CN115287261A - 一种原代神经干细胞体外三维培养系统及其培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种原代神经干细胞体外三维培养系统及其培养方法，包括细胞培养皿，所述细胞培养皿内部的底部设置有凹槽，卫星培养小室板由多个卫星培养小室组合形成，卫星培养小室的底部向外凸出形成圆弧形结构，以构成三维培养室，三维培养室放置于所述凹槽内，多个卫星培养小室呈阵列排布，同排的卫星培养小室之间可拆卸链接，同列的卫星培养小室之间固定连接，所述卫星培养小室用于培养原代神经干细胞，所述细胞培养皿用于构成细胞培养的密闭环境。本发明的原代神经干细胞体外三维培养系统结合培养方法，除了可以进行三维仿真培养以外，还能够使细胞贴附更为牢靠，培养出原代细胞符合原代神经干细胞的特性，且具有非常好的增殖能力。

Description

一种原代神经干细胞体外三维培养系统及其培养方法
技术领域
本发明涉及原代神经干细胞培养技术领域，特别涉及一种原代神经干细胞体外三维培养系统及其培养方法。
背景技术
针对原代神经干细胞的体外培养，由于原代神经干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，因此，可以采用悬浮神经球培养的方法来获得和进行研究。传统的培养方法是：将胚胎脑组织处理成单个细胞后，只有具有自我更新能力的细胞才能在培养液中克隆增殖成为悬浮的神经球，并随着传代的进行，保持增殖能力和向多种神经子代细胞分化的能力。实验材料一般选用胚胎E12.5 d C57BL/6J小鼠，试剂和试剂盒一般包括多聚甲醛、蒸馏水、PBS、血清培养基、多聚赖氨酸、胎牛血清、双蒸水(二次蒸馏水)等，涉及的仪器和耗材包括体式显微镜、眼科剪、显微镊、fire-polished巴氏吸管、24孔培养板、制冰机等，具体步骤包括：
S1、获得特定脑组织；
S2、获取单细胞悬液(常采用胰酶消化+胰酶抑制剂终止法获取)；
S3、用原代神经干细胞培养液重悬，fire-polished巴氏吸管吹吸成单细胞悬液，细胞计数，接种，密度一般为5×105cells/mL；
S4、培养2d可以1/2量换液，培养7-10d进行传代；
S5、收集神经球入离心管，800r/min离心3min；弃上清，加入适量体积的Accutase消化组织，37℃孵育5min，之后用fire-polished巴氏吸管吹吸成细胞悬液，重复上述步骤3次；收集细胞入离心管中，800r/min离心3min，弃上清；
S6、加入新的原代神经干细胞增殖培养液重悬，用fire-polished巴氏吸管吹吸成单细胞悬液，细胞计数，接种；
S7、培养得到的神经球可以接种于多聚赖氨酸包被的皿底或玻片上，加入原代神经干细胞分化培养液，诱导其向子代细胞分化分化。
由于原代神经干细胞悬浮培养的方法实际上是回顾性的判断细胞的身份，即只有能够持续传代增殖并向多种方向分化的细胞才是真正的原代神经干细胞，因此，结果的判读就要结合多种方法综合判断。
在原代神经干细胞培养过程中，原代神经干细胞在普通培养皿上培养贴壁较难，且形态不佳。如：在I型明胶包被的细胞培养皿中培养，易受明胶成分NGF刺激分化多种神经细胞；而0.1mg/mL多聚赖氨酸包被原代神经干细胞较难贴壁且对原代神经干细胞的损伤较大。普通培养皿上只能进行二维培养，与体内的真实环境相差较大。
发明内容
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种原代神经干细胞体外三维培养系统及其培养方法，以解决现有体外培养方法所存在的不足。
本发明采用的技术方案如下：一种原代神经干细胞体外三维培养系统，包括细胞培养皿，所述细胞培养皿内部的底部设置有凹槽，所述凹槽与卫星培养小室板的底部配合，所述卫星培养小室板由多个卫星培养小室组合形成，所述卫星培养小室的底部向外凸出形成圆弧形结构，以构成三维培养室，所述三维培养室放置于所述凹槽内，所述多个卫星培养小室呈阵列排布，同排的卫星培养小室之间可拆卸链接，同列的卫星培养小室之间固定连接，所述卫星培养小室用于培养原代神经干细胞，所述细胞培养皿用于构成细胞培养的密闭环境。
