CN116649221B - 百子莲组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
百子莲组培快繁方法，属于生物组培技术。本发明的方法包括外植体获得、清洁、消毒、初代丛生芽诱导、继代丛生芽的增殖、丛生芽的生根培养和驯化步骤。其中，初代丛生芽的诱导培养基为MS+NAA 0.02‑0.05mg/L+IAA 0.01‑0.02mg/L+ZT 0.5‑0.8mg/L+2‑ip 0.1‑0.2mg/L；继代丛生芽的增殖培养基为改良MS+IAA 0.05‑0.08mg/L+ZT 1.2‑1.5mg/L+BR 0.03‑0.05mg/L；丛生芽的生根培养基为1/2MS+NAA 0.2‑0.3mg/L+IAA 0.5‑0.8mg/L+椰汁50‑60ml/L。本发明的方法不论是消毒污染率、消毒死亡率、初代丛生芽诱导率、继代丛生芽增殖系数，还是生根率以及驯化成活率，均优于现有技术。
Description
技术领域
本发明属于园艺和生物技术领域，特别涉及百子莲的组培快繁方法。
背景技术
百子莲（Agapanthus praecox）为石蒜科百子莲属多年生常绿草本植物，原产南非，由于其观赏价值高，抗逆性强，逐渐被大众认知。随着国内市场的逐步拓展，国内逐步开展百子莲的优良品种（品系）筛选，使得百子莲品种（品系）多元化，但由于百子莲的主要繁殖方式为种子繁殖，而其存在繁殖周期长、易杂交变异等缺点，使得筛选出的优良品种（品系）不能短期内获得大量且稳定遗传母本性状的种苗。
近年来，对百子莲的组培繁育技术，大多采用诱导愈伤后，再进行芽的分化，最后获得生根苗的方法。现有报道中通过外植体直接诱导丛生芽的，存在诱导率低，同时增殖系数亦较低的问题。
发明内容
本发明针对现有技术不足，提出一种利用百子莲根状茎，不经过愈伤途径就能高效诱导丛生芽，再通过丛生芽的增殖以及生根，获得健壮生根苗的方法。
百子莲组培快繁方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤1，取土表基部根状茎为外植体，并进行清洁；
步骤2，外植体消毒；
步骤3，初代丛生芽的诱导；
步骤4，继代丛生芽的增殖；
步骤5，丛生芽的生根培养；
步骤6，组培苗驯化管理；
步骤2所述的消毒方式是：采用75%酒精震摇消毒20-30s，然后采用0.1%升汞溶液震摇消毒4-5min，之后采用0.2%双氧水静置消毒12-24h，最后采用0.05%升汞溶液震摇消毒3-4min；
步骤3所述初代丛生芽的诱导培养基为MS+NAA 0.02-0.05mg/L+IAA 0.01-0.02mg/L+ZT 0.5-0.8mg/L+2-ip 0.1-0.2mg/L；
步骤4所述继代丛生芽的增殖培养基为改良MS+IAA 0.05-0.08mg/L+ZT 1.2-1.5mg/L+BR 0.03-0.05mg/L；
所述改良MS为以MS为基础，将硝酸铵用量改为3.00g/L，七水硫酸镁用量改为0.15g/L，二水氯化钙用量改为0.15g/L，糖用量改为45-50g/L，其余成分不变的MS；
步骤5所述丛生芽的生根培养基为1/2MS+NAA 0.2-0.3mg/L+IAA 0.5-0.8mg/L+椰汁50-60ml/L。
步骤1所述的根状茎外植体需完全剥去表皮鳞茎。
步骤6驯化培养基为按质量5:1配比的泥炭土与珍珠岩混合物。
本发明的技术效果表现为：
1、现有技术中大都采用的花梗、花苞、花蕾、叶片等外植体，季节性较强，而本发明采用土表根茎做外植体，一年四季均可采，不受季节限制。
2、本发明根茎外植体采用75%酒精、0.1%升汞溶液、0.2%双氧水以及0.05%升汞溶液复合消毒，可使消毒污染率控制到15%以内，同时几乎不造成根茎损伤。
3、本发明初代诱导培养时，采用NAA、IAA、ZT和2-ip的适宜浓度组合，可直接从根状茎诱导出大量丛生芽，减少了现有技术中愈伤分化丛生芽的步骤，且本发明初代丛生芽诱导率几乎接近100%，而高的诱导率一方面减少了材料的耗损，另一方面极大程度的提高了工作效率，缩短了生产周期。
