CN1230161C - 柿叶提取物和它的制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
柿叶提取物和它的制备方法及用途，涉及来源于植物材料的药用提取物和制备方法及用途。它是用柿科柿属(Diospyros)植物的叶，经水煮、醇沉、乙酸乙酯萃取、大孔树酯吸附、乙醇洗脱，所得的乙醇液回收乙醇后的浓缩液为柿叶提取物，提取物含总黄酮为65～90%(以提取物干品计)其中含槲皮素(quercetin)、山萘酚(kaempfetol)分别占提取物总重量的8～14%、12～23%(以提取物干品计)，本发明的柿叶提取物可用于制备防治脑动脉硬化、冠心病心绞痛、神经功能退化症、脑卒中后遗症的药物和保健品。
Description
技术领域
本发明涉及来源于植物材料的药用提取物和制备方法及用途，具体地说是植物柿叶的提取物和它的制备方法及用途。
背景技术
柿叶味苦、性寒。具有下气平喘、止渴生津、疗疮等功效，具有广泛的药理作用。国内外研究表明，以柿叶为原料制取的柿叶制剂、柿叶茶、柿叶提取物及柿叶黄酮甙具有降血压、抑菌、降血脂、降低胆固醇、止血，活血化瘀、抑制癌瘤生长等多方面的生理功能。
在柿叶总黄酮中含有的化合物很多，目前已发现的柿叶黄酮化合物有黄芪甙、异槲皮素、山萘酚3-o-β-D-葡萄糖甙、山萘酚、槲皮素、山萘酚3-o-α-L-鼠李糖甙、山萘酚3-β-D-木糖甙、山萘酚3-o-α-L-阿拉伯糖甙、槲皮素3-o-[2″-o-(3.4.5-三羟基苯甲酰)]-葡萄糖甙、芦丁、金丝桃甙hyperin(槲皮素-3-半乳糖甙)、杨梅树皮甙、紫云英甙等，采用不同的提取方法所得黄酮的成分以及含量高低均存在较大差异。
有文献报道对柿叶总黄酮的乙醇提取工艺进行研究。结果表明，用15倍柿叶重的50％乙醇水溶液，在75℃下浸提3h为最佳条件。但此提取方法仅得粗提取物，黄酮含量只有15％左右，难于获得高活性和低副作用效果。无法用于人体药用。
又有报道用水提树脂吸附法提取分离柿叶黄酮的方法，它是通过提取溶剂和吸附树脂的筛选，选用pH为13的碱水作溶剂，从柿叶中提取黄酮，成本低，工艺安全，然后用YF-I树脂吸附，乙醇洗脱。提取获得的粗黄酮，其组份具有降血压功能及促进植物生长活性，但此方法得到粗提取物，杂质仍较多，无法用于人体药用。
发明内容
本发明的目的是通过新的提取制备方法，获得黄酮含量高的柿叶活性成分，用于制备能防治脑动脉硬化、冠心病心绞痛、神经功能退化症、脑卒中后遗症的药物。
为了实施本发明的目的所采用的技术方案：是用柿科(Ebenaceae)柿属(Diospyros L.)植物柿(Diospyros Kaki L.)的叶，经水煮、醇沉、乙酸乙脂萃取、大孔树脂吸附、乙醇洗脱，所得的乙醇液回收乙醇后的浓缩液为柿叶提取物，提取物含总黄酮为70～90％(以提取物干品计)。
按本发明的提取方法，在总黄酮中含有槲皮素(quercetin)、山萘酚(kaempfetol)分别占提取物总重量的8～14％、12～23％(以提取物干品计)。其结构式为：
R1 R2 R3 R4 R5 R
Quercetin -OH -OH -OH -OH -H -OH
Kaempfetol -OH -OH -H -OH -H -OH
柿叶提取物总黄酮和槲皮素和山奈素黄酮的含量检测采用中国药典附录的高效液相色谱法(HPLC)。
本发明所说的柿叶提取物采用的制备方法是用柿科柿属植物柿(Diospyros Kaki L.)的叶为原料，加水煎煮1～3次，每次0.2～3小时，煎液过滤，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.20的清膏1，加乙醇沉淀，取上清液回收乙醇，所得浸膏2加水溶解后用乙酸乙酯萃取，萃取液回收乙酸乙酯后得稠膏3，用水溶解后上大孔树脂柱吸附，用乙醇溶液洗脱，收集乙醇液，回收乙醇后的浓缩物4为柿叶提取物。提取物由于含水量高，不好保存，为此，可以将提取物进一步干燥，得水分≤8的干燥粉，这样用干粉制备各种制剂时更方便且可保证药品的有效成分的含量。
大孔树脂优选为聚酰胺型或聚苯乙烯树脂系列，上大孔树脂柱吸附、洗脱、回收乙醇后浓缩液4干燥的方法很多，可用高温烘干，也可用薄膜蒸发干燥或低温干燥等，本发明优选采用喷雾干燥法，其进风温度60～128℃，出口温度45～80℃，风速5～10m/s，压力0.02～0.1kPa。
本发明所提供的提取物其用途是制备防治脑中卒后遗症和神经功能退化症、脑动脉硬化症、冠心病、心绞痛的药物和保健品。它可以用提取物加入各种辅料，如润滑剂、填充剂、粘合剂、崩解剂等，以常规的药物制剂工艺和制备食品的方法制备成颗粒剂、片剂、胶囊剂、散剂、丸剂和保健品等。
下面用本发明所制得的柿叶提取物，用HPLC方法测定其含总黄酮为77.4％，水解后，用HPLC方法测定含槲皮素、山奈酚苷元分别为提取物总重量的13.6％，16.5％的产品进行如下试验。
一、急性毒性和长期毒性试验
小鼠急性毒性研究：将120只19～21g NIH小鼠(雌雄各半)分成6组，每组20只，分别以五种不同浓度的柿叶提取物p.o.给药，NS阴性对照。观察小鼠的反应并记录每组小鼠的死亡数目，采用Microsoft Excel的线性回归软件，根据对数剂量与经验概率单位绘制直线，计算LD50。柿叶提取物对小白鼠P.O的LD50分别为32.88～38.50g/Kg
大鼠长期毒性实验：取Wistar大鼠120只雌雄各半分成4组，每组30只，分别P.O.给予250mg/Kg、50mg/Kg、10mg/Kg柿叶黄酮提取物(FLDK)，NS阴性对照P.O.生理盐水。连续给药90天，三个剂量组大鼠均未见明显血象、心肺肝肾功能及神经系统功异常，也未心、肺、脾、胃、大脑、肠等重要器官有明显病理变化。
结论：本发明的柿叶提取物毒性很低、安全性高。
二、药效试验