进一步，同排的卫星培养小室之间通过铰合扣实现可拆卸链接。
进一步，同列的卫星培养小室之间通过固定支架实现固定连接。
进一步，本发明还包括一种原代神经干细胞体外三维培养方法，采用上述培养系统进行原代神经干细胞体外三维培养，培养方法包括以下步骤：
S1、获得特定脑组织，将脑组织剪碎并倒入试管中，然后加入Accutase酶消化，反复用塑料吸管吹打混合，并重复多次；
S2、将步骤S1的试管置于离心机中进行离心处理，弃去上清液，加入原代神经干细胞增殖培养液，取新试管，用过滤器将含原代神经干细胞的生长培养液过滤至新试管中，经细胞计数板计数后，用原代神经干细胞增殖培养液调整细胞密度为5×105cells/mL，然后接种于细胞培养瓶中进行培养，12h以后细胞培养瓶中有悬浮的神经球形成，得到神经球；
S3、用多聚鸟氨酸包被卫星培养小室，恒温包被12h后，用灭菌的双蒸水吸取多余的多聚鸟氨酸，然后用层粘连蛋白包被卫星培养小室，恒温包被4h后，向卫星培养小室中加入一定浓度的PBS，备用；
S4、取步骤S2得到的神经球，离心去上清液，用PBS清洗沉淀，然后用Accutase酶消化，反复用塑料吸管吹打混合，重复此操作后，以5×103cells/mL的细胞密度在包被有多聚鸟氨酸和层粘连蛋白的卫星小室板上铺板，培养12h后，加入适量的生长培养液或原代神经干细胞分化培养液，每隔2d更换一次。
进一步，所述原代神经干细胞增殖培养液的配方为：96mL DF12细胞培养基，96mLNeurobasal培养基，4mL B27，2mL N2、200μL bFGF，200μL bEGF，2mL青霉素-链霉素双抗。
进一步，在步骤S3中，多聚鸟氨酸的浓度为15μg/mL，层粘连蛋白的浓度为20μg/mL。
进一步，所述原代神经干细胞分化培养液的配方为：低糖DMEM培养基，2％B27，1％FBS。
进一步，在步骤S3中，PBS的加入量为0.01M。
进一步，所述获得特定脑组织的方法包括以下步骤：
A、启动超净台，向培养皿中加入DF12试剂，然后置于冰盆中冷却，待用；
B、处死孕鼠，取出子宫浸泡入培养皿中，从组织中分离出胎鼠，将胎鼠头身用眼科剪分离，用尖头镊子取出胎鼠脑组织，在光学显微镜下剥离脑组织上的血管膜与血管，即得到特定脑组织。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明主要通过适当浓度的多聚鸟氨酸联合层黏连蛋白包被特制的卫星培养小室，细胞相容性较好，对细胞增殖和分化无损伤，无毒性，特别有利于原代神经干细胞的三维仿真培养；
2、本发明的卫星培养卫星小室板由卫星培养小室排列组合构成，同列之间的卫星培养小室可满足重复性实验的要求，以规避单个卫星培养小室培养出来的神经球所存在的试验误差，同排之间的卫星培养小室可拆卸链接，可满足操作者不同时间段、不同目的的要求，例如用于三维培养、染色或者单独处理，达到了按需取量的效果，节约了昂贵的细胞培养耗材和细胞培养成本，同时其还能够满足同批次下进行多种不同试验的需求，有利于操作者获得更为准确地试验结果；
3、本发明的原代神经干细胞体外三维培养系统结合培养方法，除了可以进行三维仿真培养以外，还能够使细胞贴附更为牢靠，进而进一步提高了三维仿真培养的效果，培养出原代细胞符合原代神经干细胞的特性，且具有非常好的增殖能力。
附图说明
图1是本发明的一种卫星培养小室结构示意图；
图2是本发明的一种卫星培养小室板结构示意图；
图3是本发明的一种原代神经干细胞体外三维培养系统；
图4是本发明实施例1的原代神经干细胞样品化学检测图；
图5是本发明的培养方法和普通培养方法得到的神经球检测图；
图6是发明的培养方法和普通培养方法原代神经干细胞分化培养3天的情况。
图中：1为卫星培养小室，101为三维培养室，2为固定支架，3为包被层，4为铰合扣，5为神经球，6为培养液。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明作详细的说明。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