4、本发明在继代增殖培养时，采用IAA、ZT和BR的适宜浓度组合，一方面去掉了价格较高的2-ip而利用价格相对较低的BR，另一方面可使丛生芽增殖系数从现有技术的2.5-5.5提高到7.0以上。而对于组培生产中，增殖系数的高低，很大程度决定了生产成本、生产周期以及管理成本。
5、本发明在继代增殖培养时，采用提高硝酸铵和糖的用量，降低硫酸镁和氯化钙的用量的改良MS为基本培养基，可使继代增殖培养时玻化的发生率降低到1.5%以下，且玻化苗不影响继续继代增殖。
6、本发明在生根培养时，采用了NAA和IAA的适宜浓度组合，同时添加一定浓度的椰汁，可使非玻化苗生根率为100%，增殖中的玻化苗生根率也可达90%以上，且玻化能完全恢复至正常状态。
附图说明
图1为实施例1已清洁干净的外植体图片。
图2为实施例1继代增殖芽图片。
图3为对比例5继代增殖芽图片。
其中，图2显示实施例1继代增殖芽几乎无玻化，而对比例5继代增殖芽玻化极其严重。
具体实施方式
实施例1：百子莲组培快繁方法，具体步骤如下：
步骤1，外植体的选择与前处理：
挖取百子莲，剪去叶及须根，保留基部根状茎，用自来水冲去基部泥土，之后剥去表皮鳞片，同时用小刀适当削去凹陷部位；
外植体的清洁：将处理过的外植体，用自来水冲洗3次后，再用软毛刷蘸取饱和肥皂液溶液，反复刷洗外植体表面至表面无明显脏物，用自来水再次冲洗3次，最后在滴加了3滴吐温-80的溶液中浸泡4h后，自来水再冲淋60min。
步骤2：消毒：将清洁好的外植体转移至超净工作台中，用无菌纸吸去表面水分后用75%酒精震摇消毒30s，无菌水涮洗3次，后用0.1%升汞溶液震摇消毒4min，无菌水涮洗4次，再用0.2%双氧水静置消毒12h，再用无菌水涮洗3次，最后用0.05%升汞溶液震摇消毒3min，然后用无菌水涮洗7次。
步骤3，初代丛生芽的诱导：将消毒好的外植体，用无菌纸吸去表面水分，接种于MS+NAA 0.02mg/L+IAA 0.01mg/L+ZT 0.5mg/L+2-ip 0.1mg/L的初代丛生芽诱导培养基中，置于温度25±2℃下，暗培养7天，后温度不变，光照和暗环境交替培养50天，光照强度2000-3000lx，每日光照时间10h。
步骤4，继代丛生芽的增殖：将诱导出的丛生芽，切成具2-3芽的小丛，按极性接种于改良MS+IAA 0.05mg/L+ZT 1.2mg/L+BR 0.03mg/L的丛生芽增殖培养基中，置于温度25±2℃下，光照和暗环境交替培养45天，光照强度2000-3000lx，每日光照时间10h；
所述的改良MS为以MS为基础，将硝酸铵用量改为3.00g/L，七水硫酸镁用量改为0.15g/L，二水氯化钙用量改为0.15g/L，糖用量改为45g/L，其余成分不变的MS。
步骤5，丛生芽的生根：将继代增殖的丛生芽，切成单芽，按极性接种于1/2MS+NAA0.2mg/L+IAA 0.5mg/L+椰汁50ml/L的生根培养基中，置于温度25±2℃下，光照和暗环境交替培养30天，光照强度2000-3000lx，每日光照时间12h。
步骤6，驯化：将生根苗出瓶后，洗净培养基，栽植于按质量5:1配比的泥炭土与珍珠岩混合基质中，同时进行常规的组培苗驯化管理。
实施例2：百子莲组培快繁方法，具体步骤如下：
步骤1，外植体的选择与前处理：挖取百子莲，剪去叶及须根，保留基部根状茎，用自来水冲去基部泥土，后剥去表皮鳞片，同时用小刀适当削去凹陷部位；
外植体的清洁：将处理过的外植体，用自来水冲洗3次后，再用软毛刷蘸取饱和肥皂液溶液，反复刷洗外植体表面至表面无明显脏物，用自来水再次冲洗3次，最后滴加3滴吐温-80的溶液中浸泡6h后，自来水再冲淋50min。
步骤2，消毒：将清洁好的外植体转移至超净工作台中，用无菌纸吸去表面水分后用75%酒精震摇消毒30s，无菌水涮洗3次，后用0.1%升汞溶液震摇消毒5min，无菌水涮洗5次，再用0.2%双氧水静置消毒24h，无菌水涮洗3次，最后用0.05%升汞溶液震摇消毒4min，然后用无菌水涮洗7次。
