CN115286633A - 一类具有抗肿瘤活性的靶向蛋白嵌合体的合成及其作为抗肿瘤药物的应用 - Google Patents

一类具有抗肿瘤活性的靶向蛋白嵌合体的合成及其作为抗肿瘤药物的应用 Download PDF

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CN115286633A CN202210807848.XA CN202210807848A CN115286633A CN 115286633 A CN115286633 A CN 115286633A CN 202210807848 A CN202210807848 A CN 202210807848A CN 115286633 A CN115286633 A CN 115286633A
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Abstract

本发明公开一类具有抗肿瘤活性的靶向蛋白嵌合体，所述嵌合体的结构通式如下：
Figure DDA0003738974110000011
其中X为Linker，分别为二甘醇，三甘醇或四甘醇，R为O，
Figure DDA0003738974110000012
Figure DDA0003738974110000013
本发明合成了一类全新结构的具有抗肿瘤作用的靶向蛋白嵌合体衍生物，通过核磁氢谱、碳谱和质谱数据分析表明合成得到的靶向蛋白嵌合体为新化合物，且经体外抗肿瘤活性研究证明，本发明提供的靶向蛋白嵌合体对多种肿瘤细胞，包括人白血病细胞K562和人肝癌细胞HepG2具有很强的抗肿瘤活性，是一种优良的抗肿瘤新化合物，可望开发成新的抗肿瘤药物。

Description

一类具有抗肿瘤活性的靶向蛋白嵌合体的合成及其作为抗肿 瘤药物的应用
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，尤其是一类具有抗肿瘤活性的靶向蛋白嵌合体(PROTACs)的合成及其作为抗肿瘤药物的应用。
背景技术
近年来，无论是全球癌症的发病率持续提高，已严重威胁人类生命健康。据统计，2020年全球新发癌症病例1929万例，其中男性1006万例，女性923万例；2020年全球癌症死亡病例996万例，男性553万例，女性443万例。伴随着众多抗肿瘤药物与制剂的开发，大量涌现的抗肿瘤药物分子表现出了显著改善的治疗效果与安全性。但是现有的抗肿瘤药物仍然存在了一些问题，例如药物的活性不高，导致药物达到有效治疗剂量的过大引起一些其他的副反应；而且现有的抗肿瘤药物及易产生耐药性。
蛋白水解靶向嵌合体(技术是一种新兴的药物研发策略。PROTAC是由三部分组成的异源双功能化合物。分别是用于特异性结合靶蛋白的“弹头”、招募E3泛素连接酶的E3泛素连接酶配体(E3 ligand)和连接两者的连接链(linker)。PROTAC靶向降解靶蛋白的作用机制是通过嵌合体分子将靶蛋白与E3泛素连接酶“拉近”到适当距离，使得本不被特异性泛素化的蛋白得到泛素化标记，最终通过蛋白酶体系统降解蛋白，使其丧失生物学活性。与传统抑制剂只能抑制某些多功能蛋白的单一信号通路相比，PROTAC分子可以诱导靶蛋白降解从而影响该蛋白的所有功能，从而减少反馈机制，在某种程度上可以克服耐药以及减小耐药的发生几率。
E3泛素连接酶配体，本发明选择了泊马度胺，其具有活性高、分子质量小、廉价易得的特点。linker本发明选择了甘醇链，其具有较高生物相容性，也能提高化合物的水溶性。“弹头”本发明选择了化合物1.化合物1是一类核苷酸类似物，据报道，其具有广泛的抗肿瘤活性。但是在研究中，其抗肿瘤活性较低，且其水溶性较差，难以直接应用于肿瘤治疗，并且其可能极易产生耐药性。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一类具有抗肿瘤活性的靶向蛋白嵌合体(PROTACs)的合成及其作为抗肿瘤药物的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一类具有抗肿瘤活性的靶向蛋白嵌合体，所述嵌合体的结构通式如下：
Figure BDA0003738974090000021
其中X为Linker，分别为二甘醇，三甘醇或四甘醇，R为O，
Figure BDA0003738974090000022
进一步地，所述嵌合体的结构式具体如下：
Figure BDA0003738974090000023
其中，n＝1，2，3。
如上所述的一类具有抗肿瘤活性的靶向蛋白嵌合体的制备方法，合成路线如下：
Figure BDA0003738974090000031
其中，n＝1，2，3。
如上所述的一类具有抗肿瘤活性的靶向蛋白嵌合体在制备抗肿瘤药物方面中的应用。
进一步地，所述抗肿瘤药物为治疗人白血病细胞K562和人肝癌细胞HepG2的药物。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明合成了一类全新结构的具有抗肿瘤作用的靶向蛋白嵌合体，通过波谱和质谱数据分析表明合成得到的靶向蛋白嵌合体为新化合物，且经体外抗肿瘤活性研究证明，本发明提供的靶向蛋白嵌合体对多种肿瘤细胞，包括人白血病细胞K562和人肝癌细胞HepG2具有很强的抗肿瘤活性，是一种优良的抗肿瘤新化合物，可望开发成新的抗肿瘤药物。