(一)、柿叶提取物对前脑缺血损伤神经元的保护作用
1.实验材料：柿叶提取物，用生理盐水配成合适浓度的混悬液；试验动物用健康雌性S D大鼠90只，体重180～220g，大鼠随机分为正常组(N组)、模型组(M组)，提取物(FLDK)低剂量、中剂量、高剂量组、对照组(天保宁)，每组10只。给药：给药12天(缺血再灌注前4天，后7天)。腹腔灌胃水，每日2次。
2.缺血再灌注损伤模型制备：参照《药理实验方法学》Pulsinelli大鼠四血管阻断前脑缺血模型进行。
前脑缺血再灌注：用电凝椎基底动脉阻断椎动脉血流24小时后，用动脉夹夹闭两侧颈总动脉，阻断血流15分钟，造成前脑缺血。前脑缺血模型成功的大鼠立即出现翻正反射消失，瞳孔扩大等等。15分钟后去除动脉夹，恢复血流供应。恢复血流供应后30～50分钟内大鼠重新站立起来，恢复自主活动，全脑缺血再灌注造型成功。将大鼠置回笼中饲养，按给药方案给药。每天观察大鼠行为和存活情况。缺血再灌注7天后杀死动物，取大脑海马固定切片观察脑神经细胞凋亡和形态变化；并计算存活的锥体细胞密度(个/mm)。
3.实验结果：
3.1.大鼠脑海马组织光学显微镜下组织形态：低倍镜下，正常大鼠脑海马组织显“C”形，分为CA1、CA2、CA3区，CA1区有3～4层锥体细胞，排列整齐；高倍镜下，锥体细胞核大而园，有1～2个核仁，锥体细胞密度为185.5±17.1(图1，表1)
3.2.缺血再灌注7天，可见明显大鼠脑海马组织细胞损伤。生理盐水组大鼠脑海马CA1区锥体细胞已大部分死亡，细胞碎片散乱分布(图2，表1)
3.3.给予不同剂量的柿叶提取物，对缺血再灌注所致大鼠脑海马组织细胞损伤有一定剂量依赖性保护作用(图3-5，表1)。
相当于人常用量的柿叶提取物组对缺血再灌注所致大鼠脑海马CA1区神经元损伤明显减轻，其活锥体细胞密度比对照组大鼠明显增加。动物整体状况改善，大鼠外观活动正常，皮毛光滑，体重减轻不明显。缺血再灌注后动物存活数比对照组明显多。表明柿叶提取物对急性缺血有保护作用。这为柿叶黄酮提取物治疗脑卒中及中风后遗症提供了实验依据。
3.4.阳性对照药天保宁胶囊(100mg/Kg，相当于人常用量)：大鼠脑海马组织细胞形态基本正常，锥体细胞密度比生理盐水组明显增加(P＜0.05，附图天保宁，对缺血再灌注所致大鼠脑海马组织细胞损伤也有保护作用(图6，表1)。
表1：柿叶提取物对前脑缺血再灌流
引起大鼠海马CA1锥体神经细胞损伤的保护作用(
x±s)
| 组别 | 动物数 | 锥体神经细胞密度(/mm) |
| 正常对照 | 8 | 185.5±17.1 |
| 生理盐水 | 8 | 7.5±3.4** |
| FLDK低10mg/kg | 8 | 42.3±21.6### |
| FLDK中40mg/kg | 8 | 81.5±18.1### |
| FLDK高80mg/Kg | 8 | 85.7±18.7### |
| 天保宁100mg/kg | 8 | 51.7±16.0### |
注：*p＞0.05，**＜0.05，***p＜0.01与对照组比较
#p＞0.05，##＜0.05，###p＜0.01与生理盐水组比较
结论：本发明的研究表明柿叶提取物能清除自由基、抗脂质过氧化、抗急性脑缺血，能抑制缺血再灌注引起的脑组织细胞凋亡，对缺血再灌注引起的脑组织损伤有明显的保护作用，并能改善缺血再灌注引起的脑组织神经功能。
(二)大鼠局灶性脑缺血再灌流损伤的保护作用
1、实验材料
柿叶提取物、银可络(银杏提取物)，配成8.0mg/ml。
实验仪器：Leica RM2135轮转式组织切片机(德国)，Olympus bx51光学显微镜。C63图像分析系统(英国)
实验动物：雄性SD大鼠，平均体重300±30g，由本校实验动物中心提供。120只；清洁级标准，合格证号：粤检证字第2003C013号中山大学实验动物中心提供。
分组：先将动物称重，按体重大小排序，编号，用随机区组分组法大鼠随机分成6个组，每组20只，5只一笼，编号。温度控制在25℃±2℃，灯光控制12小时光，12小时暗，自由饮水和食用动物饲料。饲养3天后开始给药。六个组柿叶提取物-P70：低剂量(20mg/kg)组、中剂量(40mg/kg)组、高剂量(80mg/kg组)。阳性药物银可络40.0mg/kg组、假手术组、生理盐水对照组共6组。
给药：给药7天(术前3天，术后3天)，用生理盐水调配至实验浓度，按5mL/kg/次、每天2次灌胃给药。对照组和假手术组灌胃给予等容量生理盐水。
2、方法
模型制备：将大鼠用体积分数为10％的水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉，颈正中切口、分离并结扎左侧颈总动脉近心端、颈外动脉及其分支动脉。分离左侧颈内动脉，沿颈内动脉向下分离翼颚动脉，根部结扎该分支。在颈内动脉近端备线，远端放置动脉夹，颈总动脉分叉处切口，插入40尼龙线，其深度为20mm，栓线进入颈内动脉，入颅至大脑前动脉，阻断大脑中动脉所有血流来源。撤掉动脉夹，扎紧备线，外留1cm长线头，缝合皮肤。继续缺血2h后再灌注，勿需再次麻醉和切开皮肤，轻轻提拉所留线头至有阻力时提示尼龙线头端已至颈总动脉切口处，使血流再通。假手术组除不插栓线外，其余步骤同上。自缺血起3h后按组分别灌胃给药，溶剂用生理盐水。存活鼠再灌注12h、24h、48h、72h时，观察大鼠行为变化，进行神经行为评分。参考Longa的五分制评分标准：0分：正常，无神经损伤症状；1分：不能完全伸展缺血脑半球支配的前爪；2分：向缺血脑半球支配的前爪侧转圈；3分：向缺血脑半球支配的前爪侧倾倒；4分：不能自发行走。
存活鼠再灌注72h后，快速断头取实验鼠大脑，在前连合平面切下厚约2mm冠状脑片，立刻置于质量分数为2％的红四氮唑染料(TTC)的溶液中，37℃孵育30min。梗死区呈现白色，非梗死区呈现红色。用求积仪(C63图像分析系统)测出各区面积，并计算缺血区水肿面积和梗死区占全脑的百分比(％)。
