CN115290414A - 一种白菜型冬油菜染色体制片方法及其应用 - Google Patents
一种白菜型冬油菜染色体制片方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种白菜型冬油菜染色体制片方法及其应用。涉及遗传学技术领域。包括以下步骤：取材：待冬油菜根尖将长至1～1.5cm时，每间隔2h取一次根尖并固定，取材时间为8：00～10：00；预处理；低温进行预处理；固定；解离；采用酸解法或酶解法；染色和镜检。本发明表明预处理：4℃冰水混合物处理20h最优，染色体分散且形态清晰，固定：卡诺氏固定液处理12h染色体的结构明显，解离：1mol/LHCl处理10～15min染色体的分散程度相对良好且后续染色效果好；25℃用1％果胶酶和2％纤维素酶混合溶液解离1h同样可以良好解离；使用卡宝品红染液染色15min并在100×油镜下进行观察，可获得效果比较好的中期分裂相。
Description
技术领域
本发明涉及遗传学技术领域，更具体的说是涉及一种白菜型冬油菜染色体制片方法及其应用。
背景技术
白菜型冬油菜是由原产于我国西北地区的大白菜演化来的，植株矮小，分枝较小，茎秆纤细，有薄而光滑的椭圆形叶片。边缘有明显的琴状缺刻，上有刺毛，覆被一层薄薄的腊粉，又称为小油菜、矮油菜和甜油莱，根据油菜种植季节的不同，油菜有春油菜和冬油菜之分。白菜型冬油菜是我国西北寒旱区一种重要的冬季油料作物，具有高产、耐寒和耐旱性强的优点，同时白菜型冬油菜又是冬、春两季地表有效覆盖作物之一，其在农业生产中具有显著的生态效益和经济效益。
目前关于白菜型冬油菜多集中于其抗寒机制的研究，而关于其植物染色体制片和核型参数的细胞学方面的的报道较少。
一种生物的染色体核型是相当固定的，对染色体核型分析在研究植物的起源、系统演化以及物种间亲缘关系等方面都起着重要意义。核型分析可作为植物学分类和遗传研究的一个重要手段，从而使学者们在研究分类时对有争议的植物有更多的参考资料，以便以达到意见上的统一。
因此，如何提供一种白菜型冬油菜染色体制片方法及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种白菜型冬油菜染色体制片方法及其应用。为了获得更好的白菜型冬油菜染色体制片效果及确定白菜型冬油菜核型公式和不对称程度，本发明以强耐寒型白菜型冬油菜陇油7号为材料，首先对其染色体制片的几个关键步骤进行条件优化，随后采用最佳制片条件进行核型分析，以期为进一步深入研究该物种的系统进化以及遗传趋势等问题提供了一定的理论基础。
根尖因其细胞分裂比较旺盛，生长不易受季节的限制且容易获得。因此本发明所采用的植物材料为白菜型冬油菜根尖。白菜型冬油菜的染色体较小，根据Lima-de-Faria的染色体的电场理论，白菜型冬油菜染色体属于微小染色体(Lima-de-Faria 1980)。当对中等大小的染色体进行分析时，即使有个别染色体的重叠，也仍可区分出来每条染色体的轮廓，并且也一般可以用于染色体的核型分析。但是当染色体是微小染色体时，部分染色体的重叠会导致染色体的轮廓无法区分，甚至没有办法计数。这就决定了白菜型冬油菜的染色体核型分析对于染色体的分散程度的要求更高，并且对制片技术要求也更高，全组的染色体平均长度是0.40μm。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种白菜型冬油菜染色体制片方法，包括以下步骤：
(1)取材：待冬油菜根尖将长至1～1.5cm时，每间隔2h取一次根尖并固定，取材时间为8：00～10：00；
(2)预处理；低温进行预处理；
(3)固定；
(4)解离；采用酸解法或酶解法；
(5)染色和镜检。
优选的：步骤(2)低温进行预处理：处理温度为4℃，用冰水混合物对材料进行预处理，时间12～48h。
进一步的，最优时间为20h。
优选的：步骤(3)固定：采用卡诺氏固定液Ⅰ，4℃固定材料，固定时间为12h；卡诺氏固定液Ⅰ的成分体积比为无水乙醇：冰醋酸＝3：1。
优选的：步骤(4)酸解法包括：60℃，用1mol/L HCl解离，时间10～15min；酶解法：25℃，用1％果胶酶和2％纤维素酶混合溶液解离，时间1h。
优选的：步骤(5)具体为根尖解离后，用蒸馏水冲洗两次，切取根尖分生区部分置于载玻片上，使用卡宝品红染液染色10～15min，常规压片后在100×油镜下镜检。