步骤3，初代丛生芽的诱导：将消毒好的外植体，用无菌纸吸去表面水分，接种于MS+NAA 0.05mg/L+IAA 0.02mg/L+ZT 0.8mg/L+2-ip 0.2mg/L的初代丛生芽诱导培养基中，置于温度25±2℃下，暗培养10天，后温度不变，光照和暗环境交替培养45天，光照强度2000-3000lx，每日光照时间10h。
步骤4，继代丛生芽的增殖：将诱导出的丛生芽，切成具2-3芽的小丛，按极性接种于改良MS+IAA 0.08mg/L+ZT 1.5mg/L+BR 0.05mg/L的丛生芽增殖培养基中，置于温度25±2℃下，光照和暗环境交替培养50天，光照强度2000-3000lx，每日光照时间10h；
所述的改良MS为以MS为基础，将硝酸铵用量改为3.00g/L，七水硫酸镁用量改为0.15g/L，二水氯化钙用量改为0.15g/L，糖用量改为50g/L，其余成分不变的MS。
步骤5，丛生芽的生根：将继代增殖的丛生芽，切成单芽，按极性接种于1/2MS+NAA0.3mg/L+IAA 0.8mg/L+椰汁60ml/L的生根培养基中，置于温度25±2℃下，光照和暗环境交替培养40天，光照强度2000-3000lx，每日光照时间12h。
步骤6，驯化：将生根苗出瓶后，洗净培养基，栽植于按质量5:1配比的泥炭土与珍珠岩混合基质中，同时进行常规的组培苗驯化管理。
对比例1：以根状茎为外植体，照实施例1的外植体前处理及清洁方法进行处理。照尹原森等发表《百子莲组织培养技术研究》[J]，林业科学，2021（22）：108-109.的消毒方法进行外植体消毒。具体消毒方法是：外植体在超净工作台上用 75%乙醇浸泡 60s后倒人0.1%升汞溶液浸泡 15 min,其间不停摇晃,使外植体与消毒剂充分接触.最后用无菌水冲洗 6遍。并采用其筛选的最佳MS+2,4-D 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+6-BA 2.0mg/L初代诱导培养基，MS+NAA 0.1mg/L+6-BA 3.0mg/L继代增殖培养基与1/2MS+NAA0.5mg/L生根培养基进行初代诱导、继代增殖和生根培养。驯化过程是将生根苗出瓶后，洗净培养基，栽植于按质量5:1配比的泥炭土与珍珠岩混合基质中，同时进行常规的组培苗驯化管理。
对比例2：以根状茎为外植体，照实施例1的外植体前处理及清洁方法进行处理。照刘芳伊等发表《百子莲组培快繁与植株再生》[J]，2011（13）：121-124.的消毒方法进行外植体的消毒。具体消毒方法是：将外植体浸入 70%酒精消毒1min,然后用无菌水冲洗 3 次，随后用01%HgCl2溶液处理3 min，期间不断用玻璃棒搅拌，最后用无菌水冲洗 6次。采用实施例1的诱导培养基进行初代诱导。照刘芳伊等发表的《百子莲组培快繁与植株再生》[J]，2011（13）：121-124中的MS+6-BA4,0mg/L+NAA 0.lmg/L最佳增殖培养基、1/2MS+IAA0.5 mg/L生根培养基进行继代增殖和生根培养。驯化过程是将生根苗出瓶后，洗净培养基，栽植于按质量5:1配比的泥炭土与珍珠岩混合基质中，同时进行常规的组培苗驯化管理。
对比例3：以根状茎为外植体，照实施例1的外植体前处理及清洁方法进行处理。照胡仲义等发表《百子莲组织培养与植株再生研究》[J]，北方园艺，2011（10）：118-120.的消毒方法进行外植体的消毒。具体消毒方法是：外植体用 75%乙醇浸泡 30 s后用0.1%升汞处理振荡灭菌 10 min;然后用无菌水冲洗5-6遍。并采用其筛选的MS+NAA 0.1mg/L+6-BA4.0mg/L最佳初代诱导培养基、MS+NAA0.2mg/L+6-BA 2.0mg/L+GA3 0.1mg/L继代增殖培养基和1/2MS+NAA 0.1mg/L+AC 0.1g/L生根培养基进行初代诱导、继代增殖和生根培养。驯化过程是将生根苗出瓶后，洗净培养基，栽植于按质量5:1配比的泥炭土与珍珠岩混合基质中，同时进行常规的组培苗驯化管理。