缺血区水肿面积＝缺血侧脑半球横断面面积-正常侧脑半球横断面面积。统计学处理：实验数据用均数±标准差(
x±s)表示，用SPSS10.0软件ANOVA法进行显著性检验，P＜0.05为差异有显著的统计学意义。
3结果
对神经行为的影响：假手术组大鼠均无异常行为，神经行为学评分为0；生理盐水阴性对照组大鼠出现缺血侧眼睛缩小，缺血对侧肢体偏瘫，肢体不能完全伸展、对侧前爪向外侧转圈或向对侧倾倒的神经损伤症状，缺血后12h、24h、48h、72h的行为评分平均值分别为3.0分、2.5分、2.38分和2.0分。脑缺血前后灌胃给予柿叶提取物的低、中、高3个剂量组均可显著降低大鼠组神经行为学评分，且降低程度有剂量依赖关系。银可络组行为评分也显著低于溶媒对照组。表明柿叶提取物-P70灌胃可显著改善局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的神经损伤症状(表1)。
表2柿叶提取物对大鼠缺血再灌注后神经行为评分的影响(
x±s)
| 组别 | 药物剂量 | 动物数/(n) | 缺血后不同时间的行为评分(分) | |||
| 12h | 24h | 48h | 72h | |||
| 假手术组 | 6 | 0 | ||||
| 生理盐水 | 5.0ml/kg | 8 | 3.0…… | 2.5 | 2.38 | 2.00 |
| 柿叶提取物低剂量组 | 20mg/kg | 7 | 3.14 | 3.14 | 1.86 | 1.57 |
| 柿叶提取物中剂量组 | 40mg/kg | 9 | 1.11** | 1.11** | 1.00** | 0.88** |
| 柿叶提取物高剂量组 | 80mg/kg | 8 | 1.25** | 1.25** | 1.00** | 0.75** |
| 银可络组 | 40mg/kg | 10 | 1.00* | 1.00** | 0.70** | 0.50** |
注：与NS对照组比较：**P＜0.05(秩和检验)。
对脑缺血区水肿面积的影响：假手术组脑组织无梗死及水肿；生理盐水对照组缺血侧脑组织有明显水肿现象，水肿面积为26.38单位；柿叶提取物小、中、大3个剂量组也均可显著缩小缺血侧脑组织水肿面积，分别缩小了21.1％、43.6％和60.2％；并且大剂量组缩小缺血侧脑组织水肿面积的作用比银可络组相当(表2)。表明柿叶提取物能减轻大鼠脑缺血再灌注损伤引起的脑水肿，对大鼠脑缺血再灌注损伤引起的脑梗死有显著的保护作用。
表3柿叶提取物对大鼠脑缺血再灌注后脑水肿面积的影响(
x±s)
| 组别 | 药物剂量 | 动物数(n) | 脑水肿面积 | 保护率(％) |
| 假手术组 | 6 | -1.80±6.49 | ||
| 生理盐水对照组 | 5.0ml/kg | 8 | 26.38±11.90## | |
| 柿叶提取物小剂量组 | 20mg/kg | 7 | 19.86±13.02** | 21.4 |
| 柿叶提取物中剂量组 | 40mg/kg | 9 | 14.89±9.93** | 43.6 |
| 柿叶提取物大剂量组 | 80mg/kg | 8 | 10.50±5.66*** | 60.2 |
| 银可络组 | 40.0mg/kg | 10 | 13.80±9.69*** | 47.7 |
对脑梗死面积的影响：假手术组脑组织无梗死；生理盐水对照组缺血侧脑组织有梗死现象，梗死体积占全脑的34.93％；柿叶提取物小、中、大3个剂量组也均可显著缩小缺血侧脑组织梗死体积，分别降低了20.8％、42.3％和58.6％；缩小缺血侧脑组织梗死面积的作用比同剂量银杏提取物组相当(表3)。表明柿叶提取物对大鼠脑缺血再灌注损伤引起的脑梗死也有显著的保护作用。
表4 柿叶提取物对大鼠脑缺血再灌注后脑梗死体积的影响(
x±s)
| 组别 | 药物剂量 | 动物数(n) | 脑梗死面积(％) | 保护率(％) |
| 假手术组 | 6 | 0 | ||
| 生理盐水对照组 | 5.0ml/kg | 8 | 34.93±5.67 | |
| 柿叶提取物低剂量组 | 20mg/kg | 7 | 27.68±6.61* | 20.8 |
| 柿叶提取物中剂量组 | 40mg/kg | 9 | 20.15±4.53** | 42.3 |
| 柿叶提取物高剂量组 | 80mg/Kg | 8 | 14.53±4.48** | 58.6 |
| 银可络组 | 40.0mg/kg | 10 | 18.16±4.72** | 48.0 |
结论：实验结果表明柿叶提取物能显著改善大鼠脑缺血再灌注损伤引起的行为症状，缩小脑梗死面积和水肿面积，且作用强度有剂量依赖关系，剂量为80mg/Kg时作用最强。提示柿叶提取物对大鼠急性局灶性脑缺血再灌注损伤有保护作用。
(三)柿叶提取物对AlCl3造成AD模型大鼠学习和记忆功能的影响
1、实验材料：柿叶提取物，用生理盐水配成合适浓度的混悬液；试验动物用健康雌性S D大鼠90只，体重340～360g，大鼠随机分为正常组(N组)、模型组(M组)、柿叶提取物小剂量(FLDK低组)和柿叶提取物中剂量(FLDK中组)，柿叶提取物高剂量(FLDK高组)、加兰他敏组(Galantamine 30mg)，每组15只。
2、AD模型制作：M组、FLDK低、中、高剂量三个组和加兰他敏组大鼠每天腹腔注射1ml浓度为9mg/ml的灭菌AlCl3溶液，连续注射3天，间隔1天，共计72天。N组大鼠腹腔注射1ml灭菌生理盐水，注射周期和时间同上。
3、用药：柿叶提取物(FLDK)的灌胃和AD模型的制作同时进行。
