CN115372524A

CN115372524A - 一种萃取牛乳中氯霉素残留的方法及其应用

Info

Publication number: CN115372524A
Application number: CN202211207889.1A
Authority: CN
Inventors: 尹蔓妮; 熊欣; 陈伟; 王玉英; 谷名育; 江友娅; 郭宇逍; 薛艾莲; 张凤; 袁峰
Original assignee: Chongqing Tianyou Dairy Co Ltd
Current assignee: Chongqing Tianyou Dairy Co Ltd
Priority date: 2022-09-30
Filing date: 2022-09-30
Publication date: 2022-11-22

Abstract

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种萃取牛乳中氯霉素残留的方法及其应用。该萃取牛乳中氯霉素残留的方法包括使用低共熔溶剂与牛奶混合进行萃取，低共熔溶剂由四丁基溴化铵和正辛醇组成，四丁基溴化铵与正辛醇的物质量比例为1：(2‑3)。该萃取牛乳中氯霉素残留的方法操作简便；而且基于该萃取牛乳中氯霉素残留的方法的检测牛乳中氯霉素残留的检测回收率可以达到60％以上，回收率高，检测限可以达到1ug/L，灵敏度高。

Description

一种萃取牛乳中氯霉素残留的方法及其应用

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种萃取牛乳中氯霉素残留的方法及其应用。

背景技术

近年来，牛乳食品安全备受关注。氯霉素是一种广谱抗生素，由于价格低廉被广泛应用于预防和治疗细菌性疾病，但其易在动物中残留。比如在奶牛中的残留，奶牛中残留的氯霉素可以通过牛乳或牛乳食品进入人体，残留的氯霉素能抑制人体骨髓造血功能，减少血细胞的数量，引起再生障碍性贫血等，对人体伤害较大。而且我国规定了食品动物中禁止使用氯霉素，因此对牛乳中的氯霉素残留进行检测是有必要的。

目前牛乳中氯霉素残留的检测方法主要有微生物法、免疫分析法和色谱分析法等。但是在氯霉素检测分析之前大多都需要从样品中进行萃取，再进行检测。现有萃取方法通常是使用毒性强且挥发性大的有机溶剂进行萃取，易对人体和环境造成伤害。比如公开号为 CN112180015A的专利，公开了一种检测牛奶中抗生素的方法，该专利中的萃取方法包括：准确称取待测样品至聚丙烯离心管中，加入表面活性剂的水溶液，漩涡震荡后超声再离心，取上清液；所述表面活性剂为酯基季铵盐阳离子表面活性剂；取上清液加入萃取溶剂(四氯化碳和乙酸乙酯的混合溶剂)中，漩涡振荡离心，取所得萃取液层减压蒸馏去除溶剂，再加超纯水稀释混匀，经滤膜过滤，得待测样品溶液。该专利中使用了四氯化碳和乙酸乙酯作为萃取溶剂，四氯化碳具有很强的毒性且易挥发，会对人体和环境造成伤害；而且该专利中还使用了减压蒸馏，操作复杂。

因此，一种在保证萃取率的基础上，并且低毒且操作比较简便的萃取方便是有必要的。

发明内容

针对以上问题，本发明目的之一在于提供一种萃取牛乳中氯霉素残留的方法，该方法是通过由四丁基溴化铵和正辛醇组成的低共熔溶剂进行萃取，萃取率高，且低毒和操作比较简便。

为了达到上述目的，本发明可以采用以下技术方案：

本发明一方面提供一种萃取牛乳中氯霉素残留的方法，包括使用低共熔溶剂与牛奶混合进行萃取，低共熔溶剂由四丁基溴化铵和正辛醇组成，四丁基溴化铵与正辛醇的物质量比例为1：(2-3)。

本发明另一方面提供一种检测牛乳中氯霉素残留的方法，其包括先使用上述的萃取牛乳中氯霉素残留的方法从牛乳中萃取氯霉素，然后使用液相色谱和质谱联用的方法进行检测。

本发明有益效果包括：

(1)本发明提供的萃取牛乳中氯霉素残留的方法不需要减压蒸馏等操作步骤，仅进行常规的混合、震荡、离心和过滤即可，操作比较简便，而且低毒，对人体的健康威胁小；

(2)本发明提供的检测牛乳中氯霉素残留的方法基于本发明中的萃取牛乳中氯霉素残留的方法，检测回收率可以达到60％，回收率高，而且检测限可以达到1ug/L，灵敏度高。

