CN115362939B

CN115362939B - 绒毛狼尾草组织培养方法及应用

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Publication number: CN115362939B
Application number: CN202211322714.5A
Authority: CN
Inventors: 邓国宾; 杨军文; 曾祥飞; 赵露琴; 李佳康; 董丽秀; 张文娟; 邓重梨
Original assignee: Yunnan Plant Insect Medicine Biotechnology Co ltd; Southwest Forestry University
Current assignee: Yunnan Plant Insect Medicine Biotechnology Co ltd; Southwest Forestry University
Priority date: 2022-10-27
Filing date: 2022-10-27
Publication date: 2023-01-24
Anticipated expiration: 2042-10-27
Also published as: CN115362939A

Abstract

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体来说是绒毛狼尾草组织培养方法及应用，步骤包括：外植体选择与清洗；洗净外植体转移至超净工作台，依次用酒精、饱和漂白粉溶液、升汞溶液消毒；消毒好外植体剪去两端伤口，接种于丛生芽诱导培养基中光暗交替下培养；诱导出丛生芽剪成单芽，接种于丛生芽增殖培养基中光暗交替下培养；增殖丛生芽剪成单芽，接种于丛生芽生根培养基中光暗交替下培养，后转移至室温培养。本发明方法目前在火焰狼尾草以及紫叶狼尾草我国引进的两个园艺栽培变种均能通用。

Description

绒毛狼尾草组织培养方法及应用

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体来说是绒毛狼尾草组织培养方法及应用。

背景技术

绒毛狼尾草（Pennisetum setaceum）为禾本科狼尾草属多年生草本植物，原产于北非，具有喜光，耐高温，耐寒，耐旱以及耐贫瘠，但不耐荫蔽等特性，在黏土、砂土、酸性土或弱碱性土等都能较好的生长，且生长健壮，同时由于其养护管理简单、具有景观效果、自然质朴等特性，而各园艺栽培变种具有株型优美、花絮美丽等优点，深受园艺学家及园林设计师的青睐。

目前我国引进的绒毛狼尾草园艺栽培变种主要有火焰狼尾草、紫叶狼尾草两种，由于绒毛狼尾草大部分园艺栽培种具有不结实的特性，因此其不能进行种子繁殖，使得目前绒毛狼尾草主要靠分株繁殖，但分株繁殖存在繁殖系数低、繁殖周期长、病虫害积累、长期分株易导致品种退化等缺点。

近年来，我国各科研院所及企业，逐步开展了绒毛狼尾草品种的组培技术研究，但现有技术均存在在不同园艺栽培变种间不能互用的缺点，同时即使在原栽培种下，亦存在消毒技术欠佳、增殖系数低、驯化成活率低等缺点。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，特发明了一种绒毛狼尾草的组织培养方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种绒毛狼尾草组织培养方法，所述绒毛狼尾草为火焰狼尾草或紫叶狼尾草，包括如下步骤：

（1）外植体选择与清洁：选择绒毛狼尾草茎段，将其剪成2～3cm具芽小段，用自来水洗净表面泥土，后滴加4～5滴洗洁精，涮洗10～15min，后用自来水洗去表面洗洁精；

（2）外植体消毒：洗净外植体转移至超净工作台，用75%酒精消毒15～20s，无菌水涮洗2～3次，饱和漂白粉溶液消毒15～20min，无菌水涮洗4～5次，0.05%升汞溶液消毒10～11min，无菌水涮洗7～8次；

（3）丛生芽诱导：消毒好外植体用无菌纸吸去表面水分，并剪去两端伤口，接种于N6+NAA 0.2～0.3mg/L+2,4-D 0.02～0.04mg/L+TDZ 1.0～1.5mg/L+2-IP 0.1～0.2mg/L+活性炭 0.5g/L的丛生芽诱导培养基中，在温度25±2℃，每日照光12h，光强2000～3000lx的光暗交替下培养30～35天；