FLDK低、中、高剂量三个组、加兰他敏组大鼠每天灌胃15ml/kg/次，每天二次，每连续灌胃7天，间隔1天，共计72天。FLDK低组每次灌胃柿叶提取物20mg/kg，相当成人剂量的1/2倍；和FLDK中组灌胃40mg/kg(相当成人剂量的1倍)。FLDK高组灌胃80mg/kg(相当成人剂量的2倍)，加兰他敏60mg/kg(相当成人剂量的2倍)、N组和M组大鼠灌胃等量生理水，周期和时间同上。
4、记忆行为测定：造模和用药结束后，在夜晚安静和避光的条件下，用Y型电迷宫仪训练和测定大鼠的学习获得和记忆保持能力，电压是90V，时间延迟是1s，连续训练和测定10次/只/天，同时记录大鼠的逃避潜伏期和逃避正确率等，连续4天。受电刺激后，大鼠从通电臂灯源处直接逃至安全臂灯源处为正确逃避，所用时间为逃避潜伏期。如果电刺激后大鼠不逃避或逃避后在中途停止不动，则它们的逃避潜伏期按正常大鼠平均逃避潜伏期的2倍计算。
5、实验结果：
5.1柿叶黄酮提取物对大鼠Y迷宫逃避正确率的影响
在连续前3天的测试中，M组的逃避正确率最低，FLDK高剂量组的最高。至第4天，M组的逃避正确率没有再明显升高，而其他5组的继续升高，M组的逃避正确率明显低于N组(P＜005)，FLDK低、中、高和加兰他敏组明显高于M组(P＜005，或P＜0001)(见表2)。
表5各组大鼠Y迷宫逃避正确率(
x±s)
| 组别 | 剂量mg/kg | 第1天 | 第2天 | 第3天 | 第4天 |
| N组 | 0 | 0.55±0.23 | 0.73±0.25 | 0.91±0.17 | 0.98±0.12 |
| M组 | 0 | 0.50±0.29 | 0.63±0.26 | 0.81±0.19 | 0.85±0.11# |
| FLDK低 | 20 | 0.52±0.27 | 0.68±0.25 | 0.87±0.22 | 0.94±0.11* |
| FLDK中 | 40 | 0.54±0.25 | 0.69±0.27 | 0.89±0.18 | 0.98±0.11** |
| FLDK高 | 80 | 0.53±0.28 | 0.72±0.24 | 0.91±0.12* | 0.99±0.09** |
| 加兰他敏 | 60 | 0.58±0.29 | 0.73±0.25 | 0.90±0.10 | 0.98±0.10** |
注：与N组比较：#P＜0.05；与M组比较：*P＜005，**P＜00012
5.2柿叶提取物对大鼠Y迷宫逃避潜伏期的影响
连续训练3天后，第4天测定各组大鼠的逃避潜伏期。M组的逃避潜伏期差异很大，比N组显著性延长(P＜005)；FLDK低、中、高组和加兰他敏组都比M组显著性缩短(P＜005，或P＜001)，以FLDK中、高剂量组更显著。
表6各组大鼠Y迷宫逃避潜伏期(
x±s)
| 组别 | 剂量mg/kg | 动物数n | 潜伏期(秒) |
| N组 | 0 | 10 | 3.8±2.4 |
| M组 | 0 | 10 | 7.5±3.9# |
| FLDK低 | 20 | 10 | 5.1±3.3 |
| FLDK中 | 40 | 10 | 4.4±2.5* |
| FLDK高 | 80 | 10 | 3.6±2.7** |
| 加兰他敏 | 60 | 10 | 3.8±2.5** |
注：与N组比较：#P＜0.05；与M组比较：*P＜005，**P＜00012
5.3柿叶提取物片对大鼠Y迷宫逃避行为方式的影响
M组表现为逃避启动障碍，个别大鼠根本就不逃避，逃避中途停止或终点错误。给药后，柿叶提取物片中、高剂量和加兰他敏组的逃避行为方式明显改善(见表3)。
表7各组大鼠Y迷宫逃避行为方式的差异
| 组别 | 启动方式 | 逃避速度 | 逃避终点 |
| N | 直接矢往灯光处 | 小跑 | 安全臂灯源处 |
| M | 剧烈跳蹦数次打转数圈后再矢往灯光处 | 疾跑 | 安全臂近心端，敲击迷宫仪仅驱使少数大鼠靠近灯源处 |
| FLDK低 | 和M组相似，但跳蹦剧烈程度、但跳蹦剧 | 疾跑 | 安全臂近心端，敲击迷宫仪 |
| 烈程度、次数和打转圈数明显减少 | 后大多数立刻小跑至灯源处 | ||
| FLDK中 | 直接矢往灯光处 | 疾跑 | 安全臂灯源处 |
| FLDK高 | 直接矢往灯光处 | 疾跑 | 安全臂灯源处 |
| 加兰他敏 | 直接矢往灯光处 | 疾跑 | 安全臂灯源处 |
结论：AlCl3复制的大鼠A D模型是研究A D发病机制和防治药物筛选的动物模型之一。给AlCl3造成阿尔茨海默病模型大鼠服用柿叶提取物后以Y迷宫测试，结果大鼠学习和记忆功能得以改善。其机制可能与其降低痴呆大鼠脑内过氧化脂质水平，减少自由基对痴呆大鼠脑的损害有关。表明柿叶提取物对老年性痴呆有治疗作用。
三、防治脑动脉硬化症、冠心病心绞痛和神经功能退化症的临床验证(一)、对脑动脉硬化症和冠心病心绞痛的防治作用：
对60例脑动脉硬化、冠心病心绞痛患者进行临床观察，全部为住院病例，其中男性38例，女性22例，年龄46～81岁，其中50～70岁占75.6％，其中脑动脉硬化48例，冠心病心绞痛22例。
1、诊断标准：排除严重心、肝、肾功能异常者，结合中西医诊断标准诊断。
2、疗效标准(脑动脉硬化症)
显效：临床症状缓解，实验室指标有明显好转者。
有效：临床症状好转，实验室指标有好转。
无效：临床症状无变化，实验室指标无改变。
实验室指标包括脑血流图、脑电图、心电图、血压、胆固醇等项目。
显效：治疗后心绞痛症状分级降低两级。原为I、II级心绞痛者基本消失，不用硝酸甘油。
有效：治疗后心绞痛症状降低一级，硝酸甘油减用一半以上，原为I级者心绞痛基本消失，不用硝酸甘油。
无效：症状及硝酸甘油用量无改变，或虽有减少但不明显者。
3、治疗方法：采用本发明提供的柿叶提取物(FLDK)片。口服，一次2片，一日3次，30天为一疗程，全部病例至少服用一个疗程以上。
4、观察内容
①症候：头痛头晕、胸痛、纳差、面色暗黑，肌肤甲错，舌质暗红或瘀斑、瘀点，脉弦涩或弦细。
