CN115316654A - 一种具有降血压作用的松露发酵液制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有降血压作用的松露发酵滤液制备方法，包括以下步骤：将米曲霉、乳酸杆菌，分别接种到PDA固体培养基、MRS固体培养基上培养得到初步米曲霉和初步乳酸杆菌；再分别接种到米曲霉液体培养基、MRS液体培养基上震荡培养得到米曲霉菌悬液和乳酸杆菌菌悬液；按重量比取原料、葡萄糖、酵母粉、玉米淀粉以及水，粉碎后灭菌，冷却后得到松露发酵培养基，原料由白松露、黑松露的一种或两种混合；将米曲霉菌悬液、乳酸杆菌菌悬液一种或两种的混合接种到松露发酵培养基中震荡发酵得到松露发酵液；将松露发酵液过滤得到松露发酵滤液。本发明还公开了一种具有降血压作用的松露发酵滤液的应用。本发明制得的松露发酵液具有很高的降血压效果。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵制备功能食品技术领域，尤其涉及一种具有降血压作用的松露发酵液制备方法。
背景技术
高血压是指以体内循环动脉血压增高为主要特征，可能伴有心、脑、肾、等器官的功能或器质性损伤的临床综合征。高血压是一种最常见的慢性疾病，也是心脑血管病最主要的危险因素。近年来，随着人口的增加和生活环境饮食习惯的影响，我国高血压患者越来越多，在国际上居于首位。
血管紧张素转换酶（ACE）又称激肽酶Ⅱ。属于血管内皮细胞膜结合酶。ACE广泛分布于人体各组织。ACE作用为将血管紧张素Ⅰ转换为血管紧张素Ⅱ，并将缓激肽降解为尾货行的片段，进而引起血管收缩，导致血压升高。因此，抑制ACE是治疗高血压的一个有效途径。通过ACE抑制剂作用，阻遏血管紧张素Ⅱ的形成，从而达到降低血压的目的。目前，治疗高血压主要依赖于西药，这类化学合成的药物，具有很强的副作用，长期服用对人体有一定的伤害。我国物产丰富，药物和菌种资源发达，从子实体真菌中获取治疗高血压疾病的研究逐步发展起来。近年来，多项研究表面，蘑菇等子实体中含有大量的ACE抑制剂，与合成药相比较，它作用温和，适合长期服用，对于慢性病的调理具有非常好的作用。但由于子实体中ACE抑制剂难以富集，提取困难，存在开发瓶颈。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有降血压作用的松露发酵液制备方法。
本发明的创新点在于提供了一种主要由白松露、黑松露为底物，经过米曲霉和乳酸杆菌发酵、过滤或得的ACE抑制发酵液。该发酵液由白松露和黑松露子实体粉碎后，接种米曲霉和乳酸杆菌进行发酵作用，米曲霉中活性酶对白松露和黑松露细胞壁进行溶解，释放出松露中的活性物，从而提升了松露发酵后的ACE抑制活性。本发明制得的松露发酵液具有很高的降血压效果。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案是：一种具有降血压作用的松露发酵滤液制备方法，包括以下步骤：
（1）将米曲霉、乳酸杆菌，分别接种到PDA固体培养基、MRS 固体培养基上培养得到初步米曲霉和初步乳酸杆菌；
（2）将初步米曲霉和初步乳酸杆菌再分别接种到米曲霉液体培养基、MRS 液体培养基上震荡培养得到米曲霉菌悬液和乳酸杆菌菌悬液；
（3）按重量比取原料10~20份、葡萄糖1~3份、酵母粉0.2~1份、玉米淀粉0.5~1份以及水55~80份，粉碎后混合均匀，在121℃下灭菌20 min，自然冷却后得到松露发酵培养基，所述原料由白松露、黑松露的一种或两种混合；
（4）将米曲霉菌悬液、乳酸杆菌菌悬液一种或两种的混合接种到松露发酵培养基中并置于恒温摇床中震荡发酵2~3天得到松露发酵液；
（5）将松露发酵液用200 nm陶瓷膜进行过滤，得到松露发酵滤液。
进一步地，米曲霉菌悬液和乳酸杆菌菌悬液的重量为松露发酵液重量和的10~20%。
进一步地，所述步骤（4）中米曲霉菌悬液、乳酸杆菌菌悬液混合时，米曲霉菌悬液、乳酸杆菌菌悬液的重量比为1:1。
一种具有降血压作用的松露发酵滤液的应用，所述松露发酵滤液应用在降压保健品或功能性食品中。
本发明还公开了一种具有降血压作用的松露发酵滤液的应用。
本发明的有益效果是 ：