（4）丛生芽增殖：诱导出丛生芽剪成单芽，接种于改良N6+NAA 0.1～0.2mg/L+TDZ0.5～0.8mg/L+CPPU 0.2～0.3mg/L+香蕉泥 50～60g/L的丛生芽增殖培养基中，在温度25±2℃，每日照光12h，光强2000～3000lx的光暗交替下培养25～30天；

（5）丛生芽生根：增殖丛生芽剪成单芽，接种于改良N6+NAA 0.4～0.5mg/L+IBA0.5～0.8mg/L+KT 0.5～0.8mg/L+GA3 0.3～0.5mg/L+椰汁40～50ml/L+活性炭 0.5g/L的丛生芽生根培养基中，在温度25±2℃，每日照光12h，光强3000～4000lx的光暗交替下培养15～20天，后转移至遮阴率80%左右的日光下室温培养5～10天。

上述所述N6培养基为在原N6的基础上，硝酸钾改为165mg/L，磷酸二氢钾改为50mg/L，硫酸铵改为70mg/L，氯化钙改为20mg/L，同时添加脯氨酸200mg/L，其余物质不变。

本发明的有益技术效果是：

1.本发明方法在无菌体系建立时，消毒污染率及消毒死亡率低，各消毒剂对未死亡的外植体产生药害极小，同时，极佳的生长素及细胞分裂素的有效搭配，使得初代诱导率极高。

2.本发明在继代增殖时采用高NAA与高效细胞分裂素CPPU以及TDZ的有效搭配，在添加适当浓度的香蕉泥，可使增殖系数提高至近10，增殖周期为30天，同时由于香蕉泥的添加，丛生芽极其健壮，不需要进行壮苗即可直接生根。

3.本发明在生根培养时，进行了NAA和IBA的有效搭配，使得20天生根率即可达到100%，同时由于在生根培养基中添加了一定浓度的KT、GA3以及椰汁，一方面提高了驯化时的存活率，另一方面提高了驯化时的丛芽率及单株丛芽数，降低了单位面积的栽植数量。

4. 本发明在继代增殖及生根培养时，均采用了改良N6培养基（图2），能有效避免白化现象的发生，同时，由于脯氨酸的添加，还能使其在增殖时分蘖能力增加，从而使增殖系数提高。N6培养基为我国研究人员发明的禾谷类高效培养基，亦为禾本科组培常用的基本培养基，其在小麦、玉米上应用极其广泛，但在绒毛狼尾草组培时，不论是采用MS培养基还是采用N6培养基，在培养过程均极易产生白化等现象（图1），而白化苗在瓶内可正常生长，但移栽后几乎不能成活。

5.本发明方法目前在火焰狼尾草（Pennisetum setaceum ‘Fire Works’）以及紫叶狼尾草（Pennisetum setaceum Chiovendacv. ‘Rubrum’）我国引进的两个园艺栽培变种均能通用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是使用没有改良的N6作为基本培养基培养的绒毛狼尾草组培苗结果图，图中狼尾草组培苗白化及其严重；

图2是试验例1步骤3有机物对去白化现象时苗状态改变试验组Y8培育结果图；

图3是实施例1中增殖培养结果图片；

图4是实施例1中生根培养结果图片。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

试验例1绒毛狼尾草去白化现象的试验

1、植物生长调节剂对白化现象的影响试验

在进行增殖培养研究时，进行了各类生长素和细胞分裂素，在不同浓度下进行组合，发现不论怎么组合，各类组合的植物生长调节剂均会导致较严重的白化现象，而白化的发生率与增殖系数呈负相关，即，增殖系数愈低，白化现象愈严重，繁殖，则白化现象愈轻。