②体征及理化检查：血压、脑血流图、脑电图、心电图、血常规、尿常规、大便常规、肝功、肾功、血脂。
5、治疗结果
5.1总疗效：FLDK片用于治疗脑动脉硬化症、冠心病心绞痛有着较好的疗效。总有效率达86.67％，结果详见表8。
表8 FLDK片临床疗效表
| 病种 | 例数 | 显效 | 有效 | 无效 | 有效率 | |
| 脑动脉硬化 | 38 | 12 | 22 | 4 | 89.47％ | |
| 劳心累绞型痛 | I | 5 | 1 | 3 | 1 | 80.00％ |
| II | 15 | 8 | 5 | 2 | 86.67％ | |
| II | 2 | 0 | 1 | 1 | 50％ | |
| 共计 | 60 | 21 | 31 | 8 | 86.67％ | |
5.2FLDK片尚具有降血压及降血脂作用，治疗前后对照有显著性差异(P＜0.01)，详见表9、10。
表9FLDK片治疗前、后血压结果(
x±s)
| 病种 | 收缩压(mmHg) | 舒张压(mmHg) | ||
| 治疗前 | 治疗后 | 治疗前 | 治疗后 | |
| 冠心病 | 162.36+16.21 | 131.28+13.11** | 106.21+10.12 | 80.36+9.67* |
| 脑动脉硬化 | 168.79+12.42 | 142.13+11.39** | 95.79+15.13 | 89.32+11.24 |
表10FLDK片治疗前、后血脂结果(
x±s)
| 病种 | 胆固醇(mg/dl) | 甘油三酯(mg/dl) | ||
| 治疗前 | 治疗后 | 治疗前 | 治疗后 | |
| 冠心病 | 189.91+31.61 | 175.23+26.13 | 165.25+19.52 | 142.16+18.32* |
| 脑动脉硬化 | 246.51+24.18 | 205.18+21.32** | 126.06+12.24 | 80.35+10.23** |
*P＜0.05，**P＜0.01.
5.3 FLDK片能明显改善气滞血瘀症状，具有活血化瘀，通络止痛之功效，能明显改善头晕头痛，胸痛，眩晕，失眠面色暗红或黑，舌质暗或有瘀斑。其结果见表11。
表11：FLDK片对中医证的临床治疗疗效分析
| 头晕头痛 | 胸痛 | 眩晕 | 失眠 | 情绪不稳 | 面色暗红黑 | 舌质暗或有瘀斑 | |
| 总例数 | 48 | 12 | 40 | 41 | 52 | 32 | 55 |
| 有效数 | 45 | 10 | 36 | 36 | 45 | 17 | 42 |
| 有效率％ | 93.75 | 83.33 | 90.0 | 90.80 | 86.54 | 53.13 | 76.36 |
结论：经对60例脑动脉硬化及冠心病心绞痛治疗结果表明，本发明的柿叶提取物片对中医辨证属瘀阻脑络型眩晕证、心血瘀阻型胸痹证有较好的疗效，能显著改善头晕、头痛、胸痹心痛，面色暗黑，舌质暗红或瘀斑等症状，起到活血化瘀，通络止痛之功效，总有效率为86.67％，并对高血压及高血脂有一定的治疗作用，能明显降低血压及血脂，治疗前后对照有极显著性差异(P＜0.01)。本药在治疗过程中未发现明显毒副作用，治疗前后肝、肾功能均无异常，具有较好的安全性。
(二)对VD的防治作用：
血管性痴呆属于器质性痴呆范畴，以智能减退为基本表现，并有反复脑缺血发作史，多有高血压病史以及脑动脉硬化征象，或有糖尿病、肥胖症、冠心病等危险因素，且有中风史，遗有轻偏瘫等局灶性神经定位障碍
1资料与方法
1.1病例情况：全部病例均系神经科住院病人，男性70例，女性20例；年龄58～76岁，平均64.9岁；病程最短1年，最长10年，平均3.9年。由主研脑血管疾病的神经内科医师作临床检查、神经量表测试，并经头颅CT或MR证实者。
1.2诊断标准：1有智能损害的证据，并妨碍到工作或生活或交往；2有近记忆力缺损证据；3有认知、判断、定向、计算等能力减退的证据之一；4无意识障碍。
1.3排除标准：有严重神经、血液、内分泌等原发性疾病。
1.4量表选择：
1美国简易智能量表，总分30分，若得分＜16分者为智能障碍；
2日本长谷川痴呆量表，总分30分，若得分＜16分者为痴呆成立；
3海琴斯克缺血指数量表，总分18分，若得分＞7分者为血管性痴呆，
得分＜7分者为老年性痴呆。
1.5中医主要症状：参考《老年呆病的诊断、辨证分型及疗效评定标准(讨论稿)》，结合临床经验，将以下症状作为观察指标：神情呆滞，语言不利，或寡言少语或语言倒错，善忘，不寐，头晕，头痛，舌质瘀点。
1.6疗效标准：采用综合评定法，以患者治疗前后的智能状态、中医主要症状、体征等方面的改变作为综评内容，并以智能改变为重点。痊愈者长谷川痴呆量表测试得分增加到正常值，显效者得分增加5分以上，有效者得分增加不足5分，无效者得分不但无增加反而下降。
1.7用药方法：每天早中晚各服柿叶提取物(FLDK)片2片，每天2次，1个月为1疗程，均用药3个疗程，其间停用其它脑血管扩张药物、脑细胞代谢药物、神经功能调节药物。
2疗效与结果
2.1治疗前后量表积分变化：见表12、13。
表12 治疗前后简易智能量表积分变化(
x±s)
| 药物组 | n | 治疗前 | 治疗后 | P |
| FLDK | 30 | 12.45±5.42 | 19.05±6.09 | ＜0.05 |
| 步长脑心通 | 30 | 12.58±5.38 | 18.79±6.16 | ＜0.05 |
表13 治疗前后长谷川痴呆量表积分变化(
x±s)
| 量表名 | n | 治疗前 | 治疗后 | P |
| FLDK | 30 | 12.95±5.62 | 19.85±6.19 | ＜0.05 |
| 步长脑心通 | 30 | 12.98±5.78 | 19.62±6.36 | ＜0.05 |