附图说明

图1为萃取过程中用不同种类溶剂对牛乳样品中氯霉素进行萃取优化的结果；其中， DES-1为四丁基溴化铵(氢键受体)：正辛醇(氢键供体)物质量之比1:2的低共熔溶剂；DES-2 为四丁基溴化铵(氢键受体)：正辛醇(氢键供体)物质量之比1:3的低共熔溶剂；

图2为萃取过程中低共熔溶剂用量优化的结果；

图3为萃取过程中超声时间优化的结果；

图4为萃取过程中氯化钠用量优化结果。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。

本发明实施例提供一种萃取牛乳中氯霉素残留的方法，包括使用低共熔溶剂与牛奶混合进行萃取，低共熔溶剂由四丁基溴化铵和正辛醇组成，四丁基溴化铵与正辛醇的摩尔比为1： (2-3)。需要说明的是，疏水性低共熔溶剂是近年来备受关注的一种新型溶剂，它主要由两种或两种以上化合物以氢键连接的方式组成，包括氢键供体和氢键受体，具有低毒、萃取性能好、制备过程简单、价格低廉等优点因此被用来做液-液微萃取的溶剂。另外，应当理解的是，本发明中的低共熔溶剂是四丁基溴化铵和正辛醇加热制备而成的澄清溶液，加热的方式为本领域所已知的方式，比如水浴，加热的温度为60°。还需要说明的是，当四丁基溴化铵与正辛醇的摩尔比为1:1和2:3均不能形成澄清溶液；另外，根据单一正丁醇单独萃取的氯霉素回收率太低，1:3低于1:2，即1:3已经是过量反应，1:4的回收率低于1：2和1:3。因此本发明中选择1：(2-3)，当选择1：(2-3)，氯霉素的回收率可以达到60％以上，优选1:2，氯霉素的回收率可以达到65％以上。

在一些具体实施例中，上述萃取牛乳中氯霉素残留的方法中，牛奶与低共熔溶剂的体积比可以为1：(0.1-0.5)。需要说明的是，调整牛奶与低共熔溶剂的体积比会影响氯霉素的回收率当牛奶与低共熔溶剂的体积比低于1：0.1时，混合后的溶液粘度比较大，影响萃取，而且氯霉素的回收率比较低；当牛奶与低共熔溶剂的体积比大于1：0.5时，氯霉素的回收率也比较低。在本发明中牛奶与低共熔溶剂的体积比为1：(0.1-0.5)时，氯霉素的回收率可以达到 60％以上，其中，优选牛奶与低共熔溶剂的体积比为1:0.25，在此比例下，氯霉素的回收率可以达到约70％。

在一些具体实施例中，上述萃取牛乳中氯霉素残留的方法中，低共熔溶剂、牛奶和氯化钠混合后，超声，离心，加乙腈取上层，震荡，离心，加入水后取下层过滤。需要说明的是，超声，离心和震荡均为本领域中的常规操作。

在一些具体实施例中，上述萃取牛乳中氯霉素残留的方法中，震荡可以为使用QuEChER进行震荡。具体地，QuEChER是一种多残留(Quick)、简单(Easy)、便宜(Cheap)、高效(Effect)、耐用(Rugged)和安全(Safe)的前处理方法，主要是利用吸附剂填料(PSA和C18)与样品基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的；其中N-丙基乙二胺(PSA)主要除去极性干扰物，包括糖类等等，C18主要除去非极性干扰物，包括脂类、固醇等。

在一些具体实施例中，上述萃取牛乳中氯霉素残留的方法中，超声时间为5min-15min，比如7min、10min或12min等。需要说明的是，超声的目的是促进溶液充分接触；超声时间的长短也会影响氯霉素的回收率，在5min-15min之间，氯霉素的回收率可以达到60％以上，时间太短(低于5min)回收率太低，时间太长(高于15min)，回收率下降且实验过程长，其中，优选10min，在保障氯霉素的回收率的基础下，实验时间合理。

在一些具体实施例中，上述萃取牛乳中氯霉素残留的方法中，氯化钠的浓度为0.3g/ml-0.6g/ml，比如0.4g/ml或0.5g/ml等。需要说明的是，氯化钠的作用是促使乳制品与低共熔溶剂更好地分层；另外，氯化钠的浓度太低(低于0.3g/ml)，氯霉素的回收率太低；氯化钠的浓度高于0.6g/ml后，氯霉素的回收率变化不大；所以本发明中选择氯化钠的浓度为0.3g/ml-0.6g/ml，优选0.4g/ml，氯霉素的回收率可以达到约68％。