如图1所示，本发明的卫星培养小室板，包括具有培养皿结构的卫星培养小室1，卫星培养小室1的底部为向外凸出的圆弧形结构，形成三维培养室101，相比于平底结构的培养皿，具有圆弧形结构的卫星小室能够保证培养液6中的神经球5悬浮生长，进而能够实现三维仿真培养，而平底结构的细胞培养皿会使得神经球粘附于底部而形成二维培养，并且容易使干细胞直接分化而影响细胞培养效果，难以实现三维仿真培养。
进一步地，三维培养室101不限于圆弧形结构，其还可以为多边形结构(例如梯形结构)或锥形结构。
进一步地，如图2所示(图2中，未画出卫星培养小室1的三维培养室101)，卫星小室1呈矩阵排列形成卫星培养小室板，卫星培养小室1同列之间通过固定支架2固定连接，卫星培养小室1同排之间通过铰合扣4实现可拆卸连接。这样设置的目的在于，同列之间的卫星培养小室1可满足重复性实验的要求，以规避单个卫星培养小室1培养出来的神经球所存在的试验误差，同排之间的卫星培养小室1可拆卸链接，可满足操作者不同时间段、不同目的的要求，达到了按需取量的效果，节约了昂贵的细胞培养耗材，节省了细胞培养成本，同时能够满足同批次下进行多种不同试验的需求，有利于操作者获得更为准确地试验结果。进一步，多聚鸟氨酸联合层粘连蛋白包被后，在卫星培养小室1的三维培养室内形成包被层3，将多个包被有多聚鸟氨酸和层粘连蛋白的卫星培养小室1组装形成卫星培养小室板，然后将卫星培养小室板放置于细胞培养皿中，细胞培养皿的底部设置有与卫星培养小室1底部相匹配的凹槽，以固定住卫星培养小室1，然后将培养得到的原代神经干细胞种在卫星培养小室1中，在细胞培养皿的内部密闭环境中进行三维仿真培养。由此，卫星培养小室板与细胞培养皿构成原代神经干细胞体外三维培养系统，如图3所示。
实施例1
小鼠原代神经干细胞培养
S1、实验准备：启动超净台，点燃酒精灯待用；取手术器械、培养皿、DF12试剂、冰盆、孕鼠，向培养皿中加入DF12试剂，然后置入冰盆中冷却；
S2、取材：处死孕鼠，取出子宫浸泡入培养皿中，从组织中分离出胎鼠，将胎鼠头身用眼科剪分离，用尖头镊子取出胎鼠脑组织，在光学显微镜下剥离脑组织上的血管膜与血管；
S3、消化：在超净台上，将胎鼠脑组织剪碎，倒入试管中，加入Accutase酶消化，反复用塑料吸管小心的吹打混合，静置5min，该操作重复5-6次；
S4、离心：将试管置于离心机中进行离心处理，离心转速120rpm，离心处理时间为5-7min；
S5、种细胞：离心处理后，弃去上清液，加入原代神经干细胞增殖培养液(原代神经干细胞增殖培养液配制：96mL DF12细胞培养基，96mL Neurobasal培养基，4mL 50×(浓度倍数)B27，2mL 100×N2，200μL bFGF(浓度为20μg/mL)，200μL bEGF(浓度为20μg/mL)，2mL100×青霉素-链霉素双抗)；取新试管，用过滤器将含原代神经干细胞的生长培养液过滤至新试管中，经细胞计数板计数后，用原代神经干细胞增殖培养液调整细胞密度为5×105cells/mL，然后接种于细胞培养瓶中，在37℃、5％CO2条件下培养，过夜后细胞培养瓶中有悬浮的神经球形成；
S6、制作包被有多聚鸟氨酸和层粘连蛋白的卫星培养小室1：先用浓度为15μg/mL的多聚鸟氨酸包被卫星培养小室1，在37℃恒温培养箱中静置过夜后，回收多聚鸟氨酸，用灭菌的ddH2O(双蒸水)洗去多余的多聚鸟氨酸后，接着用浓度为20μg/mL的层粘连蛋白包被卫星培养小室1，在37℃恒温培养箱中静置2h后，回收层粘连蛋白，最后在卫星培养小室1中加入0.01M的PBS并放置于干燥处，备用；
S7、取步骤S5得到的神经球，低速离心后去上清，用PBS清洗沉淀，然后用Accutase酶消化，反复用塑料吸管小心的吹打混合，静置5min，该操作重复5-6次；然后以5×103cells/mL的细胞密度在包被有多聚鸟氨酸和层粘连蛋白的卫星小室板上铺板，培养过夜，次日加入1mL的生长培养液，每隔2d更换一次，最后得到样品。
实施例2
实施例2与实施例1相同，其不同之处在于，还包括原代神经干细胞分化培养的步骤，如下：
S1、实验准备：启动超净台，点燃酒精灯待用；取手术器械、培养皿、DF12试剂、冰盆、孕鼠，向培养皿中加入DF12试剂，然后置入冰盆中冷却；