猜测可能与无机盐积累有关。

2、无机盐对白化现象的影响试验

分别对无机盐中的大量元素进行浓度降半研究试验，发现浓度降半后白化现象有明显改善，但仍还是有很大程度的白化现象，于是继续进行大量元素浓度再降低试验，发现，当降低硝酸钾、硫酸铵、磷酸二氢钾以及氯化钙浓度时，白化现象都有不同程度的减弱，但单一降低某一物质，均不能完全杜绝白化现象的发生。而不论硫酸镁采用原N6培养基的浓度还是降半处理还是再将浓度处理，均不会引起白化现象的变化。

后进行降低硝酸钾、硫酸铵、磷酸二氢钾以及氯化钙浓度的正交试验，其具体设计如下：

表1 正交试验表

表2 试验结果表

由上表1和2可以看出，绒毛狼尾草在组培过程中，白化率与低硝酸钾、硫酸铵、磷酸二氢钾以及氯化钙浓度呈正相关，在一定范围内，浓度愈低，白化率愈低。即，能几乎杜绝白化现象发生的最佳大量元素添加为QB1、QB2以及QB6，但随着四种物质浓度的降低，苗也愈加纤弱，同时玻化率也随之增加，其中以QB1和QB6为玻化率为最高，苗亦为最弱，而QB2为去白化率最佳的大量元素配比。

3、有机物对去白化现象时苗状态改变试验

以QB2为基础，单一添加不同浓度的香蕉、土豆、椰汁、椰乳、苹果、LH（水解乳蛋白）、CH（水解酪蛋白）、酵母提取液、Ala（丙氨酸）、Pro（脯氨酸）、Gln（谷氨酰胺）、牛肉膏。

发现香蕉泥、椰汁、椰乳、Pro、CH以及酵母提取液均能显著提高苗的强壮程度，而香蕉泥、椰汁、苹果、Pro、牛肉膏能显著降低玻化发生率。

后选取香蕉泥、椰汁、椰乳、Pro进行正交试验，其具体设计如下：

表3 正交设计表

表4试验结果

从上表3-4可以看出，Y1、Y2、Y3、Y5和Y9白化率白化率均较低，无显著差异，但Y1苗极弱，玻化率极高，而Y2和Y5苗虽较壮，但亦有较高的玻化率，Y8白化现象相对较高，但是苗极壮（如图3所示）。

同时从上表3-4可以看出，在一定范围内，Pro浓度提高，有利于降低玻化率的发生，但浓度过高时，会引起苗的死亡。

因此Y3和Y5是在大量元素为QB2的基础上，最佳的有机添加物。

实施例1

一种绒毛狼尾草组织培养方法，包括如下步骤：

1、外植体选择与清洁：选择火焰狼尾草茎段，将其剪成2cm具芽小段，用自来水洗净表面泥土，后滴加5滴洗洁精，涮洗10min，后用自来水洗去表面洗洁精。

2、外植体消毒：洗净外植体转移至超净工作台，用75%酒精消毒15s，无菌水涮洗3次，饱和漂白粉溶液消毒15min，无菌水涮洗4次，0.05%升汞溶液消毒10min，无菌水涮洗8次。

3、丛生芽诱导：消毒好外植体用无菌纸吸去表面水分，并剪去两端伤口，接种于N6+NAA 0.2mg/L+2,4-D 0.02mg/L+TDZ 1.0mg/L+2-IP 0.1mg/L+活性炭 0.5g/L的丛生芽诱导培养基中，在温度25±2℃，每日照光12h，光强2000lx的光暗交替下培养35天。

4、丛生芽增殖：诱导出的丛生芽剪成单芽，接种于改良N6+NAA 0.1mg/L+TDZ0.5mg/L+CPPU 0.2mg/L+香蕉泥 50g/L的丛生芽增殖培养基中，在温度25±2℃，每日照光12h，光强2000lx的光暗交替下培养25天，结果如图3所示，从图3可以看出白化现象完全消失。