2、本发明运用生物电子等排替换、派生官能团及官能团的修饰等方法对小分子药物运用PROTACs研究，对所得衍生物进行药理活性测试，结果表明这些化合物具有显著的抗肿瘤作用，并且，是一类全新结构的具有抗肿瘤作用的化合物，进而可以发明作为抗肿瘤药物。
3、本发明的一类全新结构的具有抗肿瘤作用的靶向蛋白嵌合体，与原先的小分子药物相比即化合物1，能明显看到其抗肿瘤活性提高，并且其毒副作用小，用药剂量也可以降低。
附图说明
图1为本发明中化合物2在氘代CHCl3中的核磁氢谱图；
图2为本发明中化合物2在氘代CHCl3中的核磁碳谱图；
图3为本发明中化合物4在氘代CHCl3中的核磁氢谱图；
图4为本发明中化合物4在氘代CHCl3中的核磁碳谱图；
图5为本发明中化合物A在氘代CHCl3中的核磁氢谱图；
图6为本发明中化合物A在氘代CHCl3中的核磁碳谱图；
图7为本发明中化合物7在氘代CHCl3中的核磁氢谱图；
图8为本发明中化合物7在氘代CHCl3中的核磁碳谱图；
图9为本发明中化合物B在氘代CHCl3中的核磁氢谱图；
图10为本发明中化合物B在氘代CHCl3中的核磁碳谱图；
图11为本发明中化合物10在氘代CHCl3中的核磁氢谱图；
图12为本发明中化合物10在氘代CHCl3中的核磁碳谱图；
图13为本发明中化合物C在氘代CHCl3中的核磁氢谱图；
图14为本发明中化合物C在氘代CHCl3中的核磁碳谱图；
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。
一类具有抗肿瘤活性的靶向蛋白嵌合体，所述嵌合体的结构通式如下：
Figure BDA0003738974090000041
其中X为Linker，分别为二甘醇，三甘醇或四甘醇，R为O，
Figure BDA0003738974090000042
较优地，所述嵌合体的结构式具体如下：
Figure BDA0003738974090000051
其中，n＝1，2，3。
如上所述的一类具有抗肿瘤活性的靶向蛋白嵌合体的制备方法，合成路线如下：
Figure BDA0003738974090000052
其中，n＝1，2，3。
如上所述的一类具有抗肿瘤活性的靶向蛋白嵌合体在制备抗肿瘤药物方面中的应用。
较优地，所述抗肿瘤药物为治疗人白血病细胞K562和人肝癌细胞HepG2的药物。
具体地，相关制备及检测如下：
一类具有抗肿瘤活性的靶向蛋白嵌合体，其结构式通式如下:
Figure BDA0003738974090000061
较优地，所述X为Linker，分别为二甘醇，三甘醇或四甘醇，R为O，
Figure BDA0003738974090000062
Figure BDA0003738974090000063
较优地，所述的一类靶向蛋白嵌合体，其结构如下：
Figure BDA0003738974090000064
如上述，一种基于靶向蛋白嵌合体技术开发肿瘤细胞抑制剂A的制备方法，合成路线如下：
Figure BDA0003738974090000071
中间体2的形成：
将中间体1(330mg,611.48μmol,1.0eq)溶解于5ml DCM中，再依次加入甲磺酰氯(MsCl)(0.071ml,105.06mg,917.22μmol,1.5eq)，三乙胺(TEA)(0.169ml,123.75mg,1.22mmol,2.0eq),室温反应10min,溶液从黄色变为红色。TLC检测反应完毕后用10ml×3二氯甲烷与20ml水萃取，合并有机相用氯化钠饱和水溶液洗涤反应体系，无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏浓缩体系。300～400目硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝100：1)得到260mg中间体2，产率为67.73％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.40(s,1H),7.17(t,J＝9.5Hz,1H),7.03(d,J＝6.0Hz,2H),6.63(s,1H),4.81–4.66(m,5H),3.84(s,1H),3.59(t,J＝7.2Hz,2H),2.95(d,J＝10.6Hz,2H),2.74(d,J＝14.2Hz,2H),2.69(d,J＝6.9Hz,2H),2.19(q,J＝8.3,6.6Hz,2H),2.04–1.95(m,3H),1.91–1.87(m,3H),1.71(t,J＝12.8Hz,6H),1.33(s,1H),1.28(d,J＝14.9Hz,3H),1.17(d,J＝12.7Hz,2H),1.11–0.98(m,2H),0.89-0.86(m,1H).检测结果如图1所示。
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ158.99,154.20,151.86,137.19,135.52,123.29,117.02,116.85,116.56,116.39,113.71,60.28,55.36,54.32,45.11,43.34,41.43,41.08,40.85,32.48,29.27,29.19,24.15.检测结果如图2所示。
中间体4的形成：