2.2中医主要症状变化：见表14。
表14治疗前后主要症状评分变化(
x±s)
| 主要症状 | 药物 | n | 治疗前 | 治疗后 | P |
| 神情呆滞 | FLDK步长脑心通 | 30 | 3.15±0.543.18±0.53 | 2.31±0.802.30±0.81 | ＜0.01＜0.01 |
| 语言不利 | FLDK步长脑心通 | 28 | 3.33±0.653.31±0.65 | 2.28±0.932.30±0.95 | ＜0.01＜0.01 |
| 善忘不寐 | FLDK步长脑心通 | 29 | 3.83±0.563.61±0.56 | 1.31±0.951.33±0.93 | ＜0.01＜0.01 |
| 头晕头痛 | FLDK步长脑心通 | 30 | 3.91±0.853.76±0.85 | 1.31±0.851.30±0.83 | ＜0.01＜0.01 |
| 舌质瘀点 | FLDK步长脑心通 | 30 | 2.03±0.422.05±0.42 | 1.28±0.641.29±0.61 | ＜0.01＜0.01 |
从14表可见，60例经服FLDK和脑心通3个疗程后，二药治疗的量表得分均明显增加(P＜0.01)，说明都有恢复记忆力、改善智能作用。
2.3疗效分析：见表15。
表15二种药物对血管性痴呆疗效统计
| 病名 | n | 痊愈 | 显效 | 有效 | 无效 | 总有效率(％) | ||||
| 例 | 率(％) | 例 | 率(％) | 例 | 率(％) | 例 | 率(％) | |||
| FLDK | 30 | 0 | 0 | 4 | 16.7 | 18 | 60.0 | 8 | 26.7 | 73.4 |
| 步长脑心通 | 30 | 0 | 0 | 4 | 13.3 | 17 | 56.7 | 9 | 30.0 | 70.4 |
从12表可以知，本品对血管性痴呆症的总有效率为70.9％，尽管痊愈者为零、显效仅5例，但有效率却占一半多(54.8％)，两者疗效无显著性差异。
3结论：FLDK片对血管性痴呆的智能改善作用：30例经服FLDK3个疗程后，量表得分明显增加(P＜0.01)，说明有恢复记忆力、改善智能作用，且头晕头痛，失眠、烦躁、易怒、等症状改善非常明显，达73％以上。
(三)对老年性痴呆症的防治作用：
1资料与方法
1.1全部病例均系神经科住院病人，男性19例，女性11例；年龄58～76岁，平均64.9岁；病程最短1年，最长10年，平均3.9年。由主研脑血管疾病的神经内科医师作临床检查、神经量表测试，并经头颅CT或MR证实者。
1.2诊断标准：1是选择有智能损害的证据，并妨碍到工作或生活或交；2是有近记忆力缺损证据；3是有认知、判断、定向、计算等能力减退的证据之一；4是无意识障碍。
1.3排除标准：有脑血管疾病史、急怍起病、症状波动和神经系统局灶症状或体征明显的血管性痴呆、以及严重神经、血液、内分泌等原发性疾病。
1.4量表选择：(同前)
1.5中医主要症状：根据临床经验，将以下症状作为观察指标：神情呆滞，语言不利，或寡言少语或语言倒错，善忘，不寐，头晕，头痛，舌质瘀点，目眩。
1.6疗效标准：采用综合评定法，以患者治疗前后的智能状态、中医主要症状、体征等方面的改变作为综评内容，并以智能改变为重点。
1.7用药方法：每天早晚各服FLDK胶囊2粒，每天2次2粒，1个月为1疗程，均用药3个疗程，其间停用其它脑血管扩张药物、脑细胞代谢药物、神经功能调节药物。
2疗效与结果
2.1治疗前后量表积分变化：见表13、14。
表16治疗前后简易智能量表积分变化(
x±s)
| 药物组 | n | 治疗前 | 治疗后 | P |
| FLDK | 90 | 13.45±5.42 | 18.65±5.92 | ＜0.05 |
| 天保宁胶囊 | 90 | 12.98±5.78 | 19.72±5.86 | ＜0.05 |
表17 治疗前后海琴斯克缺血指数量表积分变化(
x±s)
| 量表名 | n | 治疗前 | 治疗后 | P |
| FLDK | 90 | 5.85±3.34 | 10.30±4.30 | ＜0.01 |
| 天保宁胶囊 | 90 | 5.98±3.38 | 10.16±4.16 | ＜0.01 |
2.2中医主要症状变化：见表18。
表18 治疗前后主要症状变化(
x±s)
| 主要症状 | n | 治疗前 | 治疗后 | P |
| 神情呆滞 | 30 | 3.15±0.54 | 2.31±0.85 | ＜0.01 |
| 思考力障碍 | 25 | 3.28±0.64 | 2.25±0.78 | ＜0.05 |
| 判断力障碍 | 28 | 3.33±0.85 | 2.13±0.95 | ＜0.05 |
| 记忆力障碍 | 28 | 3.36±0.85 | 2.18±0.85 | ＜0.05 |
| 语言不利 | 28 | 3.31±0.65 | 2.23±0.98 | ＜0.01 |
| 失眠 | 30 | 3.83±0.56 | 1.30±0.85 | ＜0.01 |
| 烦躁、易怒、 | 30 | 3.56±0.53 | 1.520±0.85 | ＜0.01 |
| 舌质瘀点 | 30 | 2.13±0.40 | 1.18±0.62 | ＜0.01 |
2.3疗效分析：见表19。
表19 二种药物对老年性痴呆疗效统计
| 病名 | n | 痊愈 | 显效 | 有效 | 无效 | 总有效率(％) | ||||
| 例 | 率(％) | 例 | 率(％) | 例 | 率(％) | 例 | 率(％) | |||
| FLDK胶囊 | 30 | 0 | 0 | 4 | 16.7 | 16 | 53.3 | 10 | 30 | 70.0 |
