CN115336531A - 一种高效培育矮株百子莲的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效培育矮株百子莲的方法，属于百子莲育苗培育领域。将透明质酸制成植物固体培养基，以多效唑为矮化调节剂添加至该培养基中用于矮株百子莲的培育。培育可得到存活率高、矮化率高、矮化均匀的矮株百子莲。培育出来的矮株百子莲幼苗平均存活率为98.00％、两年平均生长量为7.38cm，矮化率达到91.84％，以及株差为0.81cm。在保证成活率的条件下百子莲植株矮化效果明显，且矮化均匀，为矮株百子莲的高效繁育提供技术指导，提高了百子莲的观赏价值及经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及百子莲育苗培育领域，具体涉及一种高效培育矮株百子莲的方法。
背景技术
百子莲(Agapanthus spp.)为欧式庭院中栽种的最为古老的南非花卉之一，抗性极强，可露地栽培，并表现出极佳的观赏价值，在观赏性植物中发展空间巨大。观赏植物的株型是决定商品价值和观赏价值的重要因素之一，矮化紧凑的株型可以同时提升植物的观赏价值和商品价值。
透明质酸(Hyaluronic Acid，HA)是广泛分布在软结缔组织细胞外基质中的一种线性大分子酸性黏多糖，具有独特的理化性质和广泛的生物学功能，天然的透明质酸分子量为5000-20000000道尔顿，有很强的保湿性。透明质酸形成的水凝胶材料具有生物相容性、高吸水性等优点，近年作为可以控制药物释放的载体在生物医用领域受到广泛关注。使用简单的交联法制备透明质酸水凝胶，其中的交联剂和催化剂难以去除，会影响植物营养基的活性，因而将透明质酸用于植物培育研究极其少见，同时水凝胶的固化程度难以控制，有可能会导致外植体沉入凝胶中，造成腐烂死亡等问题。
多效唑(Multi－effect Triazole MET)是一种高效的植物生长调节剂，国内外对多效唑在农作物、花卉、果树、蔬菜上的作用作了广泛的研究，发现其具有延缓植物生长抑制茎枝伸长、使茎杆粗壮等作用。但是若多效唑直接混合在琼脂内难以释放，不能有效作用于植物，同时还会出现局部高浓度、毒性大等问题，若采用定期喷洒的方式作用于植株矮化，又会降低植物的矮化率，导致矮化程度也不理想、矮化不均匀，难以实现矮株育苗的工厂化大批量生产。因此，寻找一种可以高效培育矮株百子莲的培育方法亟不可待。
发明内容
鉴于此，本发明的目的是提供一种高效培育矮株百子莲的方法，以解决矮株植物矮化率低、矮化程度不理想、矮化不均匀，难以实现矮株育苗的工厂化规模化生产的问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种高效培育矮株百子莲的方法，该方法包括以下步骤：
(1)取无菌材料：取百子莲根部作外植体，消毒杀菌后将外植体切成小段；
进一步，具体的方法为：取生长旺盛、无虫无害的百子莲的根部，用自来水冲洗1-2h后置于超净工作台上，用65-75wt％的乙醇溶液浸泡30-90s后再用体积浓度为1-3‰的升汞溶液浸泡5-10min，最后用无菌水冲洗5-6次。用无菌滤纸吸干根部表面的水分后，将根部外植体切成0.7-1.0cm的小段，备用。
(2)外植体诱导与增殖：将外植体小段接种于透明质酸培养基上，在25-28℃的条件下暗培养4-6天，继续在25-28℃的条件下光照培养2-4天，光照强度为 1200-1600lx，光照时间为16±2h/d，得到愈伤组织；将诱导后得到的愈伤组织切下，放置在增殖培养基上，在25-28℃的条件下、光照强度为1200-1600lx、光照时间为16±2h/d的条件下进行增殖培育20-30天，得到不定芽；
(3)壮苗培养：将不定芽转至透明质酸培养基上25-28℃的条件下光照培养20-40天，光照强度为1200-1600lx，光照时间为16±2h/d，得到壮苗后的不定芽，壮苗后的不定芽约为0.3-0.6cm；
(4)生根培养：取壮苗后的不定芽转入生根培养基中在培养温度为25-28℃，光照为1500-2000lx，光照时间为14±2h/d的条件下培养5-15天左右诱导生根，得到根须长至4-6cm的生根苗；
(5)炼苗与移栽：将生根苗在室内开瓶炼苗，炼苗温度为25-28℃、光照为12h±2/d、光照强度为3000-4500lx，炼苗3-5天后将生根苗取出清洗，栽于苗床中驯化20-40天后即可移栽至室外地栽。
普通的透明质酸固化程度低，外植体容易沉底，导致外植体成活率较低，同时为了解决多效唑在培养基内浓度分布不均造成的百子莲植株矮化程度不理想、矮化不均匀等问题，需要将透明质酸改性后用于植物培养基的制备。本发明将改性后的透明质酸制备成透明质酸培养基，多效唑能均匀的分布于透明质酸培养基内，缓慢释放达到矮化程度理想、矮化均匀、矮化率高的百子莲植株。
进一步，所述透明质酸培养基制备原料包括：MS培养基、6-BA、NAA、多效唑、蔗糖、透明质酸、甲基丙烯酸酐、1mol/L氢氧化钠溶液、三乙胺、四丁基硫酸氢铵和三乙醇胺。
本发明还公开了所述透明质酸培养基的制备方法如下：
A、液体培养基制备：以MS为基本培养基，分别加入6-BA、NAA、蔗糖和多效唑，搅拌均匀后得到液体培养基；
B、透明质酸改性粉末制备：于50-70℃的热水中加入透明质酸，搅拌溶解后静置溶胀10-20min；趁热加入甲基丙烯酸酐和1mol/L的氢氧化钠溶液，恒温搅拌反应1-2h；降温至35-40℃后加入三乙胺和四丁基硫酸氢铵，搅拌1-2h，得改性透明质酸溶液后，于温度-20℃和真空度5-10Pa的条件下低温干燥6-10h，取出粉碎后得到改性透明质酸粉末；
C、透明质酸培养基制备：将液体培养基加热至80℃后加入改性透明质酸粉末搅拌溶解，趁热加入三乙醇胺，于80℃恒温继续搅拌反应10-15min，搅拌完成后取出冷却至室温，得到透明质酸培养基。
进一步，所述透明质酸培养基制备方法的步骤B中，透明质酸选取的分子量为100000-2000000道尔顿。
