CN115340587A - 一种从家禽胆汁中制备牛磺鹅去氧胆酸和牛磺胆酸的方法 - Google Patents
一种从家禽胆汁中制备牛磺鹅去氧胆酸和牛磺胆酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及药物提取领域，具体涉及一种从家禽胆汁中制备牛磺鹅去氧胆酸和牛磺胆酸的方法，对家禽胆汁进行水提，将水提液和疏水溶剂混合并采用改性超疏水海绵进行油水分离处理，得到除杂水提液；所述的改性超疏水海绵包括海绵基底，复合在海绵基底骨架上的CNTs，包覆海绵骨架以及CNTs的聚多巴胺，以及修饰在聚多巴胺上的碳链长度为16～20的长链伯胺；对除杂水提液进行酸化，随后进行柱色谱梯度洗脱，其中，柱色谱的分离柱的填料为三甲基氯硅烷封端的改性反相填料；洗脱液为甲醇水溶液。本发明中，创新地采用所述改性超疏水海绵辅助进行油水分离，进一步配合特殊改性填料和洗脱条件的联合，可以协同改善牛磺胆酸、牛磺熊去氧胆酸的提取收率和纯度。
Description
技术领域
本发明属于天然产物提取技术领域，涉及一种从家禽胆汁中制备高纯度高收率牛磺鹅去氧胆酸和牛磺胆酸的方法。
背景技术
牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)化学名称为3α，7β二羟基胆烷酰-N-牛磺酸，是1902年自熊胆中发现，其为熊胆中主要胆汁酸，具有解痉、抗惊厥、抗炎及溶胆石等作用。由意大利贝思迪大药厂研制，1991年首次在意大利上市，2007 年以商品名滔罗特(taurolite)获准在中国销售，临床主要用于治疗胆囊胆固醇结石、原发硬化性胆管炎、原发胆汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎等。临床研究表明，牛磺熊去氧胆酸与熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸相比，溶石速度加快、全溶率提高，且无明显的不良反应。近年来，有关牛磺熊去氧胆酸的研究领域一直非常活跃。国外报道化学合成牛磺熊去氧胆酸，主要有三种化学半合成法，且这三种方法均用到了价格昂贵的试剂，反应步骤多，收率低，环境污染大。而牛磺鹅去氧胆酸恰好是酶法合成牛磺熊去氧胆酸的重要原料，因此从家禽胆汁中获取高纯度、高收率的牛磺鹅去氧胆酸用于牛磺熊去氧胆酸的制备是一个有重大意义的课题。
家禽胆汁主要包括鸡胆汁、鸭胆汁、鹅胆汁等，其胆汁的主成分相似，主要含有胆色素、胆固醇、粘蛋白、无机盐和胆汁酸等，其中胆汁酸(cholic acid)主要含有4种，分别为牛磺鹅去氧胆酸，牛磺胆酸，牛磺别胆酸和3α- 羟基-7-酮基胆烷酸。其中主要活性成分牛磺鹅去氧胆酸在家禽胆汁中的含量在 3-4％之间，如何运用简单、易于操作、成本低的方法将主要活性成分牛磺鹅去氧胆酸与胆汁中的其他成分，特别是结构相似的胆汁酸成分分离，从而获得高含量，高收率的牛磺鹅去氧胆酸是本课题研发的难点。
活性成分牛磺胆酸，在家禽胆汁中的含量在2％左右。其结构与牛磺鹅去氧胆酸相似，其也能够降低炎症组织毛细血管的通透性，抑制炎症性肿胀，抑制 NO、PGE2、组胺等炎症介质的产生，在分离牛磺鹅去氧胆酸的同时能够将牛磺胆酸一并高收率的分离，获得额外产值，也是本课题研发的重点。
CN201210570131.4公开了一种鸡胆提取组合物及其提取方法，其中将牛磺鹅去氧胆酸与其他胆酸、氨基酸、蛋白质、脂肪等物质一起提取出。取鸡胆，冷冻，切碎，融化，压榨，过滤出胆汁，加入90-98％的乙醇，室温搅拌，放置，沉淀蛋白，过滤，得上清液，加入石油醚进行萃取，收集乙醇层，浓缩蒸干，既得鸡胆提取组合物。提取过程虽然简单，但提取出的成分复杂，不能得到含量较高的的牛磺鹅去氧胆酸产品。