1、本发明中采用天然菌种进行发酵，发酵作用条件温和；米曲霉发达的蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等在发酵过程中，起到软化子实体细胞壁，释放出子实体活性成分的功能，通过乳酸杆菌的发酵，使得松露发酵液中富含小分子ACE抑制剂，易于人体肠道的吸收，显著提高了松露发酵物的利用率。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1：一种具有降血压作用的松露发酵滤液制备方法，将米曲霉、乳酸杆菌，分别接种到PDA固体培养基、MRS 固体培养基上培养得到初步米曲霉和初步乳酸杆菌；
米曲霉——从-80℃冰箱中，取米曲霉甘油冻存管，于超净工作台中吸取200μL孢子液，用涂布棒均匀涂布到预制的PDA固体培养基上，于28℃培养箱中，倒置培养2 天后，再次于超净台中，用无菌生理盐水，冲洗下孢子，得到初步米曲霉，将初步米曲霉接种至米曲霉液体培养基中，在28℃，220rpm培养48 h得到米曲霉菌悬液；
乳酸杆菌——从-80℃冰箱中，取鼠李糖乳杆菌甘油冻存管，于超净工作台中吸取200μL菌悬液，用涂布棒均匀涂布到预制的无菌MRS 固体培养基上，于35℃培养箱中，倒置培养12h后，再次于超净台中，用接种环挑取单菌落，无菌操作划线到新鲜的预制MRS 固体培养基上，同样条件培养12h。长出菌苔后，于超净台中，无菌操作挑取一环初步乳酸杆菌接种至MRS 液体培养基中，于35℃摇床中，220rpm培养12 h得到乳酸杆菌菌悬液。
MRS 培养基为：蛋白胨 10 g/L，牛肉粉 10 g/L，酵母浸膏5 g/L，葡萄糖 20 g/L（葡萄糖单独灭菌），柠檬酸氢二铵 2 g/L，无水乙酸钠 5 g/L，磷酸氢二钠 2 g/L，吐温 801 ml/L，七水合硫酸镁 0.58 g/L，一水合硫酸锰 0.25 g/L，琼脂 15 g/L（固体培养基中添加），pH 7.0，121℃灭菌20min；
其中PDA固体培养基为：土豆浸粉20%，葡萄糖2 %,琼脂2 %，其余为纯化水；采用121℃灭菌20 min；
米曲霉液体培养基为：大米粉 2%，葡萄糖 1%，酵母粉0.5%；采用121℃灭菌20min；
按重量比取原料10份、葡萄糖1份、酵母粉0.2份、玉米淀粉0.5份以及水55份，粉碎后混合均匀，在121℃下灭菌20 min，自然冷却后得到松露发酵培养基，原料为白松露、黑松露两种混合；白松露、黑松露的质量比为1：1，将米曲霉菌悬液、乳酸杆菌菌悬液两种的混合接种到松露发酵培养基中并置于恒温摇床中震荡发酵2天得到松露发酵液；米曲霉菌悬液、乳酸杆菌菌悬液混合时，米曲霉菌悬液、乳酸杆菌菌悬液的重量比为1:1。米曲霉菌悬液和乳酸杆菌菌悬液的重量和为松露发酵液重量的10%。将松露发酵液用200 nm陶瓷膜进行过滤，得到松露发酵滤液。
实施例2：一种具有降血压作用的松露发酵滤液制备方法，将米曲霉、乳酸杆菌，分别接种到PDA固体培养基、MRS 固体培养基上培养得到初步米曲霉和初步乳酸杆菌；
米曲霉——从-80℃冰箱中，取米曲霉甘油冻存管，于超净工作台中吸取200μL孢子液，用涂布棒均匀涂布到预制的PDA固体培养基上，于35℃培养箱中，倒置培养3 天后，再次于超净台中，用无菌生理盐水，冲洗下孢子，得到初步米曲霉，将初步米曲霉接种至米曲霉液体培养基中，在35℃，220rpm培养48 h得到米曲霉菌悬液；
乳酸杆菌——从-80℃冰箱中，取鼠李糖乳杆菌甘油冻存管，于超净工作台中吸取200μL菌悬液，用涂布棒均匀涂布到预制的无菌MRS 固体培养基上，于37℃培养箱中，倒置培养48 h后，再次于超净台中，用接种环挑取单菌落，无菌操作划线到新鲜的预制MRS 固体培养基上，同样条件培养48 h。长出菌苔后，于超净台中，无菌操作挑取一环初步乳酸杆菌接种至MRS 液体培养基中，于37℃摇床中，220rpm培养48 h得到乳酸杆菌菌悬液。
MRS 培养基为：蛋白胨 10 g/L，牛肉粉 10 g/L，酵母浸膏5 g/L，葡萄糖 20 g/L（葡萄糖单独灭菌），柠檬酸氢二铵 2 g/L，无水乙酸钠 5 g/L，磷酸氢二钠 2 g/L，吐温 801 ml/L，七水合硫酸镁 0.58 g/L，一水合硫酸锰 0.25 g/L，琼脂 15 g/L（固体培养基中添加），pH 7.2，121℃灭菌20min；
其中PDA固体培养基为：土豆浸粉20%，葡萄糖2 %,琼脂2 %，其余为纯化水；采用121℃灭菌20 min；
米曲霉液体培养基为：大米粉 2%，葡萄糖 1%，酵母粉0.5%；采用121℃灭菌20min；