本发明还提供了一种基于上述任一的制片方法在核型分析中的应用。
优选的：还包括：核型公式为K(2n)＝20＝16m+4sm；染色体相对长度组成为2L+6M2+12M1，其中L、M2和M1分别代表长染色体、中长染色体和中短染色体。
进一步的，K(2n)：核型；m：中着丝点染色体；sm：近中着丝点染色体。
有益效果在于：定量和定型地描述了白菜型冬油菜的染色体数目、大小、着丝粒位置等形态特征，从而为确定种属亲缘关系，分析生物物种的变异和进化过程提供理论依据和技术基础。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种白菜型冬油菜染色体制片方法及其应用，取得的技术效果为制片需要获得较多的分裂相，这就要保证植物的细胞处于旺盛的有丝分裂时期，故取材时间就会显得尤为关键。植物分生组织生长具有一定的周期性，但同一植物取材最佳时间并不具有较好的稳定性，并且在最佳的取材时间所获得分裂中期染色体的比例也有较大的波动。通过对白菜型冬油菜的根尖进行不同时间的取材，发现一天之中8：00～10：00之间细胞分裂最旺盛，细胞分裂的程度会关系到最后染色体的制片效果，而中期细胞越多则越有利于进行染色体的核型分析。
预处理在染色体制片技术中是至关重要的一步，它不但能使材料获得比较多的中期分裂相，并且也会影响染色体分散程度以及清晰程度，故直接关系染色体制片效果。不同预处理溶液的作用有所不同，本发明对冰水混合物预处理时间进行优化，得到白菜型冬油菜的最佳预处理时间为4℃条件20小时。
本发明使用的卡诺氏固定液是无水乙醇与冰醋酸以3：1比例制成的混合液，对比了固定时间对染色体制片效果的影响，若时间过短，则会造成染色体的图像模糊以及结构不完整。对于白菜型冬油菜根尖细胞，卡诺氏液固定时间为12h能获得良好的染色体图像，可能与染色体的大小有关。
解离也是影响染色体的制片效果的一个重要因素，解离的目的在于分解和软化细胞壁，从而使细胞之间容易分离，同时能清除部分细胞质，使得细胞质的背景透明化，便于进行染色体观察。在白菜型冬油菜染色体的制片操作中，酸解法和酶解法都能够获得比较良好的制片效果。采用1mol/L HCL处理10～15min，或25℃用1％果胶酶和2％纤维素酶混合溶液解离1h解离效果好，而且试验发现解离时间过短，会导致压片时细胞不够分散，细胞的染色体和细胞质的着色对比度过低，不易观察；而解离时间过长，则染色较为困难。
结果表明采用以下技术方案为最优：预处理：4℃冰水混合物处理20h，染色体分散且形态清晰，固定：卡诺氏固定液处理12h染色体的结构明显，解离：1mol/L HCl处理10～15min染色体的分散程度相对良好且后续染色效果好，25℃用1％果胶酶和2％纤维素酶混合溶液解离1h同样可以良好解离；使用卡宝品红染液染色15min并在100×油镜下进行观察，可获得效果比较好的中期分裂相。
此外，核型分析试验得到的核型参数能够用于研究植物的生长和发育、比较不同种类植物之间的亲缘关系及解释植物的进化过程，其是了解和研究植物的重要的基础数据。本发明研究表明白菜型冬油菜染色体的数目为2n＝20条，核型类型为2A型，核型公式为K(2n)＝20＝16m+4sm。核型不对称系数是一个用于衡量生物进化程度的指标，一般来说越接近50％，对称程度越高，则说明其进化程度越原始(STEBBINS 1971；LEVITSKY 1931)。本发明中白菜型冬油菜不对称系数达到58.85％，较接近50％，推测白菜型冬油菜是一种比较原始的植物，为较对称类型染色体。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明提供的优化的压片操作过程示意图。
图2附图为本发明提供的不同预处理时间处理后的白菜型冬油菜染色体图，其中，A-12h，B-16h，C-20h，D-24h，E-48h。
图3附图为本发明提供的不同固定时间处理后的白菜型冬油菜染色体图，其中，A-12h，B-24h。
图4附图为本发明提供的酸解法解离时间对染色体的影响图。
图5附图为本发明提供的酶解法解离时间对染色体的影响图。
图6附图为本发明提供的白菜型冬油菜染色体形态图及核型图。
图7附图为本发明提供的白菜型冬油菜染色体核型模式图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种白菜型冬油菜染色体制片方法及其应用。