S2、取材：处死孕鼠，取出子宫浸泡入培养皿中，从组织中分离出胎鼠，将胎鼠头身用眼科剪分离，用尖头镊子取出胎鼠脑组织，在光学显微镜下剥离脑组织上的血管膜与血管；
S3、消化：在超净台上，将胎鼠脑组织剪碎，倒入试管中，加入Accutase酶消化，反复用塑料吸管小心的吹打混合，静置5min，该操作重复5-6次；
S4、离心：将试管置于离心机中进行离心处理，离心转速120rpm，离心处理时间为5-7min；
S5、种细胞：离心处理后，弃去上清液，加入原代神经干细胞增殖培养液(原代神经干细胞增殖培养液配制：96mL DF12细胞培养基，96mL Neurobasal培养基，4mL 50×B27，2mL 100×N2，200μL bFGF(浓度为20μg/mL)，200μL bEGF(浓度为20μg/mL)，2mL 100×青霉素-链霉素双抗)；取新试管，用过滤器将含原代神经干细胞的生长培养液过滤至新试管中，经细胞计数板计数后，用神经干细胞增殖培养液调整细胞密度为5×105cells/mL，然后接种于细胞培养瓶中，在37℃、5％CO2条件下培养，过夜后细胞培养瓶中有悬浮的神经球形成。
S6、制作包被有多聚鸟氨酸和层粘连蛋白的卫星培养小室：先用浓度为15μg/mL的多聚鸟氨酸包被卫星培养小室，在37℃恒温培养箱中静置过夜后，回收多聚鸟氨酸，用灭菌的ddH2O洗去多余的多聚鸟氨酸后，接着用浓度为20μg/mL的层粘连蛋白包被卫星培养小室，在37℃恒温培养箱中静置2h后，回收层粘连蛋白，最后在卫星培养小室中加入0.01M的PBS并放置于干燥处，备用；
S7、取步骤S5得到的神经球，低速离心后去上清，用PBS清洗沉淀，然后用Accutase酶消化，反复用塑料吸管小心的吹打混合，静置5min，该操作重复5-6次；然后以5×103cells/mL的细胞密度在包被有多聚鸟氨酸和层粘连蛋白的卫星培养小室板上铺板，培养过夜，次日更换1mL的原代神经干细胞分化培养液(低糖DMEM+2％B27+1％FBS)，每隔2d更换一次，得到样品。
对比例1
对比例1与实施例1相同，其不同之处在于，将卫星培养小室板替换为普通的具有平底结构的12孔细胞培养板。
对比例2
对比例2与实施例1相同，其不同之处在于，多聚鸟氨酸的浓度为20μg/mL。
试验测试
1、免疫细胞化学测试的详细步骤如下：
S1、固定：(1)取实施例1(试验组)得到的原代神经干细胞样品，去除培养液，用冷PBS清洗两遍；(2)小室板每孔加入1mL含4％多聚甲醛的PBS(pH＝7.4)，室温固定20分钟；(3)吸去多聚甲醛，用冷PBS冲洗样品2次；
S2、通透：(1)将样品在含0.25％Triton X-100的PBS中孵育20分钟；(2)取出样品，用冷PBS冲洗细胞3次，每次5分钟；
S3、封闭及孵育：(1)步骤S2处理得到的原代神经干细胞样品在含1％BSA的PBST中孵育30分钟，以阻断抗体的非特异性结合；(2)实验组细胞与抗体(含1％BSA的PBST稀释)在湿盒中共同孵育，室温2小时，或4℃过夜；阴性对照组细胞(来源于同批次原代培养神经干细胞但是不与抗体孵育)与1％BSA的PBST在湿盒中共同孵育，室温2小时，或4℃过夜(3)弃去液体，用冷PBS冲洗细胞3次，每次5分钟；
S4、孵育二抗：(1)将原代神经干细胞样品与荧光二抗在1％BSA中孵育，室温1小时，避光；(2)弃去二抗溶液，冷PBS冲洗细胞3次，每次5分钟，避光；
S5、复染：(1)0.1-1μg/ml Hoechst或DAPI(DNA染色剂)孵育细胞10分钟；(2)冷PBS冲洗细胞3次，每次5分钟，避光；
S6、封固：(1)向盖玻片上滴加一滴封固液封固；(2)用指甲油密封盖玻片防止变干并移至显微镜下观察；(3)-20℃或4℃避光保存。
试验结果：如图4所示，包被后卫星小室培养出的原代细胞符合原代神经干细胞的特性，基本全部表达原代神经干细胞标志物Nestin+、CD133+。
由图5可得，包被后卫星小室培养组神经球的直径显著大于普通方法培养组。
实施例1和对比例1-2按照上述检测方法进行检测，其检测结果如表1所示：
表1实施例1-2和对比例1-3样品检测结果