将中间体2(260mg,420.87μmol,1.0eq)溶解于5ml DMF中，再依次加入二甘醇(0.226ml,267.98mg,2.53mmol,6.0eq)，NaOH(101.00mg,2.53mmol,6.0eq),在搅拌器搅拌5min后转移至110℃油浴锅中反应3h。TLC检测反应完毕后用10ml×3乙酸乙酯与20ml水萃取，合并有机相用氯化钠饱和水溶液洗涤反应体系，无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏浓缩体系。300～400目硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝20：1)得到240mg中间体4，产率为90.83％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.46(s,1H),7.20(dd,J＝11.2,7.7Hz,1H),7.06(t,J＝6.6Hz,2H),6.73(s,1H),6.13(s,2H),4.81–4.66(m,5H),3.89(d,J＝5.2Hz,2H),3.74(t,J＝4.5Hz,2H),3.64(s,4H),3.59(t,J＝4.5Hz,2H),3.42(d,J＝11.6Hz,2H),2.93(t,J＝5.0Hz,2H),2.71(t,J＝12.6Hz,2H),2.41(t,J＝12.2Hz,2H),2.20(dt,J＝14.4,7.2Hz,2H),2.04(s,1H),2.02–1.85(m,4H),1.73(dd,J＝26.6,14.2Hz,8H),1.40–1.24(m,2H),1.12(qd,J＝12.4,4.4Hz,3H).检测结果如图3所示。
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ175.84,162.85,159.02,153.79,151.33,151.20,137.41,134.74,123.38,116.53,111.86,72.63,70.19,70.09,66.09,61.33,56.20,55.62,53.49,53.34,44.75,43.10,40.48,38.94,36.55,32.34,31.61,31.46,28.89,26.42,23.99,21.80.检测结果如图4所示。
中间体5的形成：
将中间体4(240mg,382.30μmol,1.0eq)溶解于5ml DCM中，再依次加入三苯基磷(200.55mg,764.60μmol,2.0eq),四溴化碳(253.56mg,64.60μmol,2.0eq),在搅拌器搅拌4h,减压蒸馏浓缩体系。300～400目硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝50：1)得到200mg粗品中间体5，产率为75.74％。
前药体A的形成：
将中间体5(200mg,289.57μmol,1.0eq)溶解于5ml DMF中，再依次加入泊马度胺(118.69mg，434.36μmol,1.5eq),碳酸钾(80.04mg,579.14μmol,2.0eq),在搅拌器搅拌5min后转移至100℃油浴锅中反应3h。TLC检测反应完毕后用10ml×3乙酸乙酯与20ml水萃取，合并有机相用氯化钠饱和水溶液洗涤反应体系，无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏浓缩体系。300～400目硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝20：1)得到84mg前药体A，产率为32.85％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.50(s,1H),7.44–7.36(m,1H),7.27(s,1H),7.25–7.16(m,1H),7.13(d,J＝7.1Hz,1H),7.07(q,J＝4.4Hz,2H),6.87(d,J＝8.3Hz,1H),6.09(s,1H),5.38(s,2H),5.30(s,1H),5.00–4.91(m,1H),4.80–4.67(m,5H),4.03(tq,J＝13.3,6.3,5.6Hz,2H),3.92(s,2H),3.60(d,J＝11.1Hz,5H),3.48(s,2H),2.96(s,1H),2.88(s,1H),2.81–2.77(m,2H),2.73–2.67(m,2H),2.26–2.19(m,3H),2.09(ddt,J＝8.2,5.8,3.0Hz,1H),1.98–1.90(m,3H),1.77–1.75(m,1H),1.67(d,J＝13.8Hz,2H),1.35(d,J＝15.3Hz,1H),1.29(s,1H),1.26(s,4H),1.11(dd,J＝20.6,8.4Hz,3H),0.87(dt,J＝11.2,7.1Hz,2H).检测结果如图5所示。
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ171.06,169.12,168.91,167.67,158.83,154.09,145.82,136.94,135.61,132.29,123.39,121.63,117.14,116.98,116.62,116.45,113.03,110.66,70.46,69.80,67.70,55.45,53.96,53.44,49.75,44.86,39.43,36.49,32.49,32.06,31.51,31.44,29.70,29.01,24.14,22.01.检测结果如图6所示。
HRMS(+ESI-TOF)m/z.(M+Na)+Calcd.For C46H56F2N10O6,919.4037；Found919.4040.