进一步，所述步骤B中热水与透明质酸、甲基丙烯酸酐、氢氧化钠溶液、三乙胺和四丁基硫酸氢铵的添加比例为100mL：120-160g：10-30mL：1-3mL：1-3mL： 5-10g。
进一步，所述透明质酸培养基制备方法的步骤C中，所述液体培养基与改性透明质酸粉末体积质量比为100mL：60-80g。
进一步，所述液体培养基与三乙醇胺的体积比为100mL：5-10mL。
进一步，所述透明质酸培养基包括透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基，其中所述步骤(2)外植体诱导与增殖步骤中，透明质酸培养基采用透明质酸诱导培养基，所述步骤(3)壮苗培养步骤中，透明质酸培养基采用透明质酸壮苗培养基。
进一步，所述透明质酸诱导培养基中液体培养基的配方为：MS+6-BA 3-6mg/L+NAA0.3-0.8mg/L+蔗糖20-50g/L+多效唑0.6-1.0mg/L；透明质酸壮苗培养基中液体培养基的配方为：MS+6-BA 0.5-1.5mg/L+NAA 0.1-0.3mg/L+蔗糖 20-50g/L+多效唑0.6-1.0mg/L。
透明质酸在热水中溶解后，在氢氧化钠的条件下利用甲基丙烯酸酐封闭了透明质酸自身活性羟基，增加透明质酸的溶解度，提高培养基硬度，避免了透明质酸分子自身形成水凝胶，降低其溶解度和硬度。随后三乙胺、四丁基硫酸氢铵的加入增加了透明质酸分子间的间距，进一步提高了透明质酸溶解度，同时促使多效唑在透明质酸培养基中分布更均匀，改性后透明质酸与三乙醇胺再交联制成硬度合适的透明质酸培养基。将改性后的透明质酸制备成透明质酸培养基，其硬度合适，同时也能使多效唑均匀地分布于透明质酸内，适用于百子莲的矮化培养，可以得到矮化程度理想、矮化均匀、矮化率高的百子莲植株。
本发明制备的透明质酸培养基强度合适，且多效唑在透明质酸培养基中分布均匀，既可以防止透明质酸培养基因强度不够，不足以支撑外植体重量而导致的外植体腐烂，还可以解决多效唑局部浓度过高导致的植株死亡和矮化不理想的问题。
进一步，所述增殖培养基的配方为：MS+6-BA 0.5-2mg/L+NAA 0.1-0.3mg/L、蔗糖20-50g/L+琼脂5-8g/L；所述生根培养基的配方为：MS+NAA 0.1-0.3mg/L+ 蔗糖20-50g/L+琼脂5-8g/L。
有益效果：
1、多效唑均匀地分布于本发明制备的透明质酸培养基中，缓慢持续作用于百子莲外植体，有效的控制了百子莲植株的株高，同时矮化的百子莲植株矮化程度高、矮化均匀，为矮株百子莲的高效繁育提供技术指导，可以实现矮株育苗工厂化大批量生产。
2、本发明的原料不会影响植物种子的萌发与生长，制备出来的透明质酸培养基硬度合适、含水量充足、多效唑分布均匀，且不会影响植物激素的活性。
附图说明
图1为炼苗后生根苗的状态。
具体实施方式
以下将结合实施例和附图对比例本发明进行详细说明：
实施例1：透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基的制备一
A、液体培养基制备：
量取1升MS基本培养基，分别加入3mg 6-BA、0.3mg NAA、20g蔗糖和0.6mg 多效唑，搅拌均匀后得到透明质酸诱导培养基的液体培养基；
量取1升MS基本培养基，分别加入0.5mg 6-BA、0.1mg NAA、20g蔗糖和 0.6mg多效唑，搅拌均匀后得到透明质酸壮苗培养基的液体培养基；
B、透明质酸改性粉末制备：取100mL去离子水加热至50℃后加入120g透明质酸(分子量为：100000道尔顿)，搅拌溶解后静置溶胀20min；趁热加入 10mL甲基丙烯酸酐和1mol/L的氢氧化钠溶液1mL，在50℃下恒温搅拌反应2h；降温至35℃后加入三乙胺1mL和四丁基硫酸氢铵5g，搅拌2h得改性透明质酸溶液，后于温度-20℃和真空度5Pa的条件下低温干燥6h，取出粉碎后得到改性透明质酸粉末；
C、透明质酸培养基制备：分别取100mL透明质酸诱导培养基液体培养基和透明质酸壮苗培养基液体培养基，加热至80℃后分别加入改性透明质酸粉末60g 搅拌溶解后，再分别加入5mL三乙醇胺，于80℃恒温继续搅拌反应10min，搅拌完成后取出冷却至室温，得到透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基。
实施例2：透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基的制备二
A、液体培养基制备：
量取1升MS基本培养基，分别加入4mg 6-BA、0.6mg NAA、30g蔗糖和0.8mg 多效唑，搅拌均匀后得到透明质酸诱导培养基的液体培养基；
量取1升MS基本培养基，分别加入1.0mg 6-BA、0.2mg NAA、30g蔗糖和 0.8mg多效唑，搅拌均匀后得到透明质酸壮苗培养基的液体培养基；
B、透明质酸改性粉末制备：取100mL去离子水加热至60℃后加入140g透明质酸(分子量为：1000000道尔顿)，搅拌溶解后静置溶胀15min；趁热加入 20mL甲基丙烯酸酐和1mol/L的氢氧化钠溶液2mL，在60℃下恒温搅拌反应1.5h；降温至35℃后加入三乙胺2mL和四丁基硫酸氢铵8g，搅拌1.5h得改性透明质酸溶液，后于温度-20℃和真空度8Pa的条件下低温干燥8h，取出粉碎后得到改性透明质酸粉末；
C、透明质酸培养基制备：分别取100mL透明质酸诱导培养基液体培养基和透明质酸壮苗培养基液体培养基，加热至80℃后分别加入改性透明质酸粉末70g 搅拌溶解后，再分别加入8mL三乙醇胺，于80℃恒温继续搅拌反应12min，搅拌完成后取出冷却至室温，得到透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基。
实施例3：透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基的制备三
液体培养基制备：
量取1升MS基本培养基，分别加入6mg 6-BA、0.8mg NAA、50g蔗糖和1.0mg 多效唑，搅拌均匀后得到透明质酸诱导培养基的液体培养基；