5、丛生芽生根：增殖的丛生芽剪成单芽，接种于改良N6+NAA 0.4mg/L+IBA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L+GA3 0.3mg/L+椰汁40ml/L+活性炭 0.5g/L的丛生芽生根培养基中，在温度25℃，每日照光12h，光强3000lx的光暗交替下培养20天，后转移至遮阴率80%的日光下室温培养7天，如图4所示，培养的生根苗基部也有一定数量的从生芽。

6、驯化：生根苗出瓶后洗净基部培养基，移栽于泥炭土+珍珠岩（5:1）的混合基质中，在遮阳率为75%的环境下驯化，前5天保持小环境空气湿度为100%，后逐步降低空气湿度，驯化期间保持基质湿度在60%。

本实施例中，改良N6培养基为在原N6的基础上，硝酸钾改为165mg/L，磷酸二氢钾改为50mg/L，硫酸铵改为70mg/L，氯化钙改为20mg/L，同时添加脯氨酸200mg/L，其余物质不变。

实施例2

一种绒毛狼尾草组织培养方法，包括如下步骤：

1、外植体选择与清洁：选择紫叶狼尾草茎段，将其剪成3cm具芽小段，用自来水洗净表面泥土，后滴加5滴洗洁精，涮洗15min，后用自来水洗去表面洗洁精。

2、外植体消毒：洗净外植体转移至超净工作台，用75%酒精消毒20s，无菌水涮洗3次，饱和漂白粉溶液消毒20min，无菌水涮洗5次，0.05%升汞溶液消毒11min，无菌水涮洗8次。

3、丛生芽诱导：消毒好外植体用无菌纸吸去表面水分，并剪去两端伤口，接种于N6+NAA 0.3mg/L+2,4-D 0.04mg/L+TDZ 1.5mg/L+2-IP 0.2mg/L+活性炭 0.5g/L的丛生芽诱导培养基中，在温度25℃，每日照光12h，光强3000lx的光暗交替下培养35天。

4、丛生芽增殖：诱导丛生芽剪成单芽，接种于改良N6+NAA 0.2mg/L+TDZ 0.8mg/L+CPPU 0.3mg/L+香蕉泥60g/L的丛生芽增殖培养基中，在温度25℃，每日照光12h，光强3000lx的光暗交替下培养30天。

5、丛生芽生根：增殖丛生芽剪成单芽，接种于改良N6+NAA 0.5mg/L+IBA 0.8mg/L+KT 0.8mg/L+GA3 0.5mg/L+椰汁50ml/L+活性炭 0.5g/L的丛生芽生根培养基中，在温度25℃，每日照光12h，光强4000lx的光暗交替下培养15天，后转移至遮阴率80%的日光下培养10天。

本实施例中，改良N6培养基为在原N6的基础上，硝酸钾改为165mg/L，磷酸二氢钾改为50mg/L，硫酸铵改为70mg/L，氯化钙改为20mg/L，同时添加脯氨酸200mg/L，其余元素不变。

对比例1

照魏进莉，李丽芳等发表的文献《紫叶狼尾草的组织培养与快速繁殖》（植物生理学报[J]，2015,51（2）：207～211）的最佳方案进行火焰狼尾草的组织培养，并按照本发明中实施例1的驯化方法驯化。

对比例2

照夏振平发表的文献《紫叶狼尾草的繁殖培养研究》（现代农业科学[J]，2018，（2）：149～149）中的最佳实施方案进行紫叶狼尾草的组织培养，并按照本发明中实施例1的驯化方法驯化。

对比例3

照苏艳，杨宝明等发表的文献《杂交狼尾草腋芽的离体培养与组培快繁技术》（山西农学科学[J]，2019,47（1）：6～8，33）中的最佳实施方案进行火焰狼尾草方法进行组织培养，并按照本发明中实施例1的驯化方法驯化。

对比例4

照专利《美洲狼尾草快速繁殖方法及美洲狼尾草快速脱毒繁殖方法》（CN201010511065.4）中的实施例1进行紫叶狼尾草的组织培养，并按照本发明中实施例1的驯化方法驯化。