如上述，一种基于靶向蛋白嵌合体技术开发肿瘤细胞抑制剂B的制备方法，合成路线如下：
Figure BDA0003738974090000091
中间体7的形成：
将中间体2(260mg,420.87μmol,1.0eq)溶解于5ml DMF中，再依次加入三甘醇(0.337ml,379.23mg,2.53mmol,6.0eq)，NaOH(101.00mg,2.53mmol,6.0eq),在搅拌器搅拌5min后转移至110℃油浴锅中反应3h。TLC检测反应完毕后用10ml×3乙酸乙酯与20ml水萃取，合并有机相用氯化钠饱和水溶液洗涤反应体系，无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏浓缩体系。300～400目硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝20：1)得到243mg中间体7，产率为85.94％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.49(s,1H),7.23–7.18(m,1H),7.08–7.04(m,2H),4.78–4.68(m,5H),3.89(t,J＝4.8Hz,2H),3.72(t,J＝4.5Hz,2H),3.64(s,6H),3.60(t,J＝4.6Hz,2H),3.48(d,J＝11.8Hz,2H),3.02(t,J＝4.9Hz,2H),2.95(s,1H),2.88(s,1H),2.72(t,J＝12.6Hz,2H),2.53(td,J＝12.2,3.2Hz,2H),2.20(q,J＝6.6,5.2Hz,2H),2.05(s,1H),2.01–1.87(m,4H),1.87–1.66(m,8H),1.44–1.32(m,1H),1.27(d,J＝12.2Hz,1H),1.15(ddd,J＝16.3,10.1,3.9Hz,3H).检测结果如图7所示。
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ176.54,162.58,158.94,153.92,151.51,137.34,135.04,123.35,116.49,112.66,72.67,70.41,70.27,70.09,70.06,66.83,61.22,56.64,55.45,53.52,44.83,43.15,40.76,39.66,36.43,34.54,32.34,31.34,29.00,27.34,24.01,22.50.检测结果如图8所示。
中间体8的形成：
将中间体7(240mg,357.23μmol,1.0eq)溶解于5ml DCM中，再依次加入三苯基磷(187.40mg,714.46μmol,2.0eq),四溴化碳(236.93mg,714.46μmol,2.0eq),在搅拌器搅拌4h,减压蒸馏浓缩体系。300～400目硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝50：1)得到186mg粗品中间体8,产率为70.87％。
前药体B的形成：
将中间体8(200mg,272.21μmol,1.0eq)溶解于5ml DMF中，再依次加入泊马度胺(111.57mg，408.31μmol,1.5eq),碳酸钾(75.24mg,544.42μmol,2.0eq),在搅拌器搅拌5min后转移至100℃油浴锅中反应3h。TLC检测反应完毕后用10ml×3乙酸乙酯与20ml水萃取，合并有机相用氯化钠饱和水溶液洗涤反应体系，无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏浓缩体系。300～400目硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝20：1)得到78mg前药体B，产率为30.91％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.48(s,1H),7.40(dd,J＝8.4,7.1Hz,1H),7.27(s,1H),7.23–7.17(m,1H),7.13(d,J＝7.1Hz,1H),7.09–7.05(m,2H),6.91(d,J＝8.4Hz,1H),6.27(s,1H),5.44(s,2H),4.98–4.88(m,1H),4.74(dt,J＝12.6,8.3Hz,5H),4.10–3.98(m,2H),3.86(d,J＝5.2Hz,2H),3.62(t,J＝7.5Hz,10H),3.40(s,2H),2.95(d,J＝7.3Hz,2H),2.80–2.67(m,4H),2.23–2.18(m,2H),2.11–2.03(m,2H),1.99–1.91(m,4H),1.79–1.69(m,6H),1.38(d,J＝10.6Hz,2H),1.28(d,J＝1.5Hz,2H),1.15–1.08(m,2H),0.89–0.84(m,1H).检测结果如图9所示。
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ171.01,169.10,168.87,167.66,158.90,154.10,145.88,135.52,132.32,130.47,130.34,121.59,117.09,116.92,116.62,116.45,113.54,112.95,110.65,70.49,70.38,70.31,70.12,67.55,55.46,53.99,49.72,44.92,43.46,40.79,39.37,32.48,32.02,29.68,29.64,29.06,24.14,22.07.检测结果如图10所示。
HRMS(+ESI-TOF)m/z.(M+H)+Calcd.For C48H60F2N10O7,927.4687；Found 927.4682.