量取1升MS基本培养基，分别加入1.5mg 6-BA、0.3mg NAA、50g蔗糖和 1.0mg多效唑，搅拌均匀后得到透明质酸壮苗培养基的液体培养基；
B、透明质酸改性粉末制备：取100mL去离子水加热至70℃后加入160g透明质酸(分子量为：2000000道尔顿)，搅拌溶解后静置溶胀10min；随后加入 30mL甲基丙烯酸酐和1mol/L的氢氧化钠溶液3mL，在70℃下恒温搅拌反应1h；降温至40℃后再加入三乙胺3mL和四丁基硫酸氢铵10g，搅拌1h得改性透明质酸溶液，后于温度-20℃和真空度10Pa的条件下低温干燥10h，取出粉碎后得到改性透明质酸粉末；
C、透明质酸培养基制备：分别取100mL透明质酸诱导培养基液体培养基和透明质酸壮苗培养基液体培养基，加热至80℃后分别加入改性透明质酸粉末80g 搅拌溶解后，再分别加入10mL三乙醇胺，于80℃恒温继续搅拌反应15min，搅拌完成后取出冷却至室温，得到透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基。
实施例4：矮化百子莲植株培育
本实施例在培育矮化百子莲植株的时候应该先制备相关的透明质酸诱导培养基、透明质酸壮苗培养基、增殖培养基、生根培养基，其中透明质酸诱导培养基、透明质酸壮苗培养基参考实施例2，生根培养基和增殖培养基的制备方法如下：
取1升MS基本培养基加入6-BA 1mg、NAA 0.2mg、30g蔗糖和6g琼脂加热混合均匀，高温杀菌冷却后得到增殖培养基；
取1升MS基本培养基加入NAA 0.2mg、30g蔗糖和6g琼脂加热混合均匀，冷却后得到生根培养基。
采用上述方法制备的培养基培养矮化百子莲植株，具体的培养方法如下：
(1)取无菌材料：取生长旺盛、无虫无害的百子莲的根部，用自来水冲洗 1h后置于超净工班工作台上，用75wt％的乙醇溶液浸泡60s后再用体积浓度为 2‰的升汞溶液浸泡8min，最后用无菌水冲洗5次。用无菌滤纸吸干根部表面的水分，将根部外植体切成1.0cm的小段，备用。
(2)外植体诱导与增殖：将外植体以平放状态接种于实施例2制备的透明质酸诱导培养基中，在25℃的条件下暗培养5天，继续在25-28℃的条件下光照培养3天，光照强度为1400lx，光照时间为16h/d，得到愈伤组织；将诱导后得到的愈伤组织切下，放置在增殖培养基上在25-28℃的条件下、光照强度为 1400lx、光照时间为16h/d的条件下进行增殖培育25天，得到不定芽；
(3)壮苗培养：将不定芽转至实施例2制备的透明质酸壮苗培养基上在25℃的条件下光照培养30天，光照强度为1400lx，光照时间为16h/d，得到壮苗后的不定芽，此时不定芽约为0.3-0.6cm。
(4)生根培养：将壮苗后的不定芽转入生根培养基中在培养温度为25℃，光照强度为1500lx，光照时间为16h/d的条件下培养约培养10天诱导生根，得到根须长至4-6cm的生根苗。
(5)炼苗与移栽：将生根苗在室内开瓶炼苗，炼苗温度为25℃、光照为 12h/d、光照强度为4000lx，炼苗5天后生根苗的状态如图1左边第1个所示。将生根苗取出清洗，栽于苗床中驯化40天后即可移栽至室外地栽。
空白对照：实施例4的空白对照
本对照与实施例4形成对比，其中诱导培养基、增殖培养基、壮苗培养基、生根培养基采用常规的培养基原料及其制备方法，其制备方法如下：
取1升MS基本培养基加入6-BA 4mg、NAA 0.6mg、30g蔗糖和6g琼脂加热混合均匀，高温杀菌冷却后得到诱导培养基；
取1升MS基本培养基加入6-BA 1mg、NAA 0.2mg、30g蔗糖和6g琼脂加热混合均匀，高温杀菌冷却后得到增殖培养基；
取1升MS基本培养基加入6-BA 1.0mg、NAA 0.2mg、30g蔗糖和6g琼脂加热混合均匀，冷却后得到壮苗培养基；
取1升MS基本培养基加入NAA 0.2mg、30g蔗糖和6g琼脂加热混合均匀，冷却后得到生根培养基。
采用上述方法制备的培养基培养百子莲植株，具体的培养方法如下：
(1)取无菌材料：取生长旺盛、无虫无害的百子莲的根部，用自来水冲洗 1h后置于超净工班工作台上，用75wt％的乙醇溶液浸泡60s后再用体积浓度为 2‰的升汞溶液浸泡8min，最后用无菌水冲洗5次。用无菌滤纸吸干根部表面的水分，将根部外植体切成1.0cm的小段，备用。
(2)外植体诱导与增殖：将外植体以平放状态接种于诱导培养基中，在25℃的条件下暗培养5天，光照培养3天，光照强度为1400lx，光照时间为16h/d，得到愈伤组织；将诱导后得到的愈伤组织切下，放置在增殖培养基上在25-28℃的条件下、光照强度为1400lx，光照时间为16h/d的条件下进行增殖培育25天，得到不定芽；
(3)壮苗培养：将不定芽转至壮苗培养基上在25℃的条件下光照培养30 天，光照强度为1400lx，光照时间为16h/d，得到壮苗后的不定芽，不定芽约为 0.3-0.6cm；
(4)生根培养：将壮苗后的不定芽转入生根培养基中在温度为25℃，光照强度为1500x，光照时间为16h/d的条件下培养约培养10天左右诱导生根，根得到须长至4-6cm的生根苗。
(5)炼苗与移栽：将生根苗在室内开瓶炼苗，炼苗温度为25℃、光照为 12h/d、光照强度为4000lx，炼苗5天后生根苗的状态如图1右边第2个所示。将生根苗取出清洗，栽于苗床中驯化40天后即可移栽至室外地栽，如图1右边第2个所示。
对比例1：
本对比例培养基的制备和实施例2形成对比，诱导培养基和壮苗培养基的制备方法如下：
取1升MS基本培养基加入6-BA 4mg、NAA 0.6mg、0.8mg多效唑、30g蔗糖和6g琼脂加热混合均匀，高温杀菌冷却后得到诱导培养基；
取1升MS基本培养基加入6-BA 1mg、NAA 0.2mg、0.8mg多效唑、30g蔗糖和6g琼脂加热混合均匀，高温杀菌冷却后得到壮苗培养基。