按重量比取原料15份、葡萄糖2份、酵母粉0.6份、玉米淀粉0.8份以及水70份，粉碎后混合均匀，在121℃下灭菌20 min，自然冷却后得到松露发酵培养基，原料为黑松露；将米曲霉菌悬液、乳酸杆菌菌悬液混合接种到松露发酵培养基中并置于恒温摇床中震荡发酵2.5天得到松露发酵液；米曲霉菌悬液、乳酸杆菌菌悬液混合时，米曲霉菌悬液、乳酸杆菌菌悬液的重量比为1:1。米曲霉菌悬液和乳酸杆菌菌悬液的重量和为松露发酵液重量的15%。将松露发酵液用200 nm陶瓷膜进行过滤，得到松露发酵滤液。
实施例3：一种具有降血压作用的松露发酵滤液制备方法，将米曲霉接种到PDA固体培养基初步米曲霉；
米曲霉——从-80℃冰箱中，取米曲霉甘油冻存管，于超净工作台中吸取200μL孢子液，用涂布棒均匀涂布到预制的PDA固体培养基上，于30℃培养箱中，倒置培养2.5 天后，再次于超净台中，用无菌生理盐水，冲洗下孢子，得到初步米曲霉，将初步米曲霉接种至米曲霉液体培养基中，在30℃，220rpm培养48 h得到米曲霉菌悬液；
其中PDA固体培养基为：土豆浸粉20%，葡萄糖2 %,琼脂2 %，其余为纯化水；采用121℃灭菌20 min；
米曲霉液体培养基为：大米粉 2%，葡萄糖 1%，酵母粉0.5%；采用121℃灭菌20min；
按重量比取原料20份、葡萄糖13份、酵母粉1份、玉米淀粉1份以及水80份，粉碎后混合均匀，在121℃下灭菌20 min，自然冷却后得到松露发酵培养基，原料为白松露；将米曲霉菌悬液接种到松露发酵培养基中并置于恒温摇床中震荡发酵3天得到松露发酵液；米曲霉菌悬液的重量为松露发酵液重量的20%。将松露发酵液用200 nm陶瓷膜进行过滤，得到松露发酵滤液。
实施例4：一种具有降血压作用的松露发酵滤液制备方法，将乳酸杆菌，接种到MRS固体培养基上培养得到初步乳酸杆菌；
乳酸杆菌——从-80℃冰箱中，取鼠李糖乳杆菌甘油冻存管，于超净工作台中吸取200μL菌悬液，用涂布棒均匀涂布到预制的无菌MRS 固体培养基上，于36℃培养箱中，倒置培养36 h后，再次于超净台中，用接种环挑取单菌落，无菌操作划线到新鲜的预制MRS 固体培养基上，同样条件培养36 h。长出菌苔后，于超净台中，无菌操作挑取一环初步乳酸杆菌接种至MRS 液体培养基中，于36℃摇床中，220rpm培养368 h得到乳酸杆菌菌悬液。
MRS 培养基为：蛋白胨 10 g/L，牛肉粉 10 g/L，酵母浸膏5 g/L，葡萄糖 20 g/L（葡萄糖单独灭菌），柠檬酸氢二铵 2 g/L，无水乙酸钠 5 g/L，磷酸氢二钠 2 g/L，吐温 801 ml/L，七水合硫酸镁 0.58 g/L，一水合硫酸锰 0.25 g/L，琼脂 15 g/L（固体培养基中添加），pH 7.1，121℃灭菌20min；
按重量比取原料18份、葡萄糖2.5份、酵母粉0.8份、玉米淀粉0.6份以及水60份，粉碎后混合均匀，在121℃下灭菌20 min，自然冷却后得到松露发酵培养基，原料为白松露和黑松露；白松露和黑松露重量比为1:2，将乳酸杆菌菌悬液接种到松露发酵培养基中并置于恒温摇床中震荡发酵2.5天得到松露发酵液。乳酸杆菌菌悬液的重量为松露发酵液重量的16%。将松露发酵液用200 nm陶瓷膜进行过滤，得到松露发酵滤液。
对比例1：参考实施例1，将米曲霉菌悬液和乳酸杆菌菌悬液的重量和调整为松露发酵液重量的5%。
对比例2：参考实施例1，将米曲霉菌悬液和乳酸杆菌菌悬液的重量和调整为松露发酵液重量的25%。
对比例3：参考实施例2，将黑松露替换成桦褐孔菌。
对比例4：参考实施例2，将黑松露替换成灰树花。
对比例5：参考实施例3，将白松露替换成黑松露。
对比例6：参考实施例4，将原料替换成白松露。
对比例7：参考实施例4，将原料替换成黑松露。
测试实施例1~4，对比例1~7的结果：
| A1 | A2 | A3 | 平均值 | 抑制率/% | |
| 实施例1 | 0.245 | 0.212 | 0.248 | 0.235 | 86.3 |
| 实施例2 | 0.325 | 0.284 | 0.274 | 0.294 | 78.0 |
| 实施例3 | 0.542 | 0.531 | 0.588 | 0.554 | 41.5 |
| 实施例4 | 0.416 | 0.384 | 0.438 | 0.413 | 61.3 |
| 对比例1 | 0.623 | 0.661 | 0.687 | 0.657 | 26.9 |
| 对比例2 | 0.521 | 0.578 | 0.574 | 0.558 | 40.9 |
| 对比例3 | 0.775 | 0.762 | 0.754 | 0.764 | 11.9 |