本发明另实施例提供一种检测牛乳中氯霉素残留的方法，其包括先使用上述的萃取牛乳中氯霉素残留的方法从牛乳中萃取氯霉素，然后使用液相色谱和质谱联用的方法进行检测。需要说明的是，将氯霉素残留从牛乳中萃取出来后，也可以使用其他的检测方法进行检测，微生物法和免疫分析法等；优选本发明中的液相色谱和质谱联用的方法。在上述的萃取牛乳中氯霉素残留的方法的基础上，然后使用液相色谱和质谱联用，检出限可以达到1ug/L，检测灵敏度高，且操作比较简单。

在一些具体实施例中，上述检测牛乳中氯霉素残留的方法中，液相色谱的洗脱程序包括： 0≤t≤1min，90％A，10％B；1＜t≤6min，50％A，50％B；6＜t≤8min，90％A，10％B；其中A为水，B为乙腈。需要说明的是，水和乙腈为高效液相色谱的流动相。

在一些具体实施例中，上述检测牛乳中氯霉素残留的方法中，液相色谱条件可以为：色谱柱：C18(150mm×2.1mm，粒径5μm)，流速：0.2mL/min，柱温：30℃，进样量20μL，运行时间：8min，流动相A为水，B为色谱乙腈；洗脱模式为0-1min，10％B，1-2min，50％B， 2-6min，50％B，6-7min，10％B，7-8min，10％B；质谱条件可以为：多反应监测，ESI负离子扫描，电离电压：4.5kV，雾化温度：450℃，锥孔气流速：50L/h，雾化气流速50L/h，驻留时间：0.3s；氯霉素定性离子对m/z：321/151.6，321/256.8，定量离子对m/z：321/151.6，锥孔电压：60V，碰撞电压：24V，16V。

为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。

以下实施例中，疏水性低共熔溶剂的制备步骤为：将四丁基溴化铵和正辛醇按一定比例混合均匀，60℃水浴加热30min搅拌得澄清透明液体，冷却后等疏水性低共熔溶剂。

以下实施例中，液相色谱条件为：色谱柱：C18(150mm×2.1mm，粒径5μm)，流速：0.2mL/min，柱温：30℃，进样量20μL，运行时间：8min，流动相A为水，B为色谱乙腈；洗脱程序为0-1min，10％B，1-2min，50％B，2-6min，50％B，6-7min，10％B，7-8min， 10％B。

以下实施例中，质谱条件为：多反应监测，ESI负离子扫描，电离电压：4.5kV，雾化温度：450℃，锥孔气流速：50L/h，雾化气流速50L/h，驻留时间：0.3s；氯霉素定性离子对 m/z：321/151.6，321/256.8，定量离子对m/z：321/151.6，锥孔电压：60V，碰撞电压：24V， 16V。

以下实施例中，样品的萃取、检测和计算按照以下步骤进行：

(一)样品萃取和检测

(1)取牛乳加标样品1mL加入低共熔溶剂0.25mL(四丁基溴乙胺-正辛醇)，0.2g氯化钠，涡旋混合后，超声萃取，离心；

(2)离心后加入乙腈，样品在下相，低共熔溶剂和乙腈在上相，用注射器吸出上层溶液加入QuEChER(25mg C18和25mg PSA)震荡净化处理；

(3)取出溶剂加入水定容至10mL，离心分层后取下层(水和乙腈混合相)过0.45μm滤膜后使用高效液相色谱质谱联用仪进行分析得分析结果。

(二)建立标准曲线

称取氯霉素标准物质10mg，以甲醇为溶剂配制标准溶液储备液(-20℃避光保存)，将标准储备液用10％乙腈水稀释得到标准曲线工作溶液；用高效液相色谱质谱仪对标准曲线工作溶液进行检测分析，以标准工作溶液标准物质浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，氯霉素标准曲线回归方程为回归方程y＝9286.3x+1303.9，其中R²大于0.999，线性范围 0.1-100μg/L，方法检出限为1ug/L。

(三)氯霉素回收率计算

将步骤(1)所得样品液相色谱图氯霉素特征峰峰面积带入标准曲线中，计算加标样品中氯霉素的回收率。

实施例1四丁基溴乙胺-正辛醇比例试验

将上述样品的萃取、检测和计算的方法中，加标量为20ug/L低共熔溶剂换成正丁醇和乙腈，超声萃取时间设置为10min，其他步骤按照上述样品的萃取、检测和计算的方法进行检测；

将将上述样品的萃取、检测和计算的方法中的四丁基溴乙胺与正辛醇的摩尔比分别设置为1:2和1:3，超声萃取时间设置为10min，其他步骤按照上述样品的萃取、检测和计算的方法进行检测和计算。