| 天保宁胶囊 | 30 | 0 | 0 | 3 | 10.0 | 16 | 53.3 | 11 | 33.0 | 67.7 |
从19表可以知道，FLDK对本病的总有效率为70.0％，显效16.7％，与目前常用药天保宁胶囊70％的总有效率相当。而没观察到明显副作用。3结论：FLDK片对老年性痴呆的智能改善作用，从上述表格可以看到，痰浊阻窍，气滞血瘀的老年性痴呆(Alzhermer‘s症)30例病员经服FLDK 3个疗程后，量表得分明显增加(P＜0.01)，说明有恢复记忆力、改善智能作用，且头晕头痛，失眠、烦躁、易怒、等症状改善非常明显，达70％以上。
(四).对脑卒中后遗症的防治作用：
1资料与方法
1.1病例情况：全部病例均系神经科住院病人，男性22例，女性8例；年龄58～70岁，平均64.9岁；病程最短2个月，最长1年，平均3.9月。由主研脑血管疾病的神经内科医师作临床检查、神经量表测试，并经头颅CT或MR证实者。
1.2诊断标准：中西医结合诊断
1.3排除标准：有严重神经、血液、内分泌等原发性疾病；
1.4量表选择：
(1)中医证候学(包括症状、舌脉象的观察)；(2)神经系统症状体征(包括患者的神志、语言及运动功能)；(3)头颅CT扫描。
1.5疗效评定标准：《脑卒中患者神经功能缺损程度评分标准》和中风病中医症状分级量化表进行计分。
1.6疗效标准：采用综合评定法，以患者治疗前后的感觉、语言、运动、记忆力中医主要症状、体征等方面的改变作为综评内容，并以神经功能缺损改变为重点。
1.7用药方法：每天早中晚各服柿叶提取物(FLDK)片1片，每天3次，1个月为1疗程，均用药3个疗程，其间停用其它脑血管扩张药物、脑细胞代谢药物、神经功能调节药物。
2疗效与结果
2.1.FLDK中风症状神经功能缺损程度和神经症状的疗效，见表20、21
表20：FLDK片对中风病神经功能缺损程度的疗效(
x±s)
| 治疗前积分 | 治疗后积分 | p | |
| 意识 | 7.82±1.3 | 3.2±1.6 | ＜0.01 |
| 水平凝视功能 | 3.21±0.68 | 1.5±0.95 | ＜0.01 |
| 面瘫 | 2.45±0.65 | 0.89±0.65 | ＜0.01 |
| 言语 | 4.53±1.88 | 1.58±0.78 | ＜0.01 |
| 上肢肌力 | 5.12±1.21 | 2.13±0.89 | ＜0.01 |
| 手肌力 | 4.64±1.89 | 1.98±1.2 | ＜0.01 |
| 下肢肌力 | 4.87±1.98 | 2.21±1.32 | ＜0.01 |
| 步行能力 | 3.86±1.76 | 1.78±1.21 | ＜0.01 |
表21：FLDK片对中风病神经症状的疗效(
x±s)
| 治疗前积分 | 治疗后积分 | p | |
| 神经状态 | 3.28±0.64 | 1.54±0.85 | ＜0.01 |
| 语言能力 | 2.98±0.75 | 1.18±0.65 | ＜0.01 |
| 上肢肩关节 | 3.53±0.68 | 1.55±0.91 | ＜0.01 |
| 上肢指关节 | 2.95±0.85 | 0.89±0.65 | ＜0.01 |
| 下肢髋关节 | 3.21±0.68 | 1.65±0.67 | ＜0.01 |
| 下肢趾关节 | 2.65±0.61 | 0.86±0.60 | ＜0.01 |
| 综合功能 | 2.89±0.68 | 0.89±0.60 | ＜0.01 |
2.2中医主要症状变化：见表22。
表22 治疗前后主要症状变化(
x±s)
| 主要症状 | n | 治疗前 | 治疗后 | P |
| 头晕目眩 | 28 | 2.35±0.56 | 1.01±0.75 | ＜0.01 |
| 头痛 | 22 | 2.63±0.56 | 0.63±0.65 | ＜0.01 |
| 颈项强急 | 30 | 2.15±0.54 | 2.31±0.80 | ＜0.01 |
| 肢体强急 | 25 | 2.03±0.46 | 1.28±0.64 | ＜0.01 |
| 肢体麻木 | 21 | 2.03±0.42 | 1.15±0.64 | ＜0.01 |
| 舌质 | 30 | 2.63±0.42 | 1.28±0.64 | ＜0.01 |
2.3疗效分析：见表23。
表23 对脑中风后遗症疗效统计
| 病名 | n | 痊愈 | 显效 | 有效 | 无效 | 总有效率(％) | ||||
| 例 | 率(％) | 例 | 率(％) | 例 | 率(％) | 例 | 率(％) | |||
| FLDK | 30 | 0 | 0 | 15 | 50 | 11 | 36.67 | 4 | 13.33 | 86.67 |
3结论：
FLDK片对脑中风后遗症：头痛头晕、眩晕、颈项强急、肢体强急、肢体麻木、情绪不稳、记忆力减退、半身不遂、言语不清、意识障碍、肢体麻木、有显著改善作用，总有效率为89％；显效率50％。
附图说明
图1是正常对照对前脑缺血再灌流引起大鼠海马CA1锥体神经细胞损伤的保护作用细胞显微图
图2是生理盐水对前脑缺血再灌流引起大鼠海马CA1锥体神经细胞损伤的影响细胞显微图
图3是脑心清片低剂量对前脑缺血再灌流引起大鼠海马CA1锥体神经细胞损伤的保护作用细胞显微图
图4是脑心清片中剂量对前脑缺血再灌流引起大鼠海马CA1锥体神经细胞损伤的保护作用细胞显微图
图5是脑心清片高剂量对前脑缺血再灌流引起大鼠海马CA1锥体神经细胞损伤的保护作用细胞显微图
图6是天保宁对前脑缺血再灌流引起大鼠海马CA1锥体神经细胞损伤的保护作用细胞显微图
以下通过实施例来阐述本发明的柿叶提取物及制备方法。
具体实施方案
实施例1、
