CN115282156A - 知母皂苷元在制备防治帕金森病的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了知母皂苷元在制备防治帕金森病的药物中的应用。本发明发现知母皂苷元可保护皮层神经元，减轻MPP+诱导的皮层神经元突起损伤，知母皂苷元对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤也具有保护和修复作用。另本发明通过建立小鼠帕金森病模型也发现，知母皂苷元可改善MPP+诱导的帕金森行为。因此，可将知母皂苷元用于制备治疗或辅助治疗帕金森病的药物。本发明不仅扩宽了知母皂苷元的应用范围，同时丰富了帕金森病治疗药物的来源，有助于帕金森病药物的开发和治疗。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及知母皂苷元在制备防治帕金森病的药物中的应用。
背景技术
帕金森病(Parkinson's disease，PD)是以中脑黑质致密部和纹状体多巴胺能神经元进行性丢失、变性和死亡为主要病理特征的一种神经系统退行性疾病，是仅次于阿尔茨海默症的第二大神经退行性疾病。帕金森病的典型临床表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓、姿态不稳等，因此又称“震颤麻痹”。帕金森病不仅在行动上给患者造成不便，有的患者还可有精神和智能障碍，给社会和家庭带来沉重的负担。因此，寻找能有效防治帕金森病的药物，对缓解帕金森病患者的痛苦具有意义。
帕金森病的临床治疗主要有化学药物治疗和外科手术治疗两种。但化学药物，例如复方左旋多巴制剂，其在治疗帕金森病时是以进一步伤害多巴胺能神经元的功能状态为代价，虽其短期疗效，如在控制症状方面的效果较好，但其只能暂时减轻或缓解症状，而不能阻止帕金森病的进程，且长期使用会出现多种并发症。外科治疗帕金森病主要采用苍白球和丘脑的射频毁损术，但此治疗方法的复发率较高、并发症多，已较少采用。天然的药物成分具有毒副作用等优点，开发挖掘天可用于防治帕金森病的天然药物成分，对帕金森病的治疗具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有用于治疗帕金森病病的化学药物只能暂时减轻或缓解帕金森病症状，不能阻止帕金森病的进程且长期使用毒副作用大的缺陷和不足，提供一种可用于防治帕金森病的天然药物成分，提供知母皂苷元在制备防治帕金森病的药物中的应用。
本发明的第一个目的是提供知母皂苷元在制备防治帕金森病的药物中的应用。
本发明的第二个目的是提供知母皂苷元在制备辅助治疗帕金森病的药物中的应用。
本发明的第三个目的是提供知母皂苷元在制备改善帕金森行为的药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供知母皂苷元在制备保护皮层神经元的药物中的应用。
本发明的第五个目的是提供知母皂苷元在制备修复多巴胺能神经元损伤的药物中的应用。
本发明的第六个目的是提供知母皂苷元在制备保护多巴胺能神经元的药物中的应用。
本发明的第七个目的是提供一种用于防治或辅助治疗帕金森的药物。
本发明的第八个目的是提供一种用于改善帕金森行为的药物。
本发明的第九个目的是提供一种用于修复或保护皮层神经元或多巴胺能神经元的药物。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明发现，知母皂苷元可保护皮层神经元，减轻1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methy-4-phenylpyridinium，MPP+)诱导的皮层神经元突起损伤，同时，知母皂苷元对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤也具有保护作用，还可修复MPP+诱导的多巴胺能神经元突起密度损伤。另本发明通过建立小鼠帕金森病模型也发现，知母皂苷元可改善MPP+诱导的帕金森行为。因此，本发明申请保护以下应用：