CN200610046652.4公开了一种用鸡胆提取鹅去氧胆酸的方法，取冻鸡胆切片，加热至70℃，加入所有胆汁总量10％氢氧化钠煮沸24小时，回流冷却，用盐酸调pH为2，得膏状物，用水洗至中性，加入胆膏2倍量的95％的乙醇和胆膏10％的硅藻土，回流后加入胆膏量10％的活性炭，回流，放冷后过滤，将滤液加入等量120#汽油脱脂，回流，静置，分离出的乙醇液并在反应釜中蒸干洗至中性，再加入2倍量95％的乙醇溶解后，加入蒸干药物量30％的氯化钡和蒸干药物量5％的活性炭，回流，热滤，将滤液浓缩出白色结晶物，洗净后加入10倍量水和10％倍量碳酸钠水溶液，加热回流，过滤，滤液调节至pH为2，将出现沉淀物干燥即得。该方法不仅步骤繁多，使用溶剂较多，成本高，收率低，且去掉牛磺酸的鹅去氧胆酸药效较差，后续通过化学法或者酶法合成熊去氧胆酸后，需要在体内经过酰胺化与牛磺酸结合后才能更有效的发挥生理作用。
在华中科技大学的论文《牛磺鹅去氧胆酸钠的提取及与鹅去氧胆酸钠的药理作用比较》中，取新鲜鸡胆汁500ml,加入3倍体积的乙醇提取，减压蒸干得鸡胆粉。将鸡胆粉用V(乙酸乙酯)：V(无水乙醇)＝8:2的混合液，以索氏提取器提取30次，冷却提取液得到浅黄色固体，过滤，沉淀用无水乙醇洗涤，置真空干燥器中干燥4h,用无水乙醇重结晶，得浅黄色TCDCANa结晶7.2g。文献采用薄层层析的方法报告TCDCANa含量在92％左右。该方法采用索氏抽提30次的方法，方法耗时长，操作复杂，损失较大，导致收率粗算只有50％左右，且产品含量低，不利用下一步牛磺熊去氧胆酸的制备。
发明内容
为了克服现有技术所存在的目标产物收率和纯度不理想等缺陷，本发明的目的在于提供一种从家禽胆汁中提取出高纯度，获得高收率的牛磺鹅去氧胆酸和牛磺胆酸的方法。
家禽胆汁的成分复杂，在进行非衍生直接提取过程中，需要妥善解决牛磺鹅去氧胆酸和牛磺胆酸提取率不高、以及成分原料复杂所致的成分分离选择性不高的问题，例如，需要重点解决牛磺鹅去氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺别胆酸和 3α-羟基-7-酮基胆烷酸等结构类似物难于选择性分离的问题。针对非衍生提取面临的牛磺鹅去氧胆酸和牛磺胆酸提取率不高以及胆汁酸成分复杂所致的分离选择性不理想的问题，本发明提供以下解决方案：
一种从家禽胆汁中制备牛磺鹅去氧胆酸和牛磺胆酸的方法，步骤包括：
步骤(1)：
对家禽胆汁进行水提，将水提液和疏水溶剂混合并采用改性超疏水海绵进行油水分离处理，得到除杂水提液；
所述的改性超疏水海绵包括海绵基底，复合在海绵基底骨架上的CNTs，包覆海绵骨架以及CNTs的聚多巴胺，以及修饰在聚多巴胺上的碳链长度为16～20 的伯胺；
步骤(2)：
对除杂水提液进行酸化，随后进行柱色谱梯度洗脱，其中，柱色谱的分离柱的填料为三甲基氯硅烷封端的改性反相填料；
洗脱液为甲醇水溶液；
梯度洗脱机制为：
收集34～36v％甲醇水溶液的洗脱液，并从中获得牛磺胆酸；
收集39～41v％甲醇水溶液的洗脱液，并从中获得牛磺熊去氧胆酸。
本发明中，创新地采用所述改性超疏水海绵辅助进行油水分离，进一步配合特殊改性填料和洗脱条件的联合，能够实现协同，可以协同高选择性地保留牛磺胆酸、牛磺熊去氧胆酸，改善提取回收率，此外，还能够有效改善牛磺胆酸、牛磺熊去氧胆酸之间及其和其他胆汁酸如牛磺别胆酸和3α-羟基-7-酮基胆烷酸的分离选择性，改善提取产物的纯度。本发明能够通过非衍生的方式直接高回收率、高选择性地获得牛磺胆酸、牛磺熊去氧胆酸两种目标产物。
本发明中，家禽胆汁包括鸡胆汁、鸭胆汁、鹅胆汁中的至少一种。
本发明中，水提过程可基于现有手段实现。
作为优选：水提阶段，水相对于家禽胆汁的体积重量比为5～20ml/g；
优选地，水提过程包括两段水提过程，其中，第一段水提阶段水相对于家禽胆汁的体积重量比为5-10ml/g；第二段水提阶段水相对于家禽胆汁的体积重量比为3-5ml/g；
