理后的带鱼抗疲劳肽溶液送入非对称流场流分离仪进行纯化处理，其横向流速为5mL/min，进检测器的流速为0.2mL/min，聚焦时间为6min，截留膜为再生纤维素膜，缓冲盐浓度为20 mmol/L，分离腔室厚为0.35mm；
（5）减压真空浓缩-真空微波间歇干燥处理：
将步骤（4）得到的带鱼抗疲劳肽处理液于真空度-0.08Mpa的条件下60℃水浴加热浓缩至1.2g·ml-1，之后将其进行真空微波间歇干燥处理，其真空度为-0.08 Mpa，微波功率为700w，温度为70℃，干燥时间为4h，期间每加热30min间歇5min，直至干基含水率≤7%。
对比例1
不进行步骤（4）非对称流场流处理，其余操作同实施例1。
对比例2
步骤（3）在不采用脉冲电场辅助的条件下进行酶解处理，其余操作同实施例1。
对实施例及对比例所得带鱼抗疲劳肽的得率、多肽含量及分子量大小进行测定，测定方法如下：
得率（%）=带鱼抗疲劳肽的质量（g）/带鱼鱼糜的质量（g）×100%。
带鱼抗疲劳肽中多肽含量的测定采用双缩脉法，其是取12支试管，分两组，各组分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的10g/L牛血清标准蛋白质溶液，用水补足到1mL，然后加入4mL双缩脉试剂，充分摇匀后，在室温（20-25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定，并以蛋白质的含量为横坐标，OD 540nm为纵坐标绘制标准曲线（用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液，每一浓度取两组测定的平均值）。另取一定量带鱼抗疲劳肽样品，加水配制成20g/L溶液，然后取0.5mL，用水补足到1mL，加入4mL双缩脲试剂；以装有空白溶液的试管为对照，在540nm下测定吸光值，测定三次，取平均值，然后根据绘制的标准曲线，求出待测样品的多肽含量。
采用凝胶渗透色谱法（GPC）测定分子量，使用凝胶渗透色谱系统，色谱柱为PLgel8um aquagel-OH Mixed-M（7.5×300mm），检测器为示差折光检测器，以超纯水及0.1MNaNO3作为流动相，流速1mL/min，单次进样量为100μL。将样品加水配制成溶液，置于加热搅拌器中，50℃下加热1h后过滤，调节仪器至进样状态，待仪器稳定、记录仪基线呈直线状态后，将标准品和过滤后的样品溶液用微量进样器快速进样，上样后绘制保留时间与浓度响应的标准曲线并以此进行测试，观察色谱峰的出峰情况，测试结束后通过数据分析得到样品的分子量。
上述测定结果见表1。
表1 不同处理方式对带鱼抗疲劳肽品质的影响
由表1可知，实施例所得带鱼抗疲劳肽的分子量均小于对比例，得率及多肽含量均大于对比例，且对比例与实施例均具有显著性差异。该结果表明，通过脉冲电场辅助酶解处理和非对称流场流处理可有效改善带鱼抗疲劳肽的得率，降低带鱼抗疲劳肽分子量大小，更有利于人体胃肠道吸收带鱼抗疲劳肽。
对实施例及对比例所得带鱼抗疲劳肽的抗氧化活性进行测定，其测定方法如下：
·OH清除率的测定：取5mmol/L的邻二氮菲溶液1mL于试管中，依次加入0.2mo1/L磷酸盐缓冲液(pH7.4) 2 mL，蒸馏水1mL，5mmol/L硫酸亚铁溶液1mL，充分混匀，加0.1%的H2O2 1 mL，于37℃下恒温反应60min，于536nm处测其吸光度AP。然后以1mL蒸馏水代替前步中加入的H2O2，测得吸光度Ab；再用样品溶液1mL代替前步中加入的H2O2，测得吸光度AS，通过如下公式计算得出·OH清除率，每个样品重复3次，求平均值：
·OH清除率（%）=（As-Ap）/（Ab-Ap）×100%。
ABTS+清除率的测定：用蒸馏水配制7mmo1/L的ABTS溶液和140mmol/L的过硫酸钾溶液，分别取20mLABTS溶液和352μL的过硫酸钾溶液混合过夜后，用乙醇将混合溶液稀释至吸光值OD734为0.700±0.005，备用。取0.5mL样品待测液，加入2mL ABTS工作液，室温下反应一定时间后，在420nm下测定吸光值(A)；以蒸馏水代替样品作为空白对照(A')，以0.5mL样品液与2mL蒸馏水混合作为样品校正液(Ao)，之后通过如下公式计算得出ABTS+清除率，每个样品重复3次，求平均值：