如上述，一种基于靶向蛋白嵌合体技术开发肿瘤细胞抑制剂C的制备方法，合成路线如下：
Figure BDA0003738974090000101
中间体10的形成：
将中间体2(260mg,420.87μmol,1.0eq)溶解于5ml DMF中，再依次加入四甘醇(0.436ml,490.47mg,2.53mmol,6.0eq)，NaOH(101.00mg,2.53mmol,6.0eq),在搅拌器搅拌5min后转移至100℃油浴锅中反应3h。TLC检测反应完毕后用10ml×3乙酸乙酯与20ml水萃取，合并有机相用氯化钠饱和水溶液洗涤反应体系，无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏浓缩体系。300～400目硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝20：1)得到231mg中间体10，产率为76.67％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.48(s,1H),7.23–7.18(m,1H),7.08–7.04(m,2H),4.79–4.68(m,5H),3.79(t,J＝5.4Hz,2H),3.72(t,J＝4.6Hz,2H),3.68–3.61(m,10H),3.60(d,J＝4.8Hz,2H),3.33(d,J＝11.5Hz,2H),2.95(s,1H),2.88(d,J＝8.8Hz,3H),2.72(t,J＝12.5Hz,2H),2.42–2.31(m,2H),2.25–2.14(m,2H),2.03(s,2H),1.99–1.86(m,4H),1.81–1.67(m,6H),1.65–1.52(m,2H),1.41–1.30(m,1H),1.30–1.23(m,1H),1.14(dd,J＝12.3,4.1Hz,2H).检测结果如图11所示。
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ176.46,162.55,158.94,154.02,148.92,137.27,135.21,123.32,116.53,113.04,72.66,70.51,70.48,70.41,70.34,70.23,70.21,67.25,61.37,56.86,55.43,53.80,53.48,44.91,43.24,40.91,39.81,36.45,34.74,32.40,29.63,29.05,27.66,24.07,22.47.检测结果如图12所示。
中间体11的形成：
将中间体10(200mg,279.37μmol,1.0eq)溶解于5ml DCM中，再依次加入三苯基磷(146.55mg,558.75μmol,2.0eq),四溴化碳(185.30mg,558.75μmol,2.0eq),在搅拌器搅拌4h,减压蒸馏浓缩体系。300～400目硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝50：1)得到164mg粗品中间体11,产率为75.38％。
前药体C的形成：
将中间体11(200mg,256.81μmol,1.0eq)溶解于5ml DMF中，再依次加入泊马度胺(105.26mg,385.22μmol,1.5eq),碳酸钾(70.98mg,513.26μmol,2.0eq),在搅拌器搅拌5min后转移至100℃油浴锅中反应3h。TLC检测反应完毕后用10ml×3乙酸乙酯与20ml水萃取，合并有机相用氯化钠饱和水溶液洗涤反应体系，无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏浓缩体系。300～400目硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝20：1)得到85mg前药体C，产率为34.08％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.40(s,1H),7.36–7.30(m,1H),7.14(dd,J＝11.8,8.2Hz,1H),7.05(d,J＝7.1Hz,1H),7.03–6.97(m,2H),6.87(d,J＝8.3Hz,1H),6.45(s,1H),5.51(s,2H),5.25(s,1H),4.95–4.86(m,1H),4.76–4.57(m,5H),4.06–3.91(m,2H),3.79(t,J＝5.0Hz,2H),3.57(d,J＝3.5Hz,8H),3.55(d,J＝2.8Hz,4H),3.32(d,J＝11.9Hz,2H),2.93–2.84(m,3H),2.75–2.61(m,4H),2.42(t,J＝12.2Hz,2H),2.19–2.09(m,2H),2.04–1.98(m,1H),1.94–1.80(m,4H),1.77–1.60(m,8H),1.36–1.28(m,1H),1.21(s,2H),1.10(dd,J＝12.1,7.9Hz,2H).检测结果如图13所示。
13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ171.09,169.06,168.95,167.67,158.86,154.10,146.00,137.13,135.55,135.45,132.24,123.33,121.61,116.55,113.56,112.77,110.41,70.50,70.47,70.45,70.31,70.27,70.01,67.44,66.83,57.05,55.39,54.04,53.50,49.64,44.91,43.34,40.81,39.61,39.27,32.45,31.97,29.66,29.04,27.45,24.11,22.04.检测结果如图14所示。
HRMS(+ESI-TOF)m/z.(M+H)+Calcd.For C50H64F2N10O8,985.4742；Found 985.4743.