实施例1
材料：参试油菜品种为“陇油7号”，属于超强抗寒冬油菜品种(耐-32℃，越冬率90％以上)，由甘肃农业大学作物遗传育种教研室提供。将健康饱满的白菜型冬油菜种子用10％次氯酸钠消毒20min，无菌水冲洗4～6次后放入培养皿中发芽，发芽温度25℃，黑暗培养，直至根尖长至1～1.5cm时，进行制片技术的优化和核型分析试验。试验在甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室进行。
方法：
操作流程由图1所示；以白菜型冬油菜根尖为材料，从取材时间、预处理、固定以及解离4个步骤进行优化设计。
取材时间的优化
待冬油菜根尖将长至1～1.5cm时，每间隔2h取一次根尖并固定，一天的取材时间为8：00～18：00，共取材5次以确定最佳取材时间。
预处理的时间的优化
本试验采用物理方法低温进行预处理，处理温度为4℃，用冰水混合物对材料进行预处理。冰水混合物4℃分别设置梯度12h、16h、20h、24h、48h，每处理5组重复，以确定最优的预处理条件时间。
固定时间的优化
采用卡诺氏固定液Ⅰ(V无水乙醇：V冰醋酸＝3：1)低温(4℃左右)用以固定材料，在4℃条件下，分别固定12h和24h两种梯度，每处理5组重复，获得优化的固定条件。
解离阶段的优化
解离则对比两种方法：①酸解法：60℃，用1mol/L HCl解离，解离时间分别设置5min、10min、15min；②酶解法：25℃，用1％果胶酶和2％纤维素酶混合溶液解离，解离分别设置0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h；每处理5组重复，以确定最优的解离方法和时间。
染色和镜检
根尖解离后，用蒸馏水冲洗两次，切取根尖分生区部分置于载玻片上，使用卡宝品红染液染色10～15min，常规压片后镜检：使用Leica显微镜观察，选择30个染色体分散并且形态比较好的细胞对染色体数目统计，若85％以上的染色体数目相同时，就能够确定染色体的数目(李懋学和陈瑞阳1985)；其次选取5个分裂相比较良好且染色体的形态清晰的细胞再用Leica相机直接拍照。
结果表明：
最佳取材时间确定
表1不同取材时间对白菜型冬油菜中期细胞的影响
不同时间的取材所制作的染色体制片的观察结果见表1，可知白菜型冬油菜种子根尖最佳的取材时间是一天之中的8：00～10：00，此时间段的白菜型冬油菜种子的根尖生长较旺盛，中期的分裂相比较多，便于取材和制片。
不同预处理时间对染色体的影响
预处理主要目在于通过阻断、抑制以及破坏纺锤丝的形成使得细胞分裂阻滞在中期，从而获得更多中期分裂相的细胞，同时预处理还能够改变细胞质的黏度，促进染色体分散及收缩，便于压片和观察。不同预处理时间对白菜型冬油菜染色体制片效果有明显的影响。用4℃的冰水混合物处理12h，染色体的固缩程度很明显不足，并且拖尾现象也严重，同时染色体聚集为一团，分散性比较差(图2A)；预处理16h，染色体的分散程度稍微有所改善，但仍然不理想，着丝粒不够明显(图2B)；而4℃冰水混合物处理24h和48h，发现部分染色体收缩过度呈现点状，并且有聚集现象，已经不适用于核型分析(图2D和图2E)。预处理20h染色体的收缩性最好，形态也最佳，是最优的预处理方法(图2C)。因此4℃低温下20h为最佳预处理时间。
固定时间对染色体制片效果的影响
固定的目的是用渗透力强的固定液将材料迅速杀死，使蛋白质沉淀，并尽量使其保持原有状态。卡诺氏液处理的时间对制片有较大影响。固定时间不够会导致染色体在制片过程中被破坏，得不到完整的染色体形状。
使用卡诺氏固定液Ⅰ(V无水乙醇：V冰醋酸＝3：1)固定12h效果最好，结构完整并且形数清晰(图3A)；而固定24h导致染色体结构不清晰，不利于观察(图3B)。
不同解离方式和时间对染色体制片效果的影响
植物的细胞存在细胞壁，胞间层含有果胶，这会导致压出的片子难以达到理想的效果。只有经过解离，细胞之间存在的果胶层被除去，且细胞壁得到软化，才能使压片顺利进行。
酸解法使用1mol/L HCl在60℃条件水浴解离几分钟到十几分钟或更长。而采用纤维素酶(1％～5％)和果胶酶(1％～3％)的混合液除去细胞壁时，酶的浓度、质量、pH以及酶解的时间、温度都会对酶解效果产生不同的影响，而酶解时间在室温下一般为2～5h。