本发明申请保护知母皂苷元在制备防治帕金森病的药物中的应用。
本发明还是申请保护知母皂苷元在制备辅助治疗帕金森病的药物中的应用。
本发明还是申请保护知母皂苷元在制备改善帕金森行为的药物中的应用。
本发明还是申请保护知母皂苷元在制备保护皮层神经元的药物中的应用。
本发明还是申请保护知母皂苷元在制备修复多巴胺能神经元损伤的药物中的应用。
本发明还是申请保护知母皂苷元在制备保护多巴胺能神经元的药物中的应用。
具体地，所述知母皂苷元的结构式如式(I)所示：
本发明还请求保护一种用于防治或辅助治疗帕金森的药物，所述药物中含有式(I)所示知母皂苷元。
本发明还申请保护一种用于改善帕金森行为的药物，所述药物中含有式(I)所示知母皂苷元。
本发明还申请保护一种用于修复或保护皮层神经元或多巴胺能神经元的药物，所述药物中含有式(I)所示知母皂苷元。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了知母皂苷元在制备防治帕金森病的药物中的应用。本发明发现知母皂苷元可保护皮层神经元，减轻MPP+诱导的皮层神经元突起损伤，知母皂苷元对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤也具有保护和修复作用。另本发明通过建立小鼠帕金森病模型也发现，知母皂苷元可改善MPP+诱导的帕金森行为。因此，可将知母皂苷元用于制备治疗或辅助治疗帕金森病的药物。本发明不仅扩宽了知母皂苷元的应用范围，同时丰富了帕金森病治疗药物的来源，有助于帕金森病药物的开发和治疗。
附图说明
图1为知母皂苷元减轻MPP+诱导的小鼠原代皮层神经元损伤的结果图；其中，图A为MPP+处理后皮层神经元的存活率；图B为知母皂苷元处理MPP+诱导损伤的原代皮层神经突起密度(图B左柱状图)和神经元数量(图B右柱状图)的统计结果；图C为知母皂苷元处理MPP+诱导损伤的原代皮层神经元的荧光照片；图中**表示差异显著，p＜0.01；***表示差异极显著，p＜0.001。
图2为多巴胺能神经元的纯度鉴定结果；其中，图A为多巴胺能神经元纯度鉴定实验的实验设计图，图B为多巴胺能神经元纯度鉴定的荧光照片；图C为多巴胺能神经元纯度鉴定的数据统计结果。
图3为MPP+多巴胺能神经元损伤模型的建立结果；其中，图A为MPP+处理后MAP2阳性神经元的数量统计结果；图B为MPP+处理后多巴胺能神经元突起长度统计结果；图C为MPP+处理后MAP2阳性神经元和多巴胺能神经元的荧光照片；图中**表示差异显著，p＜0.01；***表示差异极显著，p＜0.001。
图4为知母皂苷元对MPP+诱导多巴胺能神经元损伤的修复作用；其中，图A为知母皂苷元对MPP+诱导多巴胺能神经元修复实验的实验设计图；图B为MPP+处理后多巴胺能神经元数量(图4B左柱状图)和突起长度(图4B右柱状图)统计结果；图C为MPP+处理后多巴胺能神经元的荧光照片；图中*表示差异显著，p＜0.05；**表示差异显著，p＜0.01；***表示差异极显著，p＜0.001。
图5为知母皂苷元对MPP+诱导多巴胺能神经元损伤的保护作用；其中，图A为知母皂苷元对MPP+诱导多巴胺能神经元保护实验的实验设计图；图B为MPP+处理后多巴胺能神经元的数量(图B左柱状图)和突起长度(图B右柱状图)统计结果；图C为MPP+处理后多巴胺能神经元的荧光照片；图中*表示差异显著，p＜0.05；**表示差异显著，p＜0.01；***表示差异极显著，p＜0.001。
图6为知母皂苷元对MPTP诱导小鼠体重的影响结果。
图7为知母皂苷元对MPTP诱导小鼠行为影响的统计结果；图中*表示差异显著，p＜0.05；**表示差异极显著，p＜0.01。
图8为知母皂苷元对MPTP诱导小鼠纹状体神经递质的影响；图中*表示差异显著，p＜0.05；**表示差异显著，p＜0.01；***表示差异极显著，p＜0.001。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明实施例所用知母皂苷元为成都德思特生物技术有限公司产品(货号：DST170222-010)，所述知母皂苷元的结构式如式(I)所示：