优选地，各段水提的提取时间为1-2h。
本发明中，可将水提液制剂和疏水溶剂，考虑到疏水溶剂的消耗成本，优选地，水提后预先经浓缩处理，随后再和疏水溶剂混合；
优选地，控制浓缩后的水提液中的牛磺鹅去氧胆酸的浓度为80-100mg/ml，牛磺胆酸的浓度为55-75mg/ml。
作为优选：疏水溶剂为丁酸乙酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、正已烷、石油醚中的至少一种；
优选地，疏水溶剂和水提液的体积比为1:0.5～2。
本发明中，水提液和疏水溶剂的混合液经所述的改性超疏水海绵过滤，进行油水分离，得到除杂水提液。本发明研究发现，所述的改性海绵材料中的 CNTs负载是实现改善水提液中的牛磺胆酸、牛磺熊去氧胆酸和杂质成分选择性分离的关键之一。
本发明中，改性超疏水海绵包括海绵基底，通过聚多巴胺复合在海绵骨架是上的CNTs，且所述的聚多巴胺还包覆所述的CNTs和海绵骨架，不仅如此，所述的长链伯胺通过迈克尔加成和席夫碱反应等方式接枝在聚多巴胺上。
所述的改性超疏水海绵的制备过程为：对海绵进行刻蚀，随后和CNTs、多巴胺复合；制得Pu-CNT-PDA；再和长链伯胺反应，制得所述的改性海绵。所述的CNTs可预先包覆聚多巴胺。
例如，所述的改性超疏水海绵的制备过程为：
步骤(a):海绵预处理
将海绵(PU)置于包含CrO3、浓H2SO4的改性溶液中进行刻蚀，制得预处理海绵；
步骤(b)：
将预处理海绵、聚多巴胺包覆的CNTs(CNTs@PDA)置于多巴胺溶液中，进行多巴胺聚合，借助于聚多巴胺将CNTs复合在海绵骨架上并实现海绵-CNTs的包覆，制得PU-CNT-PDA；
步骤(C)：
将PU-CNT-PDA和长链伯胺反应，制得所述的改性海绵(标记为PU-CNT- PDA-ODA)。
本发明中，控制除杂水提液的pH在3.0-4.0之间，进行酸化处理。
优选地，酸化处理后，采用活性炭进行吸附脱色处理；
优选地，活性炭的添加量为家禽胆汁重量的0.1～1％，吸附脱色时间为1- 1.5h。
优选地，吸附脱色处理后固液分离、浓缩至牛磺鹅去氧胆酸的浓度为400- 500mg/ml、牛磺胆酸的浓度为250-400mg/ml后进行柱色谱梯度洗脱。
本发明中，在所述的改性海绵辅助的选择性除杂基础上，进一步配合柱色谱处理阶段的填料改性工艺、洗脱液和洗脱机制的联合，能够进一步实现协同，改善牛磺胆酸、牛磺熊去氧胆酸之间及其和其他胆汁酸如牛磺别胆酸和3α-羟基-7-酮基胆烷酸的分离选择性，改善制得的牛磺胆酸、牛磺熊去氧胆酸的收率和纯度，降低杂质的夹带。
优选地，柱色谱的分离柱的填料为三甲基氯硅烷封端的改性C18反相填料。本发明中，所述的三甲基氯硅烷封端是协同改善牛磺胆酸、牛磺熊去氧胆酸之间及其和其他胆汁酸如牛磺别胆酸和3α-羟基-7-酮基胆烷酸的分离选择性的关键之一。
优选地，所述的填料包括硅胶填料基底、接枝在填料基底上的由三甲基氯硅烷封端的碳链长度为16～18的硅烷链。
本发明中，可基于现有手段获得C18反相填料，再基于现有的手段采用三甲基氯硅烷对其封端。例如，其制备过程包括：将硅胶酸化活化，随后和十八烷基三氯硅烷接枝反应，再和醇进行酯化，最后和三甲基氯硅烷进行封端。
本发明中，所述的改性调料，甲醇水洗脱剂和洗脱机制联合是协同实现牛磺胆酸、牛磺熊去氧胆酸之间及其和其他胆汁酸如牛磺别胆酸和3α-羟基-7- 酮基胆烷酸的分离选择性的另一关键。
作为优选，上样量为1.2-1.8g牛磺鹅去氧胆酸/100g硅胶；
优选地，梯度洗脱阶段，洗脱剂的流速8-10ml/min。
本发明中，目标产物洗脱完成后，再采用90～100％的甲醇对色谱柱进行洗脱再生。
本发明还提供了一种从家禽胆汁中制备高纯度高收率牛磺鹅去氧胆酸和牛磺胆酸的方法，步骤包括：
步骤(1)：水提：
