CN115282154A - 11-羰基-β-乙酰乳香酸在制备治疗猫传腹药物中的用途 - Google Patents

11-羰基-β-乙酰乳香酸在制备治疗猫传腹药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了11‑羰基‑β‑乙酰乳香酸在制备治疗猫传腹药物中的用途，涉及生物医药技术领域。本发明将11‑羰基‑β‑乙酰乳香酸引入到抑制猫传染性腹膜炎病毒的应用中，通过间接免疫荧光、Western Blot检测猫传染性腹膜炎病毒N蛋白表达量的变化，TCID50检测猫传染性腹膜炎病毒量滴度变化，表明11‑羰基‑β‑乙酰乳香酸具有明显的抗猫传染性腹膜炎病毒的作用，随药物浓度增加，对猫传染性腹膜炎病毒抑制作用增强，最低有效浓度为3.978μM。

Description

11-羰基-β-乙酰乳香酸在制备治疗猫传腹药物中的用途
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及11-羰基-β-乙酰乳香酸在制备治疗猫传腹药物中的用途。
背景技术
猫传染性腹膜炎病毒是猫传染性腹膜炎病(简称猫传腹)的诱发病毒，该病毒是由于猫冠状病毒的基因位点发生变异导致的，变异之前此种冠状病毒传染性较强，虽然理论上该病毒仍具有传染性，然而因传染途径限制，其他猫染病风险不高。该病属于猫科易感疾病，同时其他猫科野生动物也具备一定的发病率，并且致死率较高。该疾病通常是致命的，该疾病的特征是纤维蛋白性和肉芽肿性浆膜炎、体腔内富含蛋白质的浆液性积液和/或肉芽肿性病变(脓性肉芽肿)，这种致命疾病的病原体是来自猫肠道冠状病毒(FECV)猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)。两种病毒都属于猫冠状病毒(FCoV)。FCoVs是属于Alphacoronavirus冠状病毒物种的一部分，主要由核衣壳(N)蛋白、跨膜(M)蛋白和(S)蛋白组成。FCoV根据其刺突蛋白的氨基酸序列分为I型和II型。这些类型中的每一种都由两种病毒组成：引起FIP的FIP病毒(FIPV)和非引起FIP的猫肠道冠状病毒(FECV)。同一类型的FIPV和FECV无法通过抗原性或基因水平来区分，仅在对猫的致病性上有所不同。因此，FCoV中存在I型和II型FECV和FIPV。FECV在猫中是无症状的，但FIPV感染会诱发猫传染性腹膜炎(FIP)。FIP是一种免疫介导且难以治疗的病毒感染，死亡率达到100％。最近报道了几种用于FIP治疗的有效抗病毒药物，如GS441524及GC376，但价格昂贵，亟需开发新的抗猫传腹药物。
11-羰基-β-乙酰乳香酸是乳香树脂中提取得五环三萜类化合物，是乳香提取物中的抗炎抗氧化活性最强的成分之一，安全无毒副作用。11-羰基-β-乙酰乳香酸结构式如下：
Figure BDA0003797967940000011
已有国外文献报道乳香提取物具有抗胃溃疡效果。但是其具体机制及主要药效物质则罕有研究。其主要研究集中于抗炎效果，例如抗肠炎、骨关节炎、类风湿性关节炎等。前期研究发现，11-羰基-β-乙酰乳香酸(AKBA)作为乳香酸中的一种主要物质，可通过Nrf2/HO-1调节抗氧化从而达到脑保护效果。此外，通过生物信息分析及分子对接模拟，11-羰基-β-乙酰乳香酸对RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)和主要的蛋白酶(Mpro)复合物表现出微摩尔的结合亲和力，同时与SARS-COV-2病毒的S蛋白和N蛋白有较低的结合能。
查阅相关资料可知，目前仍未见11-羰基-β-乙酰乳香酸在猫传染性腹膜炎病毒方面的相关报道。因此，将11-羰基-β-乙酰乳香酸引入抑制猫传染性腹膜炎病毒中，具有重大现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供11-羰基-β-乙酰乳香酸在制备治疗猫传腹药物中的用途，以解决上述现有技术存在的问题，本发明将11-羰基-β-乙酰乳香酸引入到抑制猫传染性腹膜炎病毒的应用中，采用间接免疫荧光、TCID50、Western Blot等方法验证了其可以有效抑制猫传染性腹膜炎病毒。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供11-羰基-β-乙酰乳香酸在制备治疗猫传染性腹膜炎的药物中的应用。
本发明还提供11-羰基-β-乙酰乳香酸在制备抑制猫传染性腹膜炎病毒的药物中的应用。
本发明还提供一种治疗猫传染性腹膜炎的药物，有效成分包括11-羰基-β-乙酰乳香酸。