实施例1知母皂苷元对皮层神经元的保护作用
1、小鼠原代大脑皮层神经元的分离和培养：
取ICR E14天的胎鼠，在HS培养基(含12％马血清，0.6％葡萄糖，2mM谷氨酰胺的Neurobasal培养基)中分离大脑皮层，除去硬脑膜，将组织切碎，100g离心3分钟，弃去上清，用0.05％胰蛋白酶-EDTA在37℃培养箱中消化15分钟，每5分钟振荡一次，加入HS培养基终止消化，100g离心3分钟，弃去上清，然后加入600U/mL DNase I和0.3mg/mL胰蛋白酶抑制剂(Gibco)处理15分钟，每5分钟振荡一次，结束后加入HS培养基，100g离心3分钟，弃去上清，沉淀用1×HBSS吹打清洗2次，吹打过程以不产生气泡为准，收集沉淀并悬浮于HS培养基，将细胞吹打均匀；细胞计数后将其接种到8-孔板中(15000细胞/孔)，在10％CO2、37℃培养箱中培养。
2、MPP+皮层神经元损伤模型：
将分离得到的皮层神经元培养4天后，分别加入30、40、50μM的1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methy-4-phenylpyridinium，MPP+)和ddH2O(空白对照)继续培养2天，建立MPP+皮层神经元损伤模型，用CCK8法测定皮层神经元的存活率，结果如图1A所示。由图1A所示结果可知，MPP+对皮层神经元的损伤具有浓度依赖性，30μM MPP+就对皮层神经元具有显著的损伤作用，且明显降低神经突起密度，后续用30μM MPP+诱导皮层神经元损伤。
3、知母皂苷元对皮层神经元的保护作用
将利用上述方法分离得到的皮层神经元培养3天后，用30μM MPP+诱导皮层神经元损伤，同时分别加入1、10μM知母皂苷元和0.1％DMSO(作空白对照)，培养4天后，用4％的PFA(Solarbio，P1110)固定1h，加入一次抗体β3-Tubulin(Santa Cruz，sc-80005)，4℃过夜孵育后加入二次抗体GAM594和DAPI，常温孵育2h后，封片，荧光显微镜下观察并拍摄照片，统计神经元突起的密度和神经元数量，观察知母皂苷元能否保护皮层神经元，减轻MPP+诱导损伤。结果如图1B和1C所示，其中，图1B为知母皂苷元处理MPP+诱导损伤的皮层神经突起密度(图1B左柱状图)和神经元数量(图1B右柱状图)的统计结果；图1C为知母皂苷元处理MPP+诱导损伤的原代皮层神经元的荧光照片；图中**表示差异显著，p＜0.01；***表示差异极显著，p＜0.001。由图1B和1C可知，荧光显微镜下所选拍照区域的神经元在MPP+的作用下显著减少(图1C)，但1和10μM的知母皂苷元均能保护皮层神经元，减轻MPP+对皮层神经元突起的损伤，提高神经元突起的密度(图1B左柱状图)，对神经元数量无显著影响(图1B右柱状图)，荧光照片也体现了这一结果，表明使用知母皂苷元可保护皮层神经元，使皮层神经元突起损伤减少，即知母皂苷元对皮层神经元具有保护作用，能减轻MPP+对皮层神经元突起的损伤。
实施例2知母皂苷元对多巴胺能神经元的修复和保护作用
1、小鼠中脑黑质区多巴胺能神经元的分离和培养：
小鼠中脑黑质区多巴胺能神经元的分离和培养同实施例1，区别在于取ICR E14天的胎鼠，在HS培养基中分离中脑区域。
2、多巴胺能神经元纯度鉴定
将分离得到的小鼠中脑黑质区多巴胺能神经元培养6天后，用4％的PFA固定1h，加入一次抗体TH(酪氨酸羟化酶)和MAP2()，4℃条件下过夜孵育后加入二次抗体GAM594、GAR488和DAPI，常温孵育2h后，封片，荧光显微镜下观察并拍摄照片。多巴胺能神经元的纯度鉴定结果如图2所示，其中，图2A为多巴胺能神经元纯度鉴定实验的实验设计图，图2B为多巴胺能神经元纯度鉴定的荧光照片；图2C为多巴胺能神经元纯度鉴定的数据统计结果。由图2可知，TH阳性多巴胺能神经元占MAP2阳性总神经元的比例为4.6％，可用于后续实验。