对家禽单质进行水提处理，所述家禽胆汁包括鸡胆汁、鸭胆汁、鹅胆汁等。
水提取次数为2次，第一次水用量5-10ml水/1g鸡胆汁，第二次水用量 3-5ml水/1g鸡胆汁,搅拌提取，每次提取时间为1-2h。
步骤(2)：改性海绵辅助油水分离
水提液经浓缩得到浓缩液A，随后加入疏水溶剂，并加入改性海绵，进行油水分离，获得除杂水提液；
疏水溶剂包括丁酸乙酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、正已烷、石油醚等，疏水溶剂加量和浓缩液A的体积比为1:1～2；
步骤(3)：柱色谱分离
将步骤(2)制得的除杂水提液、脱色、浓缩成浓缩B，随后进行柱色谱梯度洗脱：
所述的活性炭脱色步骤中活性炭的添加量为胆汁重量的0.1～1％，搅拌脱色时间为1-1.5h。
柱色谱的分离柱的填料为经三甲基氯硅烷封端处理得到的改性C18反相硅胶树脂。
所述的层析洗脱条件为甲醇水溶液梯度洗脱，梯度洗脱条件如下表所示，流速8-10ml/min。
| 名称 | 洗脱柱体积(Bv) |
| 5％甲醇水溶液 | 1 |
| 35％甲醇水溶液 | 3 |
| 40％甲醇水溶液 | 10 |
| 45％甲醇水溶液 | 7 |
| 100％甲醇水溶液 | 1 |
优选的方案，所述的层析条件，其中35％甲醇水溶液洗脱得到含有牛磺胆酸的洗脱液，经浓缩干燥得到牛磺胆酸产品；40％甲醇水溶液洗脱、45％甲醇水溶液洗脱得到含有牛磺熊去氧胆酸的洗脱液，经浓缩干燥得到牛磺熊去氧胆酸产品。
本发明所用的原料为家禽胆汁，包括鸡胆汁、鸭胆汁、鹅胆汁等，经提取、萃取、脱色、改性反相硅胶柱层析分离，浓缩干燥等工艺步骤的协同作用，能够同时制备两种高含量(均超过98％)，高收率(均超过90％)的牛磺鹅去氧胆酸和牛磺胆酸产品。发明人发现改变部分工艺参数(例如采用普通的萃取分离工艺、采用未复合CNT的疏水海绵材料、采用未改性的C18反相硅胶树脂、采用乙醇水溶液洗脱、改变梯度洗脱的条件等)或减少部分步骤(例如萃取工序、脱色工序等)，均会影响最终产品的收率和含量、颜色等，而严格按照本发明的工艺进行处理，在各条件和工艺步骤的协同作用下，能够同时制备高含量(均超98％)，高收率(均超90％)的牛磺鹅去氧胆酸和牛磺胆酸产品。
有益效果：
本发明中，创新地采用所述改性超疏水海绵辅助进行油水分离，进一步配合特殊改性填料和洗脱条件的联合，能够高选择性地保留牛磺胆酸、牛磺熊去氧胆酸，改善提取回收率，此外，还能够有效改善牛磺胆酸、牛磺熊去氧胆酸之间及其和其他胆汁酸如牛磺别胆酸和3α-羟基-7-酮基胆烷酸的分离选择性，改善提取产物的纯度。本发明能够通过非衍生的方式直接高回收率、高选择性地获得牛磺胆酸、牛磺熊去氧胆酸两种目标产物。
本发明方法，得到的牛磺鹅去氧胆酸和牛磺胆酸产品均为白色粉末，且二者含量均大于98％，收率均大于90％。且其中得到的牛磺鹅去氧胆酸产品中两种其他胆酸杂质牛磺别胆酸和3α-羟基-7-酮基胆烷酸的含量均小于0.5％。牛磺鹅去氧胆酸产品高含量、高收率的生产，可直接用于酶法合成牛磺熊去氧胆酸，且使牛磺熊去氧胆酸工艺的后续分离变得极其简单，可改变国内现有牛磺熊去氧胆酸生产的现状，加速牛磺熊去氧胆酸规模化生产的进程。
本发明经改性的反相C18硅胶材料，经少量甲醇再生处理后，便可重复使用，使用批次达到300批以上，大大节省了生产成本，具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为本发明实例1制得的牛磺鹅去氧胆酸产品检测色谱图。
图2为本发明实例1制得的牛磺胆酸产品检测色谱图。
具体实例方式
下面结合具体实例对本发明作进一步说明，所述的不是对本发明的限定，而是对本发明的解释，如未特别说明，本发明中的百分比均为体积百分比。
本发明所用的检测方法为高效液相色谱分析方法，方法如下：