制备的诱导培养基和壮苗培养基用于矮化百子莲植株培育，其区别在于矮化百子莲植株培育过程中，将透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基换为本对比例制备的诱导培养基和壮苗培养基，其它培育过程与实施例4相同。
对比例2：
本对比例培养基的制备和实施例2形成对比，其区别仅在于制备透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基时使用的透明质酸分子量不同。
本对比例选用分子量为50000道尔顿的透明质酸制备透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基，具体的透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基制备过程如下：
A、液体培养基制备：
量取1升MS基本培养基，分别加入4mg 6-BA、0.6mg NAA、30g蔗糖和0.8mg 多效唑，搅拌均匀后得到透明质酸诱导培养基的液体培养基；
量取1升MS基本培养基，分别加入1.0mg 6-BA、0.2mg NAA、30g蔗糖和 0.8mg多效唑，搅拌均匀后得到透明质酸壮苗培养基的液体培养基；
B、透明质酸改性粉末制备：取100mL去离子水加热至60℃后加入140g透明质酸(分子量为：50000道尔顿)，搅拌溶解后静置溶胀15min；趁热加入20mL 甲基丙烯酸酐和1mol/L的氢氧化钠溶液2mL，在60℃下恒温搅拌反应1.5h；降温至35℃后加入三乙胺2mL和四丁基硫酸氢铵8g，搅拌1.5h得改性透明质酸溶液，后于温度-20℃和真空度10Pa的条件下低温干燥10h，取出粉碎后得到改性透明质酸粉末；
C、透明质酸培养基制备：分别取100mL透明质酸诱导培养基液体培养基和透明质酸壮苗培养基液体培养基，加热至80℃后分别加入改性透明质酸粉末70g 搅拌溶解后，再分别加入8mL三乙醇胺，于80℃恒温继续搅拌反应12min，搅拌完成后取出冷却至室温，得到透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基。
本对比例制备的透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基用于矮化百子莲植株培育，其培育过程与实施例4相同。
对比例3：
本对比例培养基的制备和实施例2形成对比其区别仅在于制备透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基时使用的透明质酸分子量不同。
本对比例选用分子量为3000000道尔顿的透明质酸制备透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基。具体的透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基制备过程如下：
A、液体培养基制备：
量取1升MS基本培养基，分别加入4mg 6-BA、0.6mg NAA、30g蔗糖和0.8mg 多效唑，搅拌均匀后得到透明质酸诱导培养基的液体培养基；
量取1升MS基本培养基，分别加入1.0mg 6-BA、0.2mg NAA、30g蔗糖和 0.8mg多效唑，搅拌均匀后得到透明质酸壮苗培养基的液体培养基；
B、透明质酸改性粉末制备：取100mL去离子水加热至60℃后加入140g透明质酸(分子量为：3000000道尔顿)，搅拌溶解后静置溶胀15min；趁热加入 20mL甲基丙烯酸酐和1mol/L的氢氧化钠溶液2mL，在60℃下恒温搅拌反应1.5h；降温至35℃后加入三乙胺2mL和四丁基硫酸氢铵8g，搅拌1.5h得改性透明质酸溶液，后于温度-20℃和真空度10Pa的条件下低温干燥10h，取出粉碎后得到改性透明质酸粉末；
C、透明质酸培养基制备：分别取100mL透明质酸诱导培养基液体培养基和透明质酸壮苗培养基液体培养基，加热至80℃后分别加入改性透明质酸粉末70g 搅拌溶解后，再分别加入8mL三乙醇胺，于80℃恒温继续搅拌反应12min，搅拌完成后取出冷却至室温，得到透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基。
本对比例制备的透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基用于矮化百子莲植株培育，其培育过程与实施例4相同，其炼苗后生根苗的状态如图1右边第 1个所示。
对比例4：
本对比例培养基的制备和实施例2形成对比，其区别仅在于透明质酸培养基的制备方法不同，制备时不加甲基丙烯酸酐，具体的透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基制备过程如下：
液体培养基制备：
量取1升MS基本培养基，分别加入4mg 6-BA、0.6mg NAA、0.8mg多效唑和 30g蔗糖，搅拌均匀后得到透明质酸诱导培养基的液体培养基；
量取1升MS基本培养基，分别加入1.0mg 6-BA、0.2mg NAA、0.8mg多效唑和30g蔗糖，搅拌均匀后得到透明质酸壮苗培养基的液体培养基；
B、透明质酸改性粉末制备：取100mL去离子水加热至60℃后加入140g透明质酸(分子量为：1000000道尔顿)，搅拌溶解后静置溶胀15min；趁热加入1mol/L的氢氧化钠溶液2mL，在60℃下恒温搅拌反应1h；降温至35℃后加入三乙胺2mL和四丁基硫酸氢铵8g，搅拌1.5h得改性透明质酸溶液，后于温度-20℃和真空度10Pa的条件下低温干燥10h，取出粉碎后得到改性透明质酸粉末；
C、透明质酸培养基制备：分别取100mL透明质酸诱导培养基液体培养基和透明质酸壮苗培养基液体培养基，加热至80℃后分别加入改性透明质酸粉末70g 搅拌溶解后，再分别加入8mL三乙醇胺，于80℃恒温继续搅拌反应12min，搅拌完成后取出冷却至室温，得到透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基。
