CN115316279A - 一种抑菌开放式组培培养基的配制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑菌开放式植物组培培养基的配制方法，属于植物组培领域。本发明主要目的是为了解决开放式培养过程中加入抑菌剂会对外植体产生毒害的问题，通过添加柠檬酸和维生素C，不仅解决了抑菌剂毒性问题，还能促进植物组织分化，具有较好效果。

Description

一种抑菌开放式组培培养基的配制方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及植物组培领域。

技术背景

植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性这个理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术。植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在无菌条件下接种在含有各种营养物质及植物激素的培养基上进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。狭义是指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。

在植物组培过程中，选择合适的培养基是一件非常重要的事。目前植物组培常用的培养基中，MS培养基因其全面的元素组分和方便快捷的配制方法受到相关工作者们广泛的选用。

常规组培需要高压灭菌，某些易分解激素还需要经过超滤灭菌，分装，才能达到无菌效果，不仅能耗消耗大，而且对组培人员的操作要求也比较高。

开放组培是不经过高压灭菌，通过添加抑菌剂的方式达到抑制杂菌的生长，以达到灭菌的目的。但抑菌剂对外植体有一定毒害作用，其培养效果一般较常规组培效果差。但MS培养基在使用过程中需要加入抑菌剂来抑制杂菌增殖，抑菌剂对植物组织的分化和生长有抑制作用，进而影响植物组培的效果。

发明内容

本发明目的在于提供一种新的抑菌开放式培养基的配制方法，以此来抑制组培过程中的杂菌增殖，并降低抑菌剂对植物组织发育分化的影响。

本发明具体配方与步骤如下：

以MS培养基为基本培养基，添加蔗糖30g/L，柠檬酸80mg/L，琼脂5g/L，Vc 0.2g/L，按照不同需求添加植物激素，经过熬制分装后，转移至超净工作台上观察3d。

本发明有益效果为，通过引入柠檬酸和Vc，抑制杂菌增殖，且不会抑制植物组织的生长分化。

具体实施方式

通过下述实施例进一步详尽阐述本发明的具体内容，以便更好的理解本发明。

实施例一

抑菌剂的选择

本研究采用代森锰锌、百菌清和链霉素的抑菌组合，开放诱导时代森锰锌、百菌清和链霉素浓度均为0.1g/L；开放增殖和生根时代森锰锌浓度为0.1g/L，百菌清和链霉素浓度皆为0.2g/L；在添加代森锰锌、百菌清和链霉素之后，加入1ml/L的10％NaClO，探究在此情况下的外植体长势情况。

外植体的消毒处理

取预处理后的虎掌叶片，用0.2％多菌灵溶液震荡消毒20min、1％次氯酸钠消毒6min和75％酒精消毒40s左右的配合消毒方式，根据材料的数量，接种相应数量的培养基。

开放培养基与开放对照培养基的配制

MS培养基为基本培养基，添加蔗糖30g/L，柠檬酸80mg/L，琼脂 5g/L，Vc 0.2g/L和抑菌剂，按照不同培养基的生长需求，添加不同配比的2，4-D，TDZ，6-BA和KT，应材料需求，配置所需体积，熬制之后置于超净工作台上3d，辨别培养基是否出现污染。传统培养基以MS培养基为基本培养基，添加蔗糖30g/L，柠檬酸80mg/L，琼脂5g/L，Vc 0.2g/L，按照不同培养基的生长需求，添加2，4-D 0.1mg/L，TDZ(0.01mg/L、0.05mg/L)，6-BA 1.5mg/L，经过熬制分装后在高压蒸汽灭菌锅中灭菌，转移至超净工作台上观察3d。

开放诱导培养基中激素浓度及其组合如表1所示

表1

实验结果分析如表2所示

表2

从表2可以看出，在开放条件下，虎掌叶片在接种完成后，外植体开始发育的部位均为边缘伤口处、外部形态变化过程相似，在本研究的情况下，低浓度的TDZ对外植体的丛生芽形成有很强的促进作用，且随着TDZ浓度的升高，外植体的芽点数减少，从而影响丛生芽的数量；在2，4-D浓度为0.3mg/L时，接种30d未出现污染，出现愈伤组织和芽点的情况非常少，仅有浅绿色的圆形突起，后期形成芽点的同时也在快速形成愈伤组织，在这个过程中，外植体的生长状态不及其他处理；而当2，4-D浓度为0.5mg/L时，整个过程中，一直都在形成丛生芽，后期形成愈伤组织的速度也较快，体积越大，愈伤组织呈乳白色，表面有凹凸不平的小颗粒。通过对照实验可以看出，在诱导时间、光照条件等因素保持一致的情况下，未添加VC和柠檬酸的外植体长势完全不如添加VC和柠檬酸的外植体，从芽点或芽数和外植体的表现状况等方面都可以发现，VC和柠檬酸对外植体的生长状况有一定的促进作用。

本试验的开放效果与传统开放效果相比，未出现污染，而传统诱导传统诱导在40d时，因污染数众多，所以在污染时就及时清理了，后期统计的诱导率是未污染且发育的外植体在存活外植体中所占的比例。虽然经过传统组培配方与开放诱导配方对比来看，MS+1.5mg/L 6- BA+0.05mg/L TDZ+0.1mg/L 2，4-D+5g/L琼脂+蔗糖30g/L+Vc0.2g/L+ 柠檬酸80mg/L的平均芽点数和芽数占优势，但其污染率很高，达 41.7％，而开放诱导配方Y1污染率低，诱导率高，平均芽点数和芽数也仅比传统组培的最佳配方低2.71。综合各方面数据而言，开放诱导配方更能适应快速的繁殖体系和市场的需求量。

Claims (2)

1.一种抑菌开放式培养基的配制方法，包括以下步骤：以MS培养基为基本培养基，以MS培养基为基本培养基，添加蔗糖30g/L，琼脂5g/L，经正常熬煮，琼脂融化后，待温度降低到50℃左右，添加柠檬酸80mg/L，Vc 0.2g/L和抑菌剂(代森锰锌、百菌清和链霉素浓度均为0.1g/L)，同时按照不同需求添加植物激素，定溶，搅拌均匀后直接分装。

2.一种如权利要求1所述的抑菌开放式培养基的配制方法在植物开放式组培中的应用。