实施例1中培养的紫叶狼尾草，实施例2中培养的火焰狼尾草，与对比例1-4方法的消毒污染率、消毒死亡率、初代诱导率、增值系数、白化率、驯化后90天丛生芽率和驯化90天丛生植株单株丛生数进行统计对比，结果见下表：

表1 统计结果

	消毒污染率	消毒死亡率	初代诱导率	增殖系数	白化率	驯化后90天丛生芽率	驯化90天丛生植株单株丛生数
								实施例1	21.3%	3.6%	100%	8.4	0	100%	4.2
实施例2	20.9%	3.2%	100%	9.7	0.6%	100%	3.1
								对比例1	78.3%	12.3%	42.3%	2.3	9.7%	67.4%	1.8
对比例2	81.6%	11.8%	64.7%	4.8	21.3%	66.9%	1.9
								对比例3	17.8%	79.4%	30.8%	3.1	10.4%	48.3%	2.1
对比例4	53.2%	29.7%	51.3%	2.9	7.3%	40.7%	1.7

从统计结果可知，实施例1和2中消毒污染率和消毒死亡率均低于现有技术的对比例1-4，其初代诱导率、增值系数、白化率、驯化后90天丛生芽率和驯化90天丛生植株单株丛生数均高于对比例1-4。

最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.绒毛狼尾草组织培养方法，所述绒毛狼尾草为火焰狼尾草或紫叶狼尾草，其特征在于，包括如下步骤：

（1）外植体选择与清洗：选择绒毛狼尾草茎段，将其剪成2～3cm具芽小段，用自来水洗净表面泥土，后滴加4～5滴洗洁精，涮洗10～15min，后用自来水洗去表面洗洁精；

（2）外植体消毒：洗净外植体转移至超净工作台，依次用75%酒精消毒15～20s，无菌水涮洗2～3次，饱和漂白粉溶液消毒15～20min，无菌水涮洗4～5次，0.05%升汞溶液消毒10～11min，无菌水涮洗7～8次；

（3）丛生芽诱导：消毒好外植体用无菌纸吸去表面水分，并剪去两端伤口，接种于丛生芽诱导培养基中，在温度25±2℃，每日照光12h，光强2000～3000lx的光暗交替下培养30～35天；

所述丛生芽诱导培养基的配方为：N6+NAA 0.2～0.3mg/L+2,4-D 0.02～0.04mg/L+TDZ1.0～1.5mg/L+2-IP 0.1～0.2mg/L+活性炭 0.5g/L；

（4）丛生芽增殖：诱导出丛生芽剪成单芽，接种于丛生芽增殖培养基中，在温度25±2℃，每日照光12h，光强2000～3000lx的光暗交替下培养25～30天；

所述丛生芽增值培养基的配方为：改良N6+NAA 0.1～0.2mg/L+TDZ 0.5～0.8mg/L+CPPU 0.2～0.3mg/L+香蕉泥 50～60g/L；

（5）丛生芽生根：增殖丛生芽剪成单芽，接种于丛生芽生根培养基中，在温度25±2℃，每日照光12h，光强3000～4000lx的光暗交替下培养15～20天，后转移至遮阴率80%的日光下室温培养5～10天；

所述丛生芽生根培养基的配方为：改良N6+NAA 0.4～0.5mg/L+IBA 0.5～0.8mg/L+KT0.5～0.8mg/L+GA3 0.3～0.5mg/L+椰汁40～50ml/L+活性炭 0.5g/L；

所述改良N6培养基为在原N6的基础上，硝酸钾改为165mg/L，磷酸二氢钾改为50mg/L，硫酸铵改为70mg/L，氯化钙改为20mg/L，同时添加脯氨酸200mg/L，其余物质不变。

2.根据权利要求1所述方法在绒毛狼尾草繁育中的应用。