| 对比例4 | 0.626 | 0.617 | 0.625 | 0.623 | 31.7 |
| 对比例5 | 0.61 | 0.615 | 0.573 | 0.599 | 35.0 |
| 对比例6 | 0.423 | 0.436 | 0.456 | 0.438 | 57.7 |
| 对比例7 | 0.447 | 0.458 | 0.478 | 0.461 | 54.5 |
| 对照组 | 0.847 | 0.853 | 0.846 | 0.849 | |
| 空白组 | 0.136 | 0.137 | 0.142 | 0.138 |
（1）ACE抑制率测试方法：
采用ACE Kit-WST 试剂盒（日本关东化学）并测定其ACE抑制活性，样品组20 μL加入到96孔酶标板中，空白组和对照组分别加入去离子水20 μL，然后每孔加入20 μL底物缓冲液。分别加入20 μL酶工作液，对照组加入去离子水20 μL。在37℃下孵育1小时后，在每孔中添加200 μL的指示剂，继续孵育10 min, 并在450 nm处测定其吸光值。ACE抑制活性测定公式如下：
ACE抑制活性（%）= [1-(样品组-空白组）/(对照组-空白组)] × 100
实施例5：一种具有降血压作用的松露发酵滤液的应用，松露发酵滤液应用在降压保健品或功能性食品中。
所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (4)
1.一种具有降血压作用的松露发酵滤液制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将米曲霉、乳酸杆菌，分别接种到PDA固体培养基、MRS 固体培养基上培养得到初步米曲霉和初步乳酸杆菌；
（2）将初步米曲霉和初步乳酸杆菌再分别接种到米曲霉液体培养基、MRS 液体培养基上震荡培养得到米曲霉菌悬液和乳酸杆菌菌悬液；
（3）按重量比取原料10~20份、葡萄糖1~3份、酵母粉0.2~1份、玉米淀粉0.5~1份以及水55~80份，粉碎后混合均匀，在121℃下灭菌20 min，自然冷却后得到松露发酵培养基，所述原料由白松露、黑松露的一种或两种混合；
（4）将米曲霉菌悬液、乳酸杆菌菌悬液一种或两种的混合接种到松露发酵培养基中并置于恒温摇床中震荡发酵2~3天得到松露发酵液；
（5）将松露发酵液用200 nm陶瓷膜进行过滤，得到松露发酵滤液。
2.根据权利要求1所述的具有降血压作用的松露发酵滤液制备方法，其特征在于，米曲霉菌悬液和乳酸杆菌菌悬液的重量为松露发酵液重量和的10~20%。
3.根据权利要求1所述的具有降血压作用的松露发酵滤液制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中米曲霉菌悬液、乳酸杆菌菌悬液混合时，米曲霉菌悬液、乳酸杆菌菌悬液的重量比为1:1。
4.一种如权利要求1~3任一所述的具有降血压作用的松露发酵滤液的应用，其特征在于，所述松露发酵滤液应用在降压保健品或功能性食品中。
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| US20170189461A1 (en) * | 2015-12-31 | 2017-07-06 | Chia Nan University Of Pharmacy & Science | Method of preparing fermented crude extract having angiotensin converting enzyme inhibiting activity |
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2022
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| US20170189461A1 (en) * | 2015-12-31 | 2017-07-06 | Chia Nan University Of Pharmacy & Science | Method of preparing fermented crude extract having angiotensin converting enzyme inhibiting activity |
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