对比例4：以根状茎为外植体，照实施例1的外植体前处理及清洁方法进行处理。照马坷馨发表《蓝百合组织培养再生体系的建立》[D]，哈尔滨：东北林业大学，2007.的根茎消毒方法进行消毒。具体消毒方法是：外植体用75%(v/v)酒精表面杀菌 30s，然后再加入0.1%升汞，杀菌3min。并采用其筛选的最佳MS+2,4-D 1.0mg/L+6-BA 1.0mg/L+KT 0.05mg/L初代诱导培养基、MS+NAA 0.05mg/L+6-BA 1.0mg/L继代增殖培养基及1/2MS+IBA 0.1mg/L生根培养基进行初代诱导、继代增殖和生根培养。驯化过程是将生根苗出瓶后，洗净培养基，栽植于按质量5:1配比的泥炭土与珍珠岩混合基质中，同时进行常规的组培苗驯化管理。
对比例5：以根状茎为外植体，照实施例1的外植体前处理及清洁方法进行处理。照专利《百子莲矮生重瓣品种“钻石重”的种苗快速繁育方法》（CN201910344497）的消毒方法进行消毒。具体消毒方法是：先用体积百分比浓度为75％的酒精冲涮30s，无菌水冲洗至少2次，然后用体积百分比浓度为0.1％的氯化汞溶液摇动消毒6min，无菌水冲洗至少2次，剥去外层包裹叶、露出心芽；然后加入0.05％氯化汞溶液浸泡1min，无菌水冲洗至少2次。同时采用MS+NAA 0.1mg/L+6-BA 4.0mg/L初代诱导培养基、MS+NAA 0.1mg/L+6-BA 6.0mg/L与MS+NAA 0.1mg/L+6-BA 4.0mg/L继代增殖培养基、MS+NAA 0.05mg/L+6-BA 0.2mg/L壮苗培养基以及1/2MS+NAA 0.2mg/L生根培养基进行初代诱导、交替继代增殖、壮苗和生根培养。驯化过程是将生根苗出瓶后，洗净培养基，栽植于按质量5:1配比的泥炭土与珍珠岩混合基质中，同时进行常规的组培苗驯化管理。
对比例6：以根状茎为外植体，照实施例1的外植体前处理及清洁方法进行处理。照实施例1步骤2所述的消毒方法进行外植体消毒。照专利《一种百子莲组织培养种苗繁育方法》（CN201710316826）的花宝1号 1.0g/L+花多多1号 1.0g/L+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L+椰汁 50ml/L初代诱导培养基、MS+IAA 0.1mg/L+TDZ 0.0025mg/L+6-BA 0.5mg/L继代增殖培养基、MS+AC0.5g/L壮苗培养基和MS+NAA 0.5mg/L+IBA 0.5mg/L+AC 0.5g/L生根培养基进行初代诱导、继代增殖、壮苗和生根培养。驯化过程是将生根苗出瓶后，洗净培养基，栽植于按质量5:1配比的泥炭土与珍珠岩混合基质中，同时进行常规的组培苗驯化管理。
对比例7：以根状茎为外植体，照实施例1步骤1的外植体前处理及清洁方法进行处理。照专利《百子莲的组培快繁方法》（CN200610118550）的消毒方法进行消毒，具体消毒方法是：浓度为0.05％的汞溶液消毒，然后自来水冲洗，再用漂白粉与水体积比为1∶3的漂白粉水溶液消毒。同时用其MS+6-BA 8.0mg/L初代诱导培养基、MS+6-BA 4.0mg/L继代增殖培养基和1/2MS+IBA 2.0mg/L生根培养基进行初代诱导、继代增殖和生根培养。驯化过程是将生根苗出瓶后，洗净培养基，栽植于按质量5:1配比的泥炭土与珍珠岩混合基质中，同时进行常规的组培苗驯化管理。
将按实施例1、2与对比例1-7的方法得到的组培结果进行对比，对比数据列于下表1中。
表1
| 实施例 | 消毒污染率 | 消毒死亡率 | 初代丛生芽诱导率 | 继代丛生芽增殖系数 | 继代丛生芽玻化率 | 非玻化丛生芽生根率 | 玻化丛生芽生根率 | 30天驯化成活率 |
| 实施例1 | 13.4% | 0 | 98.6% | 7.6 | 0.8% | 100% | 90.8% | 99.6% |
| 实施例2 | 10.9% | 0.4% | 99.4% | 7.9 | 1.1% | 100% | 91.3% | 98.9% |