实施例酸解和酶解两种方法都能获得较好的染色体的中期分裂图像，通过前期对比试验得出：使用酸解法时，1mol/L HCL处理10～15min效果最佳(图4)。使用酶解法时(部分结果见图5)，酶解处理0.5h时发现有大量细胞壁存在，并且大量的细胞堆积，不够分散(图5A)；酶解处理1h时发现细胞壁的酶解程度适宜，细胞壁被酶解掉了，并且细胞质分散，染色体分散相对良好，计数比较方便(图5B)；酶解1.5h时，发现细胞出现破裂，且染色体发生了缺失，酶解过度(图5C)。酶解时间为1h，酶解温度为25℃为最佳。虽然酶解和酸解两种方法都能获得数目清晰的染色体图像，但酸解法更简便、效果更好。
实施例2
油菜染色体的数目
选取30个染色体的数目清晰的中期细胞进行染色体计数，而核型分析采用李懋学等提出的标准进行，以确定着丝粒的位置，根据染色体大小和形态特征对染色体核型进行配对及分析(李懋学和陈瑞阳1985)；染色体的相对长度、臂比和类型按LEVAN等命名法则进行计算(LEVAN 1964)，着丝粒指数及染色体相对长度系数还是以李懋学等的标准进行计算(李懋学和陈瑞阳1985)，核型不对称系数使用ARANO方法进行计算(ARANO 1965)，核型类型则按照STEBBINS的标准划分(STEBBINS 1971)。
根据标准，试验所统计的细胞数目应为30个以上。若85％以上的细胞具由恒定且一致的染色体数目，则可以认为是该植物的染色体数目。实施例选择40个分散相对良好的中期的染色体细胞进行观察，发现有36个细胞的染色体数目为20条(图6)，占计数细胞的90％。故确定白菜型冬油菜体细胞染色体数目为2n＝20条。
核型分析
选择5个染色体分散良好、清晰的中期分裂相进行核型分析。白菜型冬油菜为二倍体，其核型公式为K(2n)＝20＝16m+4sm，为中部和近中部着丝粒染色体，无随体(表2，图7)。白菜型冬油菜染色体相对长度变化范围为3.94～6.61；染色体相对长度系数变化范围为0.79～1.32，其染色体相对长度组成为2L+6M2+12M1，其中L、M2和M1分别代表长染色体(large chromosomes)、中长染色体(middle chromosomes 2)和中短染色体(middlechromosomes 1)；臂比值变化范围为1.05～2.11；核型不对称系数为58.85％，核型类型属于2A型。
表2白菜型冬油菜染色体的核型分析数据
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (7)
1.一种白菜型冬油菜染色体制片方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取材：待冬油菜根尖将长至1～1.5cm时，每间隔2h取一次根尖并固定，取材时间为8：00～10：00；
(2)预处理；低温进行预处理；
(3)固定；
(4)解离；采用酸解法或酶解法；
(5)染色和镜检。
2.根据权利要求1所述的一种白菜型冬油菜染色体制片方法，其特征在于，步骤(2)所述低温进行预处理：处理温度为4℃，用冰水混合物对材料进行预处理，时间12～48h。
3.根据权利要求2所述的一种白菜型冬油菜染色体制片方法，其特征在于，步骤(3)所述固定：采用卡诺氏固定液Ⅰ，4℃固定材料，固定时间为12h；所述卡诺氏固定液Ⅰ的成分体积比为无水乙醇：冰醋酸＝3：1。
4.根据权利要求3所述的一种白菜型冬油菜染色体制片方法，其特征在于，步骤(4)所述酸解法包括：60℃，用1mol/L HCl解离，时间10～15min；所述酶解法：25℃，用1％果胶酶和2％纤维素酶混合溶液解离，时间1h。
5.根据权利要求3所述的一种白菜型冬油菜染色体制片方法，其特征在于，步骤(5)具体为根尖解离后，用蒸馏水冲洗两次，切取根尖分生区部分置于载玻片上，使用卡宝品红染液染色10～15min，常规压片后在100×油镜下镜检。
6.一种基于权利要求1～5任一所述的制片方法在核型分析中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，还包括：核型公式为K(2n)＝20＝16m+4sm；染色体相对长度组成为2L+6M2+12M1，其中L、M2和M1分别代表长染色体、中长染色体和中短染色体。
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