取干柿叶150Kg，加水3500L煎煮2次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15(60℃)，得流浸膏40kg加乙醇120L至含醇量达65％，静置过夜，滤取上清液备用；沉淀用85％乙醇洗涤两次，收集洗涤液，静置，吸取上清液与前上清液合并，回收乙醇，所得浸膏6kg，加水80kg溶解，滤过，滤液用醋酸乙酯120L提取3次，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯，得稠膏4kg加水溶解，上大孔树脂柱(大孔树脂为聚酰胺型)，用水洗至洗脱液无色，再用75％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收酒精，得相对密度为1.10(60℃)浓液进行减压喷雾干燥即得1800g的干粉，喷雾的条件其：进风温度108℃；出口温度65℃；风速8m/s；压力0.05Pa，1干燥，干粉水分1.05％。柿叶提取物用HPLC方法测定含总黄酮为77.4％，水解后，槲皮素、山奈酚苷元的含量用HPLC方法测定分别为提取物总重量的13.6％，16.5％。
实施例2、
取干柿叶350Kg，加水5500L煎煮3次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.18(60℃)，得流浸膏100kg加乙醇450L至含醇量达80％，静置过夜，滤取上清液备用；沉淀用85％乙醇洗涤两次，收集洗涤液，静置，吸取上清液与前上清液合并，回收乙醇，所得浸膏5.6kg，加水95kg溶解，滤过，滤液用醋酸乙酯300L提取3次，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯，得稠膏6kg加水溶解，上大孔树脂柱(大孔树脂为聚酰胺型)，用水洗至洗脱液无色，再用80％乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，回收酒精，得相对密度为1.18(60℃)浓液减压喷雾干燥即得4800g，喷雾的条件其：进风温度100℃；出口温度55℃；风速7.5m/s；压力0.05Pa，1次干燥。干粉水分为1.12％，柿叶提取物用HPLC方法测定含总黄酮为85.2％，水解后，槲皮素、山奈酚苷元的含量用HPLC方法测定分别为提取物总重量的13.9％，19.6％。
| 样品序号 | E50 | 97号 | 96 | 98 |
| 槲皮素含量(％) | 8.3 | 13.6 | 11.5 | 13.9 |
| 山奈素含量(％) | 17.6 | 16.5 | 13.5 | 19.6 |
| 总黄酮含量(％) | 66.6 | 77.4 | 64.2 | 85.2 |
实施例3
取干柿叶500Kg，加水5500L煎煮2次，每次2.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.12(60℃)，得流浸膏100kg加乙醇320L至含醇量达75％，滤取上清液备用；沉淀用75％乙醇洗涤两次，收集洗涤液，回收乙醇，所得浸膏11.6kg，加水150kg溶解，滤过，滤液用醋酸乙酯320L提取3次，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯，得稠膏14kg加水溶解，上大孔树脂柱(大孔树脂为AB-8型)，用水洗至洗脱液无色，再用55％乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，回收酒精，得相对密度为1.13(60℃)浓液减压喷雾干燥即得6800g，测定柿叶提取物含总黄酮为66.6％，槲皮素、山奈酚苷元的含量分别为提取物总重量的8.3％，17.6％。取干粉1000g加适量淀粉1000g，混匀，加蜂蜜20.k0g泛丸成水泛丸，干燥得2.5kg干燥丸，包装成1万小包的丸剂，即得0.25g/包(每包含提取干粉100mg，大约相当于生药20g)。口服剂量：一次1小袋，一日3次。
Claims (6)
1、一种柿叶提取物，其特征在于：是用柿科柿属植物柿的叶，经水煮、醇沉、乙酸乙酯萃取、大孔树脂吸附、乙醇洗脱，所得的乙醇液回收乙醇后的浓缩液为柿叶提取物，提取物以干品计其中含总黄酮为70～90％。
2、根据权利要求1所述的柿叶提取物，其特征在于：所说的总黄酮中含有槲皮素、山萘酚分别占提取物总重量的8～14％、12～23％。
3、根据权利要求1所述的柿叶提取物的制备方法，其特征至于：用柿科柿属植物柿的叶为原料，加水煎煮1～3次，每次0.2～3小时，煎液过滤，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.20的清膏(1)，加乙醇沉淀，取上清液回收乙醇，所得浸膏(2)加水溶解后用乙酸乙酯萃取，萃取液回收乙酸乙酯后的稠膏(3)用水溶解后上大孔树脂柱吸附，用乙醇溶液洗脱，收集乙醇液，回收乙醇后的浓缩液(4)为柿叶提取物。
4、根据权利要求3所述的柿叶提取物的制备方法，其特征在于：所说的大孔树脂为聚酰胺型或聚苯乙烯型大孔吸附树脂；上大孔树脂柱吸附、分离、回收乙醇后浓缩液(4)进一步干燥得水分≤8％的干粉。
5、根据权利要求4所述的柿叶提取物的制备方法，其特征在于：所说的浓缩液(4)进一步干燥是采用喷雾干燥法，其进风温度60～128℃，出口温度45～80℃，风速5～10m/s，压力0.02～0.1kPa。
6、根据权利要求1所述的柿叶提取物的用途，其特征在于：制备防治脑动脉硬化、冠心病心绞痛、神经功能退化症、脑卒中后遗症的药物和保健品。
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| CN1546014A (zh) | 2004-11-17 |
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