3、MPP+多巴胺能神经元损伤模型的建立
将分离得到的多巴胺能神经元培养4天后，分别加入2、5、10、50μM的MPP+和ddH2O(空白对照)继续培养2天，用4％的PFA固定1h，加入一次抗体TH和MAP2，4℃过夜孵育后加入二次抗体GAM594、GAR488和DAPI，常温孵育2h后，封片，荧光显微镜下观察并拍摄照片。MPP+多巴胺能神经元损伤模型的建立结果如图3所示，其中，图3A为MPP+处理后MAP2阳性神经元的数量统计结果；图3B为MPP+处理后多巴胺能神经元突起长度统计结果；图3C为MPP+处理后MAP2阳性神经元和多巴胺能神经元的荧光照片。由图3可知，10～50μM MPP+对MAP2阳性神经元有显著的损伤作用，而2μM MPP+对TH阳性多巴胺能神经元突起有极显著的损伤作用。
4、知母皂苷元对MPP+诱导多巴胺能神经元损伤的修复作用
多巴胺能神经元培养4天后，分别加入MPP+(1μM)和ddH2O(空白对照)继续培养2天，移去MPP+，加入含不同浓度知母皂苷元(0.01～1000μM)的培养基继续培养2天；用4％的PFA固定1h后加入一次抗体TH和MAP2，4℃过夜孵育后，加入二次抗体GAM594、GAR488和DAPI，常温孵育2h后，封片，荧光显微镜下观察并拍摄照片。知母皂苷元对MPP+诱导多巴胺能神经元损伤的修复作用结果如图4所示，其中，图4A为知母皂苷元对MPP+诱导多巴胺能神经元修复实验的实验设计图；图4B为MPP+处理后多巴胺能神经元数量(图4B左柱状图)和突起长度(图4B右柱状图)统计结果；图4C为MPP+处理后多巴胺能神经元的荧光照片。由图4可知，1μM的MPP+即能显著减少TH阳性多巴胺能神经元数量，而知母皂苷元未显示出明显的对TH阳性多巴胺能神经元数量的保护作用。但与空白组相比，1μM的MPP+也显著降低TH阳性突起密度，而10～1000nM的知母皂苷元能显著提高TH阳性多巴胺能神经元突起密度，表明知母皂苷元能修复MPP+诱导的TH阳性多巴胺能神经元突起损伤，促进TH阳性多巴胺能神经元突起再生，提高TH阳性多巴胺能神经元突起密度。
5、知母皂苷元对MPP+诱导多巴胺能神经元损伤的保护作用
多巴胺能神经元培养4天后，分别用含不同浓度的知母皂苷元(0.01～1000nM)的培养基培养2天，然后加入MPP+(1μM)和ddH2O(空白对照)继续培养2天；用4％的PFA固定1h后加入一次抗体TH和MAP2，4℃过夜孵育后加入二次抗体GAM594、GAR488和DAPI，常温孵育2h，封片，荧光显微镜下观察并拍摄照片。知母皂苷元对MPP+诱导多巴胺能神经元损伤的保护作用如图5所示；其中，图5A为知母皂苷元对MPP+诱导多巴胺能神经元保护实验的实验设计图；图5B为MPP+处理后多巴胺能神经元的数量(图5B左柱状图)和突起长度(图5B右柱状图)统计结果；图5C为MPP+处理后多巴胺能神经元的荧光照片。由图5可知，MPP+(1μM)会显著减少TH阳性多巴胺能神经元数量，而用0.01～1000nM的知母皂苷元处理后，再添加MPP+，TH阳性多巴胺能神经元数量较空白对照组数量显著升高。另与空白组相比，MPP+(1μM)显著降低TH阳性突起密度，而0.01～1000nM的知母皂苷元显著提高TH阳性多巴胺能神经元突起密度。上述结果表明，知母皂苷元能保护TH阳性多巴胺能神经元，减轻MPP+诱导的TH阳性多巴胺能神经元数量和突起损伤，促进TH阳性多巴胺能神经元突起再生，提高TH阳性多巴胺能神经元突起密度。
实施例3知母皂苷元对MPTP+诱导的小鼠帕金森行为的改善作用
C57小鼠购买自北京华阜康生物科技股份有限公司，共分为空白组(Cont，n＝8)、模型组(Veh，n＝15)、阳性对照组(Mad美多巴，n＝11)、知母皂苷元低剂量组(Sar-L，n＝9)和知母皂苷元高剂量组(Sar-H，n＝9)。C57小鼠(7周龄，雄性)连续5天腹腔注射给与MPTP(30mg/kg/day)用于构建帕金森小鼠模型，同时分别口服给与低(10mg/kg/day)和高(20mg/kg/day)浓度的知母皂苷元(溶解于生理盐水中)和阳性对照药物美多巴(50mg/kg/day)，统计小鼠体重变化，23天后进行自发性运动测试，第24天进行转棒行为实验，第25天进行爬杆行为实验，实验设计如图6所示。