色谱柱：shim-pack XR-ODS 2.2μm 4.6×30mm 检测器：UV
检测波长：210nm 柱温：25℃
进样量：20μl 流速：1.0ml/min
流动相：：pH4.5、30mM的乙酸铵缓冲液：乙腈＝72：28
对照品溶液：精密称取12.5mg对照品加流动相相溶解，并定容至 25ml，取样进行HPLC分析。
样品溶液；用流动相稀释一定倍数进行HPLC分析。
所述的改性超疏水海绵(PU-CNT-PDA-ODA)的制备过程为：
步骤(a)将0.1g CNTs分散在2g/L的多巴胺水溶液中，并用三羟甲基氨基甲烷(Tris)将溶液的p H调节为8.5。配制的溶液超声分散30min 后，在室温下磁力搅拌24h。随后，对多巴胺改性的CNTs进行真空抽滤，并用蒸馏水清洗至滤液为中性，在80℃条件下烘干备用。多巴胺改性的CNTs 标记为CNT-PDA。
步骤(b)将海绵分别在无水乙醇、蒸馏水中超声清洗3次，烘干备用。配制CrO3(100g/L)和浓H2SO4的粗化溶液。将海绵置于粗化溶液中刻蚀1min,然后对海绵进行多次的超声清洗，以除去多余的酸，烘干备用。将0.1g提前制备 CNT-PDA超声分散在2g/L的多巴胺水溶液中，将预处理后的海绵置于该溶液中，并用Tris将溶液的pH调节至8.5。室温下磁力搅拌24h,用蒸馏水洗涤，在 80℃以下烘干。得到的海绵标记为PU-CNT-PDA。配制10mM的ODA乙醇溶液，并用Tris将溶液的pH调节至8.5。将PU-CNT-PDA海绵置于该溶液中，50℃以下反应48h。反应结束后用乙醇超声清洗，烘干得到样品，样品标记为：PU- CNT-PDA-ODA(可参照东北石油大学文献《超疏水超亲油材料的制备及其油水分离性能研究》进行制备)。
参比疏水海绵PU-PDA-ODA的制备：
和PU-CNT-PDA-ODA制备相比，区别在于，省略步骤(a)，且在步骤(b) 中，未添加CNT-PDA，其他操作和参数相同。
改性C18填料的制备：
称取一定量的酸洗活化后的硅胶加入到10倍体积的干燥甲苯中，定量加入十八烷基三氯硅烷，加入1ml三乙胺作为催化剂，搅拌下反应。反应结束后过滤，用干燥的甲苯洗涤数次以除去剩余的十八烷基三氯硅烷及反应生成的少量 HCL，再用干燥的甲醇洗涤使剩余的氯原子转变为甲氧基，最后用干燥的二氯甲烷洗涤，真空干燥过夜，得到未改性的C18反相硅胶。
向干燥后的产物加入三甲基氯硅烷，于干燥甲苯溶剂下搅拌反应。反应完成后产物用干燥的二氯甲烷洗涤数次，以除去未反应的三甲基氯硅烷和少量反应生成的HCL，产物抽滤后真空干燥过夜，得到三甲基氯硅烷封端的改性C18 反相填料。以下实施例中，可直接采用市售商品SILICYCLE 50μm
实施例1
步骤(1)：
取鸡胆汁1kg,用破碎机破碎后，用纯水提取2次，提取时间均为1h,料液比分别为5,3倍，过滤，合并滤液，共8850ml，经检测提取液中牛磺鹅去氧胆酸浓度为4.09mg/ml,牛磺胆酸的浓度为2.63mg/ml。
步骤(2)：
将提取液进行减压浓缩，得到浓缩液A，浓缩温度为65度，浓缩液A中牛磺鹅去氧胆酸的浓度为90.5mg/ml，牛磺胆酸的浓度为58.2mg/ml，浓缩液A的体积为400ml。
步骤(3)：
(3-A)：将浓缩液A按照1:1的体积比加入乙酸乙酯400ml搅拌混合，然后用装有经修饰的超疏水海绵材料(上述记载的PU-CNT-PDA-ODA)进行过滤 (水油分离)，除掉乙酸乙酯层，得到除掉绝大部分油溶性杂质的水层溶液,共萃取1次，弃乙酸乙酯层。
(3-B)：将水层溶液调pH3.5,加入活性炭5g搅拌脱色1.5h，固液分离得到滤液，将滤液继续浓缩，得到浓缩液B,浓缩液B中牛磺鹅去氧胆酸的浓度为482.6mg/ml,牛磺胆酸的浓度为310.0mg/ml,浓缩液体积75ml。
步骤(4)：
对改性C18反相硅胶(市售商品SILICYCLE 50μm