本发明靶向蛋白嵌合体的抗肿瘤活性测定：
溶液的配制：
PRMI1640培养液的配制：购买Gibco B.R.L PRMI1640培养基，每瓶500mL，加入10％的胎牛血清和1％的青链霉素溶液，即每瓶培养基加入50mL的胎牛血清和5mL的青链霉素，培养基的配置在超净工作台中进行，后放置冰箱4℃保存。
PBS缓冲液的配制：在1000mL锥形瓶中，称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，十二水合磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钾0.2g，加入800mL纯净水充分搅拌溶解后定容至1000mL，高压灭菌后放置冰箱4℃保存。
MTT溶液的配制：称取MTT干粉0.5g，溶于100mLPBS缓冲液中，用0.22μM滤膜过滤除菌后，放置冰箱-12℃保存。
抗肿瘤活性测定的具体步骤：
本发明抗肿瘤活性测定所用肿瘤细胞：人白血病细胞K562和人肝癌细胞HepG2。
利用人白血病细胞K562和人肝癌细胞HepG2活性测试：
K562和HepG2细胞使用的培养液为含1％的青霉素-链霉素溶液，10％的胎牛血清的PRMI1640细胞培养液，培养条件为37℃、含5％CO2的恒温培养箱。具体步骤：
(1)用血球计数板对细胞进行计数后，用RPMI培养液将其稀释至5x104个/mL；
(2)在96孔板的每个孔里加入100μL细胞悬液，在37℃培养箱中培养K562细胞2h，HepG2细胞24h。
(3)将所需测试化合物溶于二甲基亚砜，0.01，0.1，1，10,100μM，按照浓度依次加药0.5μL/孔，培养箱37℃温育48h；
(4)加入浓度为5mg/mL的MTT，培养箱37℃温育4小时；
(5)K562细胞加入盐酸异丙醇，HepG2细胞加入DMSO溶解细胞。用酶标仪测定K562细胞580和630nm，HepG2细胞492和630nm的OD值；
(6)处理数据，根据OD值计算IC50值。
表1为抗肿瘤活性测试结果
Figure BDA0003738974090000121
Figure BDA0003738974090000131
注:人白血病细胞K562、人肝癌细胞HepG2
化疗药物喜树碱(CPT)为阳性对照药物。
实验结果显示，相对于原药化合物1来说，化合物A、B、C均有提升，在抑制K562细胞增殖活性中，化合物C提升最大。在抑制HepG2细胞增殖活性中，化合物A提升最大，提升了13.3倍。因此，化合物A、B、C均有可能成为治疗肿瘤的药物。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (5)

1.一类具有抗肿瘤活性的靶向蛋白嵌合体，其特征在于：所述嵌合体的结构通式如下：
Figure FDA0003738974080000011
其中X为Linker，分别为二甘醇，三甘醇或四甘醇，R为O，
Figure FDA0003738974080000012
2.根据权利要求书1所述的一类具有抗肿瘤活性的靶向蛋白嵌合体，其特征在于：所述嵌合体的结构式具体如下：
Figure FDA0003738974080000013
其中，n＝1，2，3。
3.如权利要求书1或2所述的一类具有抗肿瘤活性的靶向蛋白嵌合体的制备方法，其特征在于：合成路线如下：
Figure FDA0003738974080000021
其中，n＝1，2，3。
4.如权利要求书1或2所述的一类具有抗肿瘤活性的靶向蛋白嵌合体在制备抗肿瘤药物方面中的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述抗肿瘤药物为治疗人白血病细胞K562和人肝癌细胞HepG2的药物。
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