| 对比例1 | 8.6% | 9.4% | 34.7% | 3.9 | 6.8% | 94.3% | 12.9% | 92.8% |
| 对比例2 | 84.3% | 0 | 99.6% | 5.3 | 12.0% | 100% | 36.7% | 90.3% |
| 对比例3 | 20.4% | 53.8% | 56.9% | 4.5 | 2.9% | 95.0% | 14.7% | 93.6% |
| 对比例4 | 54.7% | 3.9% | 46.5% | 2.4 | 0.2% | 98.5% | 89.3% | 92.0% |
| 对比例5 | 63.2% | 0 | 78.8% | 5.5 | 34.9% | 84.5% | 1.8% | 97.7% |
| 对比例6 | 12.9% | 0 | 74.9% | 5.6 | 8.7% | 74.6% | 0 | 97.6% |
| 对比例7 | 74.3% | 0 | 91.2% | 5.1 | 20.6% | 90.6% | 5.1% | 80.3% |
| 11.8% | 0.2% |
从上表1可以看出，利用根茎做外植体时，本发明的消毒方法能最大程度的降低外植体带菌，同时还能防止消毒剂对外植体的损伤，而对于初代丛生芽诱导、继代丛生芽增殖，本发明的诱导率以及增殖系数均高于现有技术，同时，由于本发明采用改良MS为基本培养基，很大程度的降低了丛生芽玻化率的发生，而从生产角度看，玻化的丛生芽，几乎为废苗，不能再用于进一步生产成商品苗。对比例2、对比例5、对比例6以及对比例7，其玻化发生率均较高，猜测与其高的细胞分裂素有关，而这四个对比例在其增殖过程中发现，增殖苗较为纤弱，特别是对比例2和对比7，没有经过壮苗步骤，驯化成活率相对较低。而对比例6在生根时，其生根率发现整体较低，猜测与其使用的TDZ有关，而本发明在继代增殖中采用了低剂量的细胞分裂素，同时在生根时采用了NAA和IAA的组合，并添加了一定浓度的椰汁，一方面省去了壮苗步骤，可直接使苗更加健壮，另一方面由于根系发达，驯化成活率亦较高。
本发明的实施例1和实施例2，不论是消毒污染率、消毒死亡率、初代丛生芽诱导率、继代丛生芽增殖系数，还是生根率以及驯化成活率，均优于现有技术。
Claims (3)
1.百子莲Agapanthus praecox组培快繁方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤1，取土表基部根状茎为外植体，并进行清洁；
步骤2，外植体消毒；
步骤3，初代丛生芽的诱导；
步骤4，继代丛生芽的增殖；
步骤5，丛生芽的生根培养；
步骤6，组培苗驯化管理；
步骤2消毒方式是：采用75%酒精震摇消毒20-30s，然后采用0.1%升汞溶液震摇消毒4-5min，之后采用0.2%双氧水静置消毒12-24h，最后采用0.05%升汞溶液震摇消毒3-4min；
步骤3所述初代丛生芽的诱导培养基为MS+NAA 0.02-0.05mg/L+IAA 0.01-0.02mg/L+ZT 0.5-0.8mg/L+2-ip 0.1-0.2mg/L；
步骤4所述继代丛生芽的增殖培养基为改良MS+IAA 0.05-0.08mg/L+ZT 1.2-1.5mg/L+BR 0.03-0.05mg/L；
所述改良MS为以MS为基础，将硝酸铵用量改为3.00g/L，七水硫酸镁用量改为0.15g/L，二水氯化钙用量改为0.15g/L，糖用量改为45-50g/L，其余成分不变的MS；
步骤5所述丛生芽的生根培养基为1/2MS+NAA 0.2-0.3mg/L+IAA 0.5-0.8mg/L+椰汁50-60ml/L。
2.根据权利要求1所述的百子莲Agapanthus praecox组培快繁方法，其特征在于步骤1所述的根状茎外植体需完全剥去表皮鳞茎。
3.根据权利要求1所述的百子莲Agapanthus praecox组培快繁方法，其特征在于步骤6驯化培养基为按质量5:1配比的泥炭土与珍珠岩混合物。
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