)用甲醇浸泡处理，脱气后装柱，装柱量2400g硅胶，采用5％的甲醇水溶液洗涤2个柱体积。将浓缩液B加入少量甲醇溶解后，通过改性反相硅胶柱层析进行分离，采用梯度甲醇水溶液进行洗脱，梯度设置为5％甲醇水溶液(1倍柱体积)，35％甲醇水溶液(3倍柱体积)，40％甲醇水溶液(10倍柱体积)，45％甲醇水溶液(7倍柱体积)，流速10ml/min。其中35％甲醇水溶液洗脱得到含有牛磺胆酸的洗脱液A；40％甲醇水溶液、45％甲醇水溶液洗脱得到含有牛磺熊去氧胆酸的洗脱液B。
将洗脱液A和洗脱液B分别浓缩干燥得到牛磺胆酸22.08g,含量98.2％，收率93.15％，牛磺鹅去氧胆酸35.05g,含量98.5％；收率95.38％。
实施例2
取鸭胆汁0.5kg,用破碎机破碎后，用纯水提取2次，提取时间均为1h,料液比分别为5,3倍，过滤，合并滤液，共4400ml，经检测提取液中牛磺鹅去氧胆酸浓度为4.12mg/ml,牛磺胆酸的浓度为2.51mg/ml。
将提取液进行减压浓缩，得到浓缩液A，浓缩温度为65度，浓缩液A中牛磺鹅去氧胆酸的浓度为90.64mg/ml，牛磺胆酸的浓度为55.22mg/ml，浓缩液A 的体积为200ml。
将浓缩液A按照1:1的体积比加入乙酸乙酯200ml搅拌混合，然后用装有经修饰的超疏水海绵材料(同实施例1)进行过滤，除掉乙酸乙酯层，得到除掉绝大部分油溶性杂质的水层溶液,萃取1次，弃乙酸乙酯层。
将水层溶液调pH3.8,加入活性炭2.5g搅拌脱色1.5h，固液分离得到滤液，将滤液继续浓缩，得到浓缩液B,浓缩液B中牛磺鹅去氧胆酸的浓度为 476.05mg/ml,牛磺胆酸的浓度为289.63mg/ml,浓缩液体积38ml。
对改性C18反相硅胶(同实施例1)用甲醇浸泡处理，脱气后装柱，装柱量1200g硅胶，采用5％的甲醇水溶液洗涤2个柱体积。将浓缩液B加入少量甲醇溶解后，通过改性反相硅胶柱层析进行分离，采用梯度甲醇水溶液进行洗脱，梯度设置为5％甲醇水溶液(1倍柱体积)，35％甲醇水溶液(3倍柱体积)，40％甲醇水溶液(10倍柱体积)，45％甲醇水溶液(7倍柱体积)，流速8-10ml/min。其中35％甲醇水溶液洗脱得到含有牛磺胆酸的洗脱液A；40％甲醇水溶液、45％甲醇水溶液洗脱得到含有牛磺熊去氧胆酸的洗脱液B。
将洗脱液A和洗脱液B分别浓缩干燥得到牛磺胆酸10.29g,含量98.0％，收率91.31％；牛磺鹅去氧胆酸17.69g,含量98.3％；收率95.92％。
实施例3
取鹅胆汁1kg,用破碎机破碎后，用纯水提取2次，提取时间均为1h,料液比分别为8,4倍，过滤，合并滤液，共12650ml，经检测提取液中牛磺鹅去氧胆酸浓度为2.55mg/ml,牛磺胆酸的浓度为1.52mg/ml。
将提取液进行减压浓缩，得到浓缩液A，浓缩温度为65度，浓缩液A中牛磺鹅去氧胆酸的浓度为97.65mg/ml，牛磺胆酸的浓度为64.01mg/ml，浓缩液A 的体积为330ml。
将浓缩液A按照1:1的体积比加入丁酸乙酯400ml搅拌萃取，然后用装有经修饰的超疏水海绵材料(同实施例1)进行过滤，除掉丁酸乙酯层，得到除掉绝大部分油溶性杂质的水层溶液,萃取1次，弃丁酸乙酯层。
将水层溶液调pH3.5,加入活性炭5g搅拌脱色1.5h，固液分离得到滤液，将滤液继续浓缩，得到浓缩液B,浓缩液B中牛磺鹅去氧胆酸的浓度为 429.98mg/ml,牛磺胆酸的浓度为256.37mg/ml,浓缩液体积75ml。
对改性C18反相硅胶(同实施例1)用甲醇浸泡处理，脱气后装柱，装柱量2400g硅胶，采用5％的甲醇水溶液洗涤2个柱体积。将浓缩液B加入少量甲醇溶解后，通过改性反相硅胶柱层析进行分离，采用梯度甲醇水溶液进行洗脱，梯度设置为5％甲醇水溶液(1倍柱体积)，35％甲醇水溶液(3倍柱体积)，40％甲醇水溶液(10倍柱体积)，45％甲醇水溶液(7倍柱体积)，流速8-10ml/min。其中35％甲醇水溶液洗脱得到含有牛磺胆酸的洗脱液A；40％甲醇水溶液、45％甲醇水溶液洗脱得到含有牛磺熊去氧胆酸的洗脱液B。