以上检测和计算结果如图1所示，其中，不同摩尔比低共熔溶剂对氯霉素的回收率优于正丁醇和乙腈，摩尔比为1:2的低共熔溶剂比其它摩尔比具有更高的萃取效率。因此优选四丁基溴化铵-正辛醇最佳摩尔比为1:2。

实施例2牛奶和与低共熔溶剂比例试验

将上述样品的萃取、检测和计算的方法中，加标量为20ug/L，低共熔溶剂中的四丁基溴乙胺与正辛醇的摩尔比设置为1:2，超声萃取时间设置为10min，采用不同体积(0.05ml、0.1 mL、0.25mL、0.5mL、0.75mL和1mL)低共熔溶剂，其他步骤按照上述样品的萃取、检测和计算的方法进行检测和计算。

检测和计算结果如图2所示，随着低共熔溶剂的体积增大，氯霉素的回收率先增大后减小，其中，0.1mL、0.25mL和0.5mL用量的回收率均能达到60％以上，其中用量为0.25mL时，氯霉素的回收率可以达到约70％。

实施例3不同萃取时间试验

将上述样品的萃取、检测和计算的方法中，加标量为2ug/L，低共熔溶剂中的四丁基溴乙胺与正辛醇的摩尔比设置为1:2，低共熔溶剂设置为0.25mL，设置不同萃取时间(5min， 10min，15min)，其他步骤按照上述样品的萃取、检测和计算的方法进行检测和计算。

检测和计算结果如图3所示，随着超声时间的增加，氯霉素的回收率先增大后减小，其中萃取时间设置10min时，回收率可以达到约70％。

实施例4不同氯化钠用量试验

将上述样品的萃取、检测和计算的方法中，加标量为2ug/L，低共熔溶剂中的四丁基溴乙胺与正辛醇的摩尔比设置为1:2，低共熔溶剂设置为0.25mL，萃取时间设置为10min，设置不同氯化钠用量(0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g、0.6g、0.7g和0.8g)，其他步骤按照上述样品的萃取、检测和计算的方法进行检测和计算。

检测和计算结果如图4所示，氯霉素的回收率随着氯化钠的用量先升高后降低，至0.6g 以后，回收率变化不大均保持在约62％以上，其中添加量为0.4g的时候，回收率最高，能达到约68％。

实施例5确定方法检出限

将上述样品的萃取、检测和计算的方法中的低共熔溶剂中的四丁基溴乙胺与正辛醇的摩尔比设置为1:2，低共熔溶剂设置为0.25mL，萃取时间设置为10min，设置三组加标浓度(1 ug/L、2ug/L和10ug/L)，其他步骤按照上述样品的萃取、检测和计算的方法进行检测和计算，所有样品一式三份。检测结果如表1所示。

表1不同加标浓度的回收率

从上表1可知，氯霉素在样品中的浓度为1ug/L-10ug/L时，均具有较好的回收率，此方法的检出限为1ug/L。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。

Claims

1.一种萃取牛乳中氯霉素残留的方法，其特征在于，包括使用低共熔溶剂与牛奶混合进行萃取，低共熔溶剂由四丁基溴化铵和正辛醇组成，四丁基溴化铵与正辛醇的物质量比例为1：

(2-3)。

2.根据权利要求1所述的萃取牛乳中氯霉素残留的方法，其特征在于，牛奶与低共熔溶剂的体积比为1：(0.1-0.5)。

3.根据权利要求2所述的萃取牛乳中氯霉素残留的方法，其特征在于，牛奶与低共熔溶剂的摩尔比为1：0.25。

4.根据权利要求1、2或3所述的萃取牛乳中氯霉素残留的方法，其特征在于，低共熔溶剂、牛奶和氯化钠混合后，超声，离心，加乙腈取上层，震荡，离心，加入水后取下层过滤。

5.根据权利要求4所述的萃取牛乳中氯霉素残留的方法，其特征在于，震荡为使用QuEChER进行震荡。

6.根据权利要求4所述的萃取牛乳中氯霉素残留的方法，其特征在于，氯化钠的浓度为0.3g/ml-0.6g/ml。

7.根据权利要求4或6所述的萃取牛乳中氯霉素残留的方法，其特征在于，超声时间为5min-15min。

8.一种检测牛乳中氯霉素残留的方法，其特征在于，包括：先使用权利要求1至7中任一所述的萃取牛乳中氯霉素残留的方法从牛乳中萃取氯霉素，然后使用液相色谱和质谱联用的方法进行检测。

9.根据权利要求8所述的检测牛乳中氯霉素残留的方法，其特征在于，液相色谱的洗脱程序包括：0≤t≤1min，90％A，10％B；1＜t≤6min，50％A，50％B；6＜t≤8min，90％A，10％B；其中A为水，B为乙腈。