Figure BDA0003797937680000101
Figure BDA0003797937680000111
由表1可得，具有非常好的增殖能力，包被后卫星小室培养组神经球Nestin+Brdu+双标细胞比例显著高于对比例1-2。
由图6可得包被后卫星小室培养出的原代神经干细胞进行分化培养3天，其分化产生的MAP2+的神经元细胞及GFAP+的星型胶质细胞明显多于普通方法培养的原代神经干细胞分化培养得到的子代细胞，而且包被后卫星小室培养出的原代神经干细胞进行分化得到的子代神经细胞，形态更为饱满、细胞更为成熟。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种原代神经干细胞体外三维培养系统，包括细胞培养皿，其特征在于，包括细胞培养皿，所述细胞培养皿内部的底部设置有凹槽，所述凹槽与卫星培养小室板的底部配合，所述卫星培养小室板由多个卫星培养小室组合形成，所述卫星培养小室的底部向外凸出形成圆弧形结构，以构成三维培养室，所述三维培养室放置于所述凹槽内，所述多个卫星培养小室呈阵列排布，同排的卫星培养小室之间可拆卸链接，同列的卫星培养小室之间固定连接，所述卫星培养小室用于培养原代神经干细胞，所述细胞培养皿用于构成细胞培养的密闭环境。
2.如权利要求1所述的原代神经干细胞体外三维培养系统，其特征在于，同排的卫星培养小室之间通过铰合扣实现可拆卸链接。
3.如权利要求2所述的原代神经干细胞体外三维培养系统，其特征在于，同列的卫星培养小室之间通过固定支架实现固定连接。
4.一种原代神经干细胞体外三维培养方法，其特征在于，采用上述权利要求1-3任一所述的培养系统进行原代神经干细胞体外三维培养，培养方法包括以下步骤：
S1、获得特定脑组织，将脑组织剪碎并倒入试管中，然后加入Accutase酶消化，反复用塑料吸管吹打混合，并重复多次；
S2、将步骤S1的试管置于离心机中进行离心处理，弃去上清液，加入原代神经干细胞增殖培养液，取新试管，用过滤器将含原代神经干细胞的生长培养液过滤至新试管中，经细胞计数板计数后，用原代神经干细胞增殖培养液调整细胞密度为5×105cells/mL，然后接种于细胞培养瓶中进行培养，12h以后细胞培养瓶中有悬浮的神经球形成，得到神经球；
S3、用多聚鸟氨酸包被卫星培养小室，恒温包被12h后，用灭菌的双蒸水吸取多余的多聚鸟氨酸，然后用层粘连蛋白包被卫星培养小室，恒温包被4h后，向卫星培养小室中加入一定浓度的PBS，备用；
S4、取步骤S2得到的神经球，离心去上清液，用PBS清洗沉淀，然后用Accutase酶消化，反复用塑料吸管吹打混合，重复此操作后，以5×103cells/mL的细胞密度在包被有多聚鸟氨酸和层粘连蛋白的卫星小室板上铺板，培养12h后，加入适量的生长培养液或原代神经干细胞分化培养液，每隔2d更换一次。
5.如权利要求4所述的原代神经干细胞体外三维培养方法，其特征在于，所述原代神经干细胞增殖培养液的配方为：96mL DF12细胞培养基，96mL Neurobasal培养基，4mL B27，2mL N2、200μL bFGF，200μL bEGF，2mL青霉素-链霉素双抗。
6.如权利要求5所述的原代神经干细胞体外三维培养方法，其特征在于，在步骤S3中，多聚鸟氨酸的浓度为15μg/mL，层粘连蛋白的浓度为20μg/mL。
7.如权利要求4所述的原代神经干细胞体外三维培养方法，其特征在于，所述原代神经干细胞分化培养液的配方为：低糖DMEM培养基，2％B27，1％FBS。
8.如权利要求4所述的原代神经干细胞体外三维培养方法，其特征在于，在步骤S3中，PBS的加入量为0.01M。
9.如权利要求4所述的原代神经干细胞体外三维培养方法，其特征在于，所述获得特定脑组织的方法包括以下步骤：
A、启动超净台，向培养皿中加入DF12试剂，然后置于冰盆中冷却，待用；
B、处死孕鼠，取出子宫浸泡入培养皿中，从组织中分离出胎鼠，将胎鼠头身用眼科剪分离，用尖头镊子取出胎鼠脑组织，在体式显微镜下剥离脑组织上的血管膜与血管，即得到特定脑组织。
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