将洗脱液A和洗脱液B分别浓缩干燥得到牛磺胆酸18.08g,含量98.5％，收率92.62％，牛磺鹅去氧胆酸31.45g,含量98.60％；收率96.13％。
对比例1
和实施例1相比，区别仅在于，步骤(3)中，不加所述改性超疏水海绵材料进行油水分离，而是直接进行萃取。区别的3-A的步骤例如为：将浓缩液A按照1:1的体积比加入乙酸乙酯400ml搅拌萃取，然后用分液漏斗分液，除掉乙酸乙酯层，萃取1次，弃乙酸乙酯层。
其他操作步骤和参数同实施例1。
将洗脱液A和洗脱液B分别浓缩干燥得到牛磺胆酸19.08g,含量89.2％，收率77.05％，牛磺鹅去氧胆酸30.2g,含量88.5％；收率75.73％。
对比例2
和实施例1相比，区别仅在于，步骤(3)中，采用未复合CNTs的疏水海绵进行油水分离，例如，本对比案例提供的海绵为PU-PDA-ODA，其只是在实施例 1制备的PU-CNT-PDA-ODA基础上，没有添加CNTs.其他操作和参数同实施例1。
将洗脱液A和洗脱液B分别浓缩干燥得到牛磺胆酸16.58g,含量88.2％，收率67.16％，牛磺鹅去氧胆酸25.8g,含量89.0％；收率65.02％。
本对比例中萃取步骤使用未复合CNT的疏水海绵材料进行过滤，在同样的条件下，得到的牛磺鹅去氧胆酸和牛磺胆酸的含量均低于90％，且产品收率均低于70％。
对比例3
和实施例1相比，区别仅在于，柱色谱的填料为未改性的C18反相硅胶 (未通过三甲基氯硅烷封端)，其他工艺和参数均同实施例1。
将洗脱液A和洗脱液B分别浓缩干燥得到牛磺胆酸21.08g,含量90.05％，收率86.00％，牛磺鹅去氧胆酸33.05g,含量91.05％；收率86.34％。
本对比例中层析分离步骤采用的未改性的C18反相硅胶树脂填料，在同样的条件下，影响产品的分离，得到的牛磺鹅去氧胆酸和牛磺胆酸的含量均低于 92％，且产品收率均低于90％。
对比例4
和实施例1相比，区别仅在于，将洗脱剂中的甲醇换成乙醇，其他参数和洗脱机制均同实施例1.区别的步骤(4)为：对改性C18反相硅胶用乙醇浸泡处理，脱气后装柱，装柱量2400g硅胶，采用5％的乙醇水溶液洗涤2个柱体积。将浓缩液B加入少量乙醇溶解后，通过改性反相硅胶柱层析进行分离，采用梯度乙醇水溶液进行洗脱，梯度设置为5％乙醇水溶液(1倍柱体积)，35％乙醇水溶液(3倍柱体积)，40％乙醇水溶液(10倍柱体积)，45％乙醇水溶液(7倍柱体积)，流速8-10ml/min。其中35％乙醇水溶液洗脱得到含有牛磺胆酸的洗脱液 A；40％乙醇水溶液、45％乙醇水溶液洗脱得到含有牛磺熊去氧胆酸的洗脱液B。
将洗脱液A和洗脱液B分别浓缩干燥得到牛磺胆酸19.10g,含量88.23％，收率74.36％，牛磺鹅去氧胆酸29.8g,含量88.98％；收率75.19％。
本对比例中洗脱溶剂采用同浓度的乙醇水溶液洗脱，在同样的条件下，对产品的分离效果不好，两种胆酸的交叉严重，导致两种产品的含量均低于90％，收率低于80％。
此外，各案例制得的产品的杂质检测情况如表1所示：
表1
通过表1也可以知道，得益于所述的改性海绵、改性填料以及洗脱工艺的联合，能够意外地实现协同作用，能够有效改善牛磺胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺别胆酸、3α-羟基-7-酮基胆烷酸之间的分离选择性，利于高收率、高纯度地获得牛磺胆酸、牛磺鹅去氧胆酸。
Claims (10)
1.一种从家禽胆汁中制备牛磺鹅去氧胆酸和牛磺胆酸的方法，其特征在于：步骤包括：
步骤(1)：
对家禽胆汁进行水提，将水提液和疏水溶剂混合并采用改性超疏水海绵进行油水分离处理，得到除杂水提液；