制备的透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基用于矮化百子莲植株培育，其培育过程与实施例4相同。
对比例5：
本对比例培养基的制备和实施例2形成对比其区别仅在于透明质酸培养基的制备方法不同，制备时不加1mol/L的氢氧化钠溶液，具体的透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基制备过程如下：
液体培养基制备：
量取1升MS基本培养基，分别加入4mg 6-BA、0.6mg NAA、0.8mg多效唑和 30g蔗糖，搅拌均匀后得到透明质酸诱导培养基的液体培养基；
量取1升MS基本培养基，分别加入1.0mg 6-BA、0.2mg NAA、0.8mg多效唑和30g蔗糖，搅拌均匀后得到透明质酸壮苗培养基的液体培养基；
B、透明质酸改性粉末制备：取100mL去离子水加热至60℃后加入140g透明质酸(分子量为：1000000道尔顿)，搅拌溶解后静置溶胀15min；趁热加入 20mL甲基丙烯酸酐，在60℃下恒温搅拌反应1.5h；降温至35℃后加入三乙胺 2mL和四丁基硫酸氢铵8g，搅拌1.5h得改性透明质酸溶液，后于温度-20℃和真空度10Pa的条件下低温干燥10h，取出粉碎后得到改性透明质酸粉末；
C、透明质酸培养基制备：取100mL透明质酸诱导培养基液体培养基和透明质酸壮苗培养基液体培养基，加热至80℃后分别加入改性透明质酸粉末70g搅拌溶解后，再分别加入8mL三乙醇胺，于80℃恒温继续搅拌反应12min，搅拌完成后取出冷却至室温，得到透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基。
制备的透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基用于矮化百子莲植株培育，其培育过程与实施例4相同。
对比例6：
本对比例培养基的制备和实施例2形成对比，其区别仅在于透明质酸培养基的制备方法不同，制备时不加三乙胺，具体的透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基制备过程如下：
液体培养基制备：
量取1升MS基本培养基，分别加入4mg 6-BA、0.6mg NAA、0.8mg多效唑和 30g蔗糖，搅拌均匀后得到透明质酸诱导培养基的液体培养基；
量取1升MS基本培养基，分别加入1.0mg 6-BA、0.2mg NAA、0.8mg多效唑和30g蔗糖，搅拌均匀后得到透明质酸壮苗培养基的液体培养基；
B、透明质酸改性粉末制备：取100mL去离子水加热至60℃后加入140g透明质酸(分子量为：1000000道尔顿)，搅拌溶解后静置溶胀15min；趁热加入 20mL甲基丙烯酸酐和1mol/L的氢氧化钠溶液2mL，在60℃下恒温搅拌反应1.5h；降温至35℃后加入四丁基硫酸氢铵8g，搅拌1.5h得改性透明质酸溶液，后于温度-20℃和真空度10Pa的条件下低温干燥10h，取出粉碎后得到改性透明质酸粉末；
C、透明质酸培养基制备：分别取100mL透明质酸诱导培养基液体培养基和透明质酸壮苗培养基液体培养基，加热至80℃后分别加入改性透明质酸粉末70g 搅拌溶解后，再分别加入8mL三乙醇胺，于80℃恒温继续搅拌反应12min，搅拌完成后取出冷却至室温，得到透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基。
制备的透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基用于矮化百子莲植株培育，其培育过程与实施例4相同，其炼苗后生根苗的状态如图1左边第2个所示。
对比例7：
本对比例培养基的制备和实施例2形成对比，其区别仅在于透明质酸培养基的制备方法不同，制备时不加四丁基硫酸氢铵，具体的透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基制备过程如下：
液体培养基制备：
量取1升MS基本培养基，分别加入4mg 6-BA、0.6mg NAA、0.8mg多效唑和 30g蔗糖，搅拌均匀后得到透明质酸诱导培养基的液体培养基；
量取1升MS基本培养基，分别加入1.0mg 6-BA、0.2mg NAA、0.8mg多效唑和30g蔗糖，搅拌均匀后得到透明质酸壮苗培养基的液体培养基；
B、透明质酸改性粉末制备：取100mL去离子水加热至60℃后加入140g透明质酸(分子量为：1000000道尔顿)，搅拌溶解后静置溶胀15min；趁热加入 20mL甲基丙烯酸酐和1mol/L的氢氧化钠溶液2mL，在60℃下恒温搅拌反应1.5h；降温至35℃后加入三乙胺2mL，搅拌1.5h得改性透明质酸溶液，后于温度-20℃和真空度10Pa的条件下低温干燥10h，取出粉碎后得到改性透明质酸粉末；
C、透明质酸培养基制备：分别取100mL透明质酸诱导培养基液体培养基和透明质酸壮苗培养基液体培养基，加热至80℃后分别加入改性透明质酸粉末70g 搅拌溶解后，再分别加入8mL三乙醇胺，于80℃恒温继续搅拌反应12min，搅拌完成后取出冷却至室温，得到透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基。
制备的透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基用于矮化百子莲植株培育，其培育过程与实施例4相同。
对比例8：
本对比例培养基的制备和实施例2形成对比，其区别仅在于制备透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基时加入改性透明质酸粉末和三乙醇胺的用量不同。
本对比例加入改性透明质酸粉末为40g，三乙醇胺3mL，具体的透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基制备过程如下：
液体培养基制备：