自发性运动测试：自发性运动测试是评估动物在新环境中的自主探索行为与紧张活跃度，通过总路程、穿越格子数、站立次数、中心格数及停留时间、理毛洗脸次数反应探索能力，而粪便是其紧张的表现；实验装置为内壁涂为白色，长和宽均为40cm的正方形矿场分析箱。实验时将小鼠头朝壁放入箱内，观察5min的活动情况；分别记录小鼠在旷野中的总路程、穿越格子数、站立次数、中心格数以及停留时间、理毛洗脸次数、粪便粒数。
爬杆行为：动物随机分组后，造模给药之前，应当进行爬杆行为学实验的训练，以剔除运动障碍的动物。自制一个50厘米高的木杆，直径0.5厘米，用纱布包裹以防止小鼠的滑落，寻找一个橡胶球粘在杆的顶部以防止动物坐在顶部不主动向杆下爬。测量行为时，将每只小鼠头朝上放置于杆顶端，测量小鼠头由上至下的转向时间(Turn time)以及爬下杆所需的时间(Total time)，指标也代表动物的运动协调能力，如果小鼠在60秒内没有下降，则引导它下降。训练小鼠行为时每只动物进行3次连续试验，试验间隔5分钟。在给药完成后，测量3次连续实验中小鼠的转向时间以及爬下杆所需的全部时间。
转棒行为：在造模之前应该训练行为，以剔除运动不协调的动物。将动物放置在疲劳仪旋转棒上，将转棒速度设置在300秒内以1rpm至30rpm的线性增加的速度旋转。当动物从杆上脱落时捕获自动传感器(s)自动计算，以此代表动物的运动协调能力。在预训练期间，小鼠每天进行2次试验，并在试验之间休息5分钟。在给药完成后，测量3次连续试验中小鼠在转棒上距离第一次掉落的时间(s)，在每次试验之间，动物休息5分钟。
统计方法：实验数据用mean±SEM表示，使用Graphpad Prism5.0软件进行组间的双因素Bonferroni测试的方差分析。
知母皂苷元对MPTP诱导小鼠体重的影响结果如图6所示，由图6所示结果可知，MPTP给药后，小鼠体重逐渐下降，5天后停止给与MPTP，小鼠体重逐渐恢复增加，但仍与对照组小鼠相比有显著性差异，表明知母皂苷元对小鼠体重无明显的影响。
知母皂苷元对MPTP诱导小鼠行为的影响结果如图7所示，由图7所示结果可知，MPTP模型小鼠自发运动量和穿越中心格次数与对照组比显著增加，知母皂苷元和阳性对照美多巴显著降低小鼠的自发运动量和穿越中心格次数；知母皂苷元给与组小鼠从转棒上掉落时间、爬杆实验转头时间和爬杆时间与模型组相比无显著性差异。
知母皂苷元对MPTP诱导小鼠纹状体神经递质的影响结果如图8所示，由图8所示结果可知，与对照组小鼠相比，MPTP模型组小鼠的纹状体中去甲肾上腺素NE和多巴胺DA含量显著降低，而五羟色胺5-HT含量无显著变化；知母皂苷元能显著逆转MPTP诱导的NE和DA的含量，且与模型组相比，MHPG/NE、DOPAC/DA和HIAA/5-HT的比例显著降低，表明知母皂苷元能显著改善MPTP诱导的小鼠帕金森症的病理特征。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.知母皂苷元在制备防治帕金森病的药物中的应用。
2.知母皂苷元在制备辅助治疗帕金森病的药物中的应用。
3.知母皂苷元在制备改善帕金森行为的药物中的应用。
4.知母皂苷元在制备保护皮层神经元的药物中的应用。
5.知母皂苷元在制备修复多巴胺能神经元损伤的药物中的应用。
6.知母皂苷元在制备保护多巴胺能神经元的药物中的应用。
7.根据权利要求1～6任一所述应用，其特征在于，所述知母皂苷元的结构式如式(I)所示：
8.一种用于防治或辅助治疗帕金森的药物，其特征在于，含有式(I)所示知母皂苷元。
9.一种用于改善帕金森行为的药物，其特征在于，含有式(I)所示知母皂苷元。
10.一种用于修复或保护皮层神经元或多巴胺能神经元的药物，其特征在于，含有式(I)所示知母皂苷元。
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