所述的改性超疏水海绵包括海绵基底，复合在海绵基底骨架上的CNTs，包覆海绵骨架以及CNTs的聚多巴胺，以及修饰在聚多巴胺上的碳链长度为16～20的长链伯胺；
步骤(2)：
对除杂水提液进行酸化，随后进行柱色谱梯度洗脱，其中，柱色谱的分离柱的填料为三甲基氯硅烷封端的改性反相填料；
洗脱液为甲醇水溶液；
梯度洗脱机制为：
收集34～36v％甲醇水溶液的洗脱液，并从中获得牛磺胆酸；
收集39～41v％甲醇水溶液的洗脱液，并从中获得牛磺熊去氧胆酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：家禽胆汁包括鸡胆汁、鸭胆汁、鹅胆汁中的至少一种。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：水提阶段，水相对于家禽胆汁的体积重量比为5～20ml/g；
优选地，水提过程包括两段水提过程，其中，第一段水提阶段水相对于家禽胆汁的体积重量比为5-10ml/g；第二段水提阶段水相对于家禽胆汁的体积重量比为3-5ml/g；
优选地，各段水提的提取时间为1-2h。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：水提后预先经浓缩处理，随后再和疏水溶剂混合；
优选地，控制浓缩后的水提液中的牛磺鹅去氧胆酸的浓度为80-100mg/ml，牛磺胆酸的浓度为55-75mg/ml。
5.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于：疏水溶剂为丁酸乙酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、正已烷、石油醚中的至少一种；
优选地，疏水溶剂和水提液的体积比为1:0.5～2。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：水提液和疏水溶剂的混合液经所述的改性超疏水海绵过滤，进行油水分离，得到除杂水提液；
优选地，所述的改性超疏水海绵的制备过程为：对海绵进行刻蚀，随后和CNTs、多巴胺复合；制得Pu-CNT-PDA；再和长链伯胺反应，制得所述的改性海绵。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：控制除杂水提液的pH在3.0-4.0之间，进行酸化处理；
优选地，酸化处理后，采用活性炭进行吸附脱色处理；
优选地，活性炭的添加量为家禽胆汁重量的0.1～1％，吸附脱色时间为1-1.5h；
优选地，吸附脱色处理后固液分离、浓缩至牛磺鹅去氧胆酸的浓度为400-500mg/ml、牛磺胆酸的浓度为250-400mg/ml后进行柱色谱梯度洗脱。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：柱色谱的分离柱的填料为三甲基氯硅烷封端的改性C18反相填料；
优选地，所述的填料包括硅胶填料基底、接枝在填料基底上的由三甲基氯硅烷封端的碳链长度为16～18的硅烷链；
优选地，填料的制备步骤为：
将硅胶进行酸化处理，随后和十八烷基三氯硅烷进行接枝反应，随后和醇对C18链末端进行酯化反应，再用三甲基氯硅烷进行封端，即得所述的改性C18反相填料；
优选地，将硅胶树脂进行酸化处理，再利用十八基三氯硅烷进行烷基化反应，最后用三甲基氯硅烷封端处理，即得。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
上样量为1.2-1.8g牛磺鹅去氧胆酸/100g硅胶；
优选地，梯度洗脱阶段，洗脱剂的流速8-10ml/min。
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