ABTS+清除率（%）=[1-（A-A0）/A']×100%。
DPPH自由基清除率的测定：称取DPPH试剂12.80mg，用50%乙醇溶解，转入50mL容量瓶中定容，摇匀得浓度为256.1mg/L的DPPH储备液，置于冰箱中备用，使用前用50%乙醇溶液稀释至浓度为25.61mg/L。将DPPH·溶液室温下静置10min后，加入样品待测液2mL，摇匀，放置一定时间，以乙醇调零，测定517nm处吸光度Ai。测定2mL DPPH溶液与2mL 50%乙醇溶液在517nm处吸光度A0，测定2mL样品待测液与2mL 50%乙醇溶液在517nm处吸光度Aj，之后通过如下公式计算得出DPPH自由基清除率，每个样品重复3次，求平均值：
DPPH自由基清除率（%）=（1-（Ai-Aj）/A0）×100%。
O2 -·清除率的测定：取50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.2) 4.5mL，加入1.0mL样品液，3.2mL去离子水，混匀后25℃水浴保温20min，取出后立即加入在25℃水浴中预热的3mmol/L几邻苯三酚0.3 mL(以10 mmol/L HCl代替邻苯三酚作为空白)，混匀后立即倒入比色杯，于325nm处每隔30s测吸光度，共测5min，计算样品液吸光度随时间的变化率Fx。依上法，以4.2mL去离子水代替样品液，计算对照溶液吸光度随时间的变化率Fo，之后通过如下公式计算得出O2 -·清除率，每个样品重复3次，求平均值：
O2 -·清除率（%）=（Fo-Fx）/Fo×100%。
上述抗氧化活性测定结果见表2。
表2 不同处理方式对带鱼抗疲劳肽抗氧化活性的影响
由表2可知，实施例带鱼抗疲劳肽抗氧化活性的四种指标均大于对比例，且对比例与实施例均具有显著性差异，说明通过冲电场辅助酶解处理非对称流场流处理带鱼抗疲劳肽的活性得到了有效的改善。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (5)
1.一种提高带鱼抗疲劳肽活性的加工方法，其特征在于，将带鱼经原料预处理、动态高压微射流处理、脉冲电场辅助酶解处理、非对称流场流处理、减压真空浓缩-真空微波间歇干燥处理，最终得到一种高活性的带鱼抗疲劳肽。
2.根据权利要求1所述的一种提高带鱼抗疲劳肽活性的加工方法，其特征在于，各处理步骤具体操作如下：
（1）原料预处理：
挑选新鲜、无变质的带鱼放入水中清洗沥干后，去除鱼鳞、鱼头、鱼尾、内脏、鱼鳍，将鱼肉经高速组织匀浆机斩拌制成带鱼鱼糜，-20℃冷藏备用；
（2）动态高压微射流处理：
将制得的带鱼鱼糜调节pH至7-8，之后在38℃-42℃、压力值为40Mpa-160Mpa的条件下高压微射流处理20min；
（3）脉冲电场辅助酶解处理：
在步骤（2）处理后的带鱼鱼糜中按1000-2000U/g的量加入中性蛋白酶，于55-65℃、pH6.0-7.0的条件下酶解2-6h，酶解过程采用脉冲电场进行辅助；酶解后于90℃水浴中灭酶处理10min，再冷却至室温，于4℃、10000 r/min条件下离心15 min，取上清液，即得带鱼抗疲劳肽溶液；
（4）非对称流场流处理：
将步骤（3）处理后的带鱼抗疲劳肽溶液送入非对称流场流分离仪进行纯化处理；
（5）减压真空浓缩-真空微波间歇干燥处理：
将步骤（4）得到的带鱼抗疲劳肽处理液于真空度-0.08Mpa的条件下60℃水浴加热浓缩至1.2g·ml-1，之后将其进行真空微波间歇干燥处理，至干基含水率≤7%。
3.根据权利要求2所述的一种提高带鱼抗疲劳肽活性的加工方法，其特征在于，步骤（3）所述脉冲电场的脉冲数为8、电场强度为18kV/cm。
4. 根据权利要求2所述的一种提高带鱼抗疲劳肽活性的加工方法，其特征在于，步骤（4）非对称流场流的横向流速为5mL/min，进检测器的流速为0.2mL/min，聚焦时间为6min，截留膜为再生纤维素膜，缓冲盐浓度为20 mmol/L，分离腔室厚为0.35mm。
5. 根据权利要求2所述的一种提高带鱼抗疲劳肽活性的加工方法，其特征在于，步骤（5）所述真空微波间歇干燥处理的真空度为-0.08 Mpa，微波功率为500-700w，温度为50-70℃，干燥时间为2-4h，期间每加热30min间歇5min。
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