量取1升MS基本培养基，分别加入4mg 6-BA、0.6mg NAA、0.8mg多效唑和 30g蔗糖，搅拌均匀后得到透明质酸诱导培养基的液体培养基；
量取1升MS基本培养基，分别加入1.0mg 6-BA、0.2mg NAA、0.8mg多效唑和30g蔗糖，搅拌均匀后得到透明质酸壮苗培养基的液体培养基；
B、透明质酸改性粉末制备：取100mL去离子水加热至60℃后加入140g透明质酸(分子量为：1000000道尔顿)，搅拌溶解后静置溶胀15min；趁热加入 20mL甲基丙烯酸酐和1mol/L的氢氧化钠溶液2mL，在60℃下恒温搅拌反应1.5h；降温至35℃后加入三乙胺2mL和四丁基硫酸氢铵8g，搅拌1.5h得改性透明质酸溶液，后于温度-20℃和真空度10Pa的条件下低温干燥10h，取出粉碎后得到改性透明质酸粉末；
C、透明质酸培养基制备：分别取100mL透明质酸诱导培养基液体培养基和透明质酸壮苗培养基液体培养基，加热至80℃后分别加入改性透明质酸粉末40g 搅拌溶解后，再分别加入3mL三乙醇胺，于80℃恒温继续搅拌反应12min，搅拌完成后取出冷却至室温，得到透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基。
制备的透明质酸诱导培养基和或透明质酸壮苗培养基用于矮化百子莲植株培育，其培育过程与实施例4相同。
对比例9：
本对比例培养基的制备和实施例2形成对比，其区别仅在于制备透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基时加入改性透明质酸粉末和三乙醇胺用量不同。
本对比例加入改性透明质酸粉末120g，三乙醇胺20mL，具体的透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基制备过程如下：
液体培养基制备：
量取1升MS基本培养基，分别加入4mg 6-BA、0.6mg NAA、0.8mg多效唑和30g蔗糖，搅拌均匀后得到透明质酸诱导培养基的液体培养基；
量取1升MS基本培养基，分别加入1.0mg 6-BA、0.2mg NAA、0.8mg多效唑和30g蔗糖，搅拌均匀后得到透明质酸壮苗培养基的液体培养基；
B、透明质酸改性粉末制备：取100mL去离子水加热至60℃后加入140g透明质酸(分子量为：1000000道尔顿)，搅拌溶解后静置溶胀15min；趁热加入 20mL甲基丙烯酸酐和1mol/L的氢氧化钠溶液2mL，在60℃下恒温搅拌反应1.5h；降温至35℃后加入三乙胺2mL和四丁基硫酸氢铵8g，搅拌1.5h得改性透明质酸溶液，后于温度-20℃和真空度10Pa的条件下低温干燥10h，取出粉碎后得到改性透明质酸粉末；
C、透明质酸培养基制备：分别取100mL透明质酸诱导培养基液体培养基和透明质酸壮苗培养基液体培养基，加热至80℃后分别加入改性透明质酸粉末 120g搅拌溶解后，再分别加入20mL三乙醇胺，于80℃恒温继续搅拌反应12min，搅拌完成后取出冷却至室温，得到透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基。
制备的透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基用于矮化百子莲植株培育，其培育过程与实施例4相同。
结果：
1、在进行对比例1-9的过程中，由于对比例2的透明质酸分子量选用的是 50000道尔顿低于100000道尔顿，所以经过改性后仍然硬度较低，形成液体状凝胶未形成固态凝胶，所以对比例2未制成透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基，所以导致百子莲植株培养不成功，外植体全部死亡。
2、对比例4和对比例5于在不加甲基丙烯酸酐或1mol/L氢氧化钠溶液的情况下，均不能得到具有一定硬度的透明质酸培养基，得到了液体凝胶，未制成透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基，所以导致百子莲植株培养不成功，外植体全部死亡。
其余对比例成功的制成固体培养基，成功制得的透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基用于矮化百子莲植株培育。
一、培养基硬度测试
选用实施例1-3制备的透明质酸诱导培养基和对比例1、对比例3和对比例 6-9制备的透明质酸诱导培养基的进行对比硬度，具体操作方法如下：
从琼脂培养基和透明质酸诱导培养基取3cm×3cm×3cm正方体大小的胶体，将50ml小烧杯置于胶体上，向其中逐渐加入沙子至胶体破碎为止，称量烧杯及沙子的质量，将沙子重量记为凝胶硬度(g)，每组重复三次记录，得到的结果如表1所示。
表1
数据分析，由表1可知：
1、实施例1-3制备的透明质酸培养基和对比例1制备琼脂培养基硬度相似，可知本发明制备的透明质酸导培养基可用于植物的组织培养。
2、结合实际实验结果，实施例2与对比例2-3制备的培养基对比可知，当透明质酸分子量低于100000道尔顿时不能形成固态凝胶，当透明质酸分子量大于2000000道尔顿时形成的固体凝胶硬度过大，不利于多效唑以及凝胶中营养物质的释放，导致矮化程度不理想以及植物发育缓慢。
3、实施例2与对比例4-7相比没有添加甲基丙烯酸酐、1mol/L氢氧化钠溶液或三乙胺、四丁基硫酸氢铵，导致透明质酸的自身活性羟基未被封闭，造成透明质酸溶解度降低，缩短了分子间间距，进而降低了透明质酸培养基硬度以及多效唑的分散度降低，造成外植体陷入培养基内，进而引起外植体腐烂死亡、植物矮化不成功以及矮化不均匀等问题。
4、实施例2与对比例8-9相比，在于透明质酸培养基制备时添加的透明质酸粉末和三乙醇胺用量改变，当改性透明质酸粉末和三乙醇胺用量越大凝胶交联程度大，得到的透明质酸凝胶硬度越大，反之透明质酸凝胶硬度越小。这主要是因为改性透明质酸粉末和三乙醇胺的均会为透明质酸凝胶再次交联提供位点，以此来影响透明质酸凝胶的交联程度，进而影响透明质酸凝胶硬度。凝胶硬度过小外植体容易陷入培养基内，进而引起外植体腐烂死亡。凝胶硬度过大外植体诱导生根困难或者根系难以吸收营养物质，进而造成外植体的死亡或生长缓慢。
5、因此，透明质酸分子量与甲基丙烯酸酐、氢氧化钠溶液、三乙胺、四丁基硫酸氢铵、三乙醇胺之间的协同配比作用于透明质酸培养基，原料结合制备步骤制备出硬度合适、适合于组织培养的透明质酸培养基。
二、百子莲植株矮化实验
采用实施例4、空白对照、对比例1、对比例3和对比例6-9的方法进行百子莲植株矮化培育。
选用5-6年生的成熟百子莲、无虫害的根作为外植体材料；每个培养基培养 2个外植体，共培育外植体50株，三个重复，将炼苗后的百子莲植株移栽至同条件的苗圃内，正常管护。
移栽1个月后记录三个重复的幼苗平均存活率，同时将初次平均株高记为初次株高，正常管护两年后记录测量二次平均株高，记为二次株高，根据结果计算矮化率及株差，得到的数据如表2所示：
幼苗平均存活率(％)＝(存活株数重复1+存活株数重复2+存活株数重复3) /总培育株数×100％；
平均生长量(cm)＝二次平均株高-初次平均株高；
矮化率(％)＝三次重复总矮化植株/(存活株数重复1+存活株数重复2+存活株数重复3)×100％，其中矮化植株为管护2年后株高低于空白对照平均株高10％的百子莲植株；
株差(cm)＝最高植株高度-最矮植株高度；
表2
数据分析，由表2可知：
1、对比实施例4和空白对照中培育百子莲幼苗的平均存活率、矮化率和株差可以看出，本发明方法培育的百子莲植株具有更高的百子莲幼苗存活率，为 98.00％，比空白对照增高了13.33％，两年后得到的百子莲矮化率高达91.84％。其中实施例4和空白对照相比，空白对照株差虽然仅为0.21cm，但是平均生长量为17.80cm，说明空白对照的百子莲植株生长较为迅速，植株高度较高，未达成矮化目的，实施例4的平均生长量为7.38cm，株差仅为0.81cm，说明矮化成功，且植株之间矮化均匀。
2、通过实施例4和对比例1可以看出将多效唑加入相应琼脂中作用于植株得到的百子莲幼苗存活率降低。对比例1矮化率仅为48.21％，与实施例4相差 43.63％，且株差增大了2.31cm，则进一步说明多效唑添加于琼脂内，会导致多效唑分布不均匀，造成百子莲植物矮化率低且矮化不均匀，局部浓度过高导致存活率下降。
3、通过实施例4与对比例3对比可知，对比例3培育的百子莲幼苗的存活率、矮化率、平均生长量均比较低，这是由于透明质酸分子量高得到的透明质酸培养基硬度过大百子莲外植体诱导生根困难或者根系难以吸收营养物质，进而造成外植体的死亡或生长缓慢。
4、通过实施例4与对比例6-7对比可知，对比例6-7培育百子莲幼苗的存活率、矮化率较低，且株差差异较大，这是由于甲基丙烯酸酐、氢氧化钠溶液、四丁基硫酸氢铵、三乙胺之间具有协同作用。由于透明质酸通过甲基丙烯酸酐、氢氧化钠溶液的共同作用使得透明质酸自身活性羟基封闭，避免了透明质酸分子自身形成水凝胶，增加透明质酸的溶解度，随后与三乙胺和四丁基硫酸氢铵再次协同增加了透明质酸分子间的间距，得到的改性透明质酸分散性高、制得的透明质酸培养基硬度合适，除了防止植物沉底易腐烂外，还能使多效唑在透明质酸培养基中分布均匀。这样制备的透明质酸培养基培育得到的百子莲矮化程度高、矮化均匀、存活率高。
5、通过实施例4与对比例8-9对比可知，对比例8-9培育的百子莲幼苗的存活率、矮化率较低，且株差差异较大，这是由于改性透明质酸粉末和三乙醇胺的用量与透明质酸的交联程度相关，之间具有协同作用。改性透明质酸粉末和三乙醇胺用量少交联不充分，导致分透明质酸硬度低，导致植物易腐烂，三乙醇胺和改性透明质酸粉末用量多，得到的透明质酸硬度大，不适合外植体生根发芽，因此只有在本发明公开的配比下制备得到的透明质酸培养基可以用于培养矮化百子莲，且培育的百子莲矮化程度高、矮化均匀、存活率高。
6、本发明的方法培育出来的百子莲幼苗平均存活率为98.00％、两年平均生长量为7.38cm，矮化率达到91.84％，以及株差为0.81cm。幼苗平均存活率提高，是因为透明质酸培养基内的多效唑分布均匀，同时透明质酸培养基可以有效控制营养物质和调节剂的释放，提高了幼苗的幼苗平均存活率，同时抑制了植株的生长，得到了矮化率高，矮化均匀的百子莲植株。为矮株百子莲的高效繁育提供技术指导，提高了百子莲的观赏价值及经济价值。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。
Claims (10)
1.一种高效培育矮株百子莲的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)取无菌材料：取百子莲根部作外植体，消毒杀菌后将外植体切成小段；
(2)外植体诱导与增殖：将外植体小段接种于透明质酸培养基上，在25-28℃的条件下暗培养4-6天后，继续光照培养得到愈伤组织；将诱导后得到的愈伤组织切下，放置在增殖培养基上光照培育，得到不定芽；
(3)壮苗培养：将不定芽转至透明质酸培养基上25-28℃条件下光照培养，得到壮苗后的不定芽，不定芽为0.3-0.6cm；
(4)生根培养：壮苗后的不定芽转入生根培养基中在温度为25-28℃，光照强度为1500-2000lx，光照时间为14±2h/d条件下培养至根系达4-6cm的生根苗；
(5)炼苗与移栽：将生根苗在室内开瓶炼苗，炼苗温度为25-28℃、光照为12h±2/d、光照强度为3000-4500lx，炼苗3-5天后将生根苗取出清洗，栽于苗床中驯化20-40天后即可移栽至室外地栽。
2.根据权利要求1所述的一种高效培育矮株百子莲的方法，其特征在于，所述透明质酸培养基的制备原料包括：MS培养基、6-BA、NAA、多效唑、蔗糖、透明质酸、甲基丙烯酸酐、1mol/L氢氧化钠溶液、三乙胺、四丁基硫酸氢铵和三乙醇胺。
3.根据权利要求2所述的一种高效培育矮株百子莲的方法，其特征在于，所述透明质酸培养基的制备方法如下：
A、液体培养基制备：以MS为基本培养基，分别加入6-BA、NAA、蔗糖和多效唑，搅拌均匀后得到液体培养基；
B、透明质酸改性粉末制备：于50-70℃的热水中加入透明质酸，搅拌溶解后静置溶胀10-20min；趁热加入甲基丙烯酸酐和1mol/L的氢氧化钠溶液，恒温搅拌反应1-2h；降温至35-40℃后加入三乙胺和四丁基硫酸氢铵，搅拌1-2h，得改性透明质酸溶液，后于温度-20℃和真空度5-10Pa的条件下低温干燥6-10h，取出粉碎后得到改性透明质酸粉末；
C、透明质酸培养基制备：将液体培养基加热至80℃后加入改性透明质酸粉末搅拌溶解，趁热加入三乙醇胺，于80℃恒温搅拌反应10-15min，搅拌完成后取出冷却至室温，得到透明质酸培养基。
4.根据权利要求3所述的一种高效培育矮株百子莲的方法，其特征在于，所述透明质酸培养基制备方法的步骤B中，选取分子量为100000-2000000道尔顿的透明质酸。
5.根据权利要求4所述的一种高效培育矮株百子莲的方法，其特征在于，所述步骤B中，所述热水与透明质酸、甲基丙烯酸酐、氢氧化钠溶液、三乙胺和四丁基硫酸氢铵的添加比例为100mL：120-160g：10-30mL：1-3mL：1-3mL：5-10g。
6.根据权利要求5所述的一种高效培育矮株百子莲的方法，其特征在于，所述透明质酸培养基制备方法的步骤C中，所述液体培养基与改性透明质酸粉末体积质量比为100mL：60-80g。
7.根据权利要求6所述的一种高效培育矮株百子莲的方法，其特征在于，所述透明质酸培养基制备方法的步骤C中，所述液体培养基与三乙醇胺的体积比为100mL：5-10mL。
8.根据权利要求3所述的一种高效培育矮株百子莲的方法，其特征在于，所述透明质酸培养基包括透明质酸诱导培养基和透明质酸壮苗培养基；
其中所述透明质酸诱导培养基中液体培养基的配方为：MS+6-BA 3-6mg/L+NAA 0.3-0.8mg/L+蔗糖20-50g/L+多效唑0.6-1.0mg/L；所述透明质酸壮苗培养基中液体培养基的配方为：MS+6-BA 0.5-1.5mg/L+NAA 0.1-0.3mg/L+蔗糖20-50g/L+多效唑0.6-1.0mg/L。
9.根据权利要求8所述的一种高效培育矮株百子莲的方法，其特征在于，所述步骤(2)外植体诱导与增殖步骤中，透明质酸培养基采用透明质酸诱导培养基；所述步骤(3)壮苗培养步骤中，透明质酸培养基采用透明质酸壮苗培养基。
10.根据权利要求1所述的一种高效培育矮株百子莲的方法，其特征在于，所述增殖培养基的配方为：MS+6-BA 0.5-2mg/L+NAA 0.1-0.3mg/L+蔗糖20-50g/L+琼脂5-8g/L；生根培养基的配方为：MS+NAA 0.1-0.3mg/L+蔗糖20-50g/L+琼脂5-8g/L。
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|---|---|---|---|---|
| CN116649221A (zh) * | 2023-07-26 | 2023-08-29 | 云南昊辰农业有限公司 | 百子莲组培快繁方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108293862A (zh) * | 2018-01-25 | 2018-07-20 | 上海为绿景观建设有限公司 | 一种非洲百合的快速繁殖方法 |
| CN109479723A (zh) * | 2019-01-07 | 2019-03-19 | 信阳农林学院 | 一种提高百子莲体胚苗诱导效果的方法 |
| CN109729979A (zh) * | 2019-03-04 | 2019-05-10 | 信阳农林学院 | 一种促进百子莲体胚萌发同步化率的方法 |
| CN109937883A (zh) * | 2019-04-26 | 2019-06-28 | 上海市园林科学规划研究院 | 百子莲矮生重瓣品种‘钻石重’的种苗快速繁育方法 |
| US20200178534A1 (en) * | 2016-12-13 | 2020-06-11 | Rothamsted Research Limited | Induction of floral development in plants |
-
2022
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20200178534A1 (en) * | 2016-12-13 | 2020-06-11 | Rothamsted Research Limited | Induction of floral development in plants |
| CN108293862A (zh) * | 2018-01-25 | 2018-07-20 | 上海为绿景观建设有限公司 | 一种非洲百合的快速繁殖方法 |
| CN109479723A (zh) * | 2019-01-07 | 2019-03-19 | 信阳农林学院 | 一种提高百子莲体胚苗诱导效果的方法 |
| CN109729979A (zh) * | 2019-03-04 | 2019-05-10 | 信阳农林学院 | 一种促进百子莲体胚萌发同步化率的方法 |
| CN109937883A (zh) * | 2019-04-26 | 2019-06-28 | 上海市园林科学规划研究院 | 百子莲矮生重瓣品种‘钻石重’的种苗快速繁育方法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116649221A (zh) * | 2023-07-26 | 2023-08-29 | 云南昊辰农业有限公司 | 百子莲组培快繁方法 |
| CN116649221B (zh) * | 2023-07-26 | 2023-09-22 | 云南昊辰农业有限公司 | 百子莲组培快繁方法 |
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