本发明还提供一种抑制猫传染性腹膜炎病毒的药物，有效成分包括11-羰基-β-乙酰乳香酸。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过间接免疫荧光、Western Blot检测猫传染性腹膜炎病毒N蛋白表达量的变化，TCID50检测猫传染性腹膜炎病毒量滴度变化，表明11-羰基-β-乙酰乳香酸具有明显的抗猫传染性腹膜炎病毒的作用，随药物浓度增加，对猫传染性腹膜炎病毒抑制作用增强，最低有效浓度为3.978μM。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为11-羰基-β-乙酰乳香酸在细胞水平对病毒的抑制效果；其中，A为细胞对照，B为猫杯状感染CCL-9424h后病变图片，C为将11-羰基-β-乙酰乳香酸加入感染细胞后细胞感染图片，A、B和C中的标尺均为400μm；
图2为11-羰基-β-乙酰乳香酸对细胞毒性作用的CC50的测定；
图3为11-羰基-β-乙酰乳香酸抗病毒活性TCID50的测定；
图4为11-羰基-β-乙酰乳香酸间接免疫荧光检测结果；其中，FIPV-QS infectedCRFK为猫传染性腹膜炎重组病毒感染猫肾细胞，CRFK为猫肾细胞对照；图中标尺均为400μm；
图5为11-羰基-β-乙酰乳香酸抗病毒活性EC50的测定结果；
图6为11-羰基-β-乙酰乳香酸抗病毒活性Western Blot鉴定。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中的病毒为猫传染性腹膜炎S蛋白替换株病毒rQS-79，构建方法参考文献“Wang Gang et al.Establishment of Full-length cDNA Clones and anEfficient Oral Infection Model for Feline Coronavirus in Cats.[J].Journal ofvirology,2021,:JVI0074521-JVI0074521”；猫肾细胞(CCL-94)来源于ATCC购买。
实施例1 11-羰基-β-乙酰乳香酸对细胞活性的检测
1)取生长状态良好的CRFK细胞进行消化传代，用细胞生长液调整细胞密度为1×105/mL，接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃、5％CO2培养箱培养14h；
2)14h后，取出96孔板，弃去孔中培养基，用无菌PBS清洗三次；
3)将11-羰基-β-乙酰乳香酸用细胞维持液稀释成25μM、12.5μM、6.26μM、3.125μM、1.5625μM、和0.78125μM，然后依次加入到CRFK细胞中，并用一纵列加入100μL细胞维持液做为对照。
4)48h后，用MTS试剂进行细胞活力检测。
如图1所示，镜下可以观察到正常的CRFK细胞生长状态良好，形态完整，界限清晰。而用病毒接种感染的CRFK细胞，3天后出现典型“膜融合”病变，可见细胞核聚集，病变非常明显。用11-羰基-β-乙酰乳香酸和病毒同时处理细胞后，细胞界病变膜融合明显减少，细胞生长较好。
测定细胞存活率能反应11-羰基-β-乙酰乳香酸对细胞的毒性作用，根据公式计算出细胞存活率(％)＝经过化合物处理的细胞发光值平均值/细胞对照组发光值平均值。11-羰基-β-乙酰乳香酸对CRFK细胞的毒性作用较小，其CC50大于100μM(图2)。
半最大效应浓度(EC50)能反应11-羰基-β-乙酰乳香酸对病毒的抑制效果，即能达到50％最大生物效应(抑制病毒)对应的药物浓度。从图5的EC50曲线图可知11-羰基-β-乙酰乳香酸对猫传染性腹膜炎病毒的治疗效果很好，EC50的具体数值为3.258μM。
实施例2 11-羰基-β-乙酰乳香酸对病毒活性TCID50的测定
1)将CRFK细胞进行消化传代，用细胞生长液调整细胞密度为1×105/mL，接种12孔板1mL/孔，37℃、5％CO2培养箱培养14h；
2)14h后，取出12孔板，做好标记，分别为5μM、12.5μM、6.26μM、3.125μM、1.5625μM、和0.78125μM。准备EP管，加入细胞维持液与11-羰基-β-乙酰乳香酸，使其终浓度为上述8个浓度，振荡器上混匀至少5s；
3)弃去12孔板孔中培养基，用无菌PBS清洗三次，甩干后加入已经稀释好的11-羰基-β-乙酰乳香酸。置于37℃、5％CO2培养箱孵育1h；
4)1h后，取出12孔板，每孔接种0.01MOI的病毒，轻晃12孔板混匀，每块12孔板设置病毒对照与细胞对照。于37℃、5％CO2培养箱培养；
5)约48h后，病毒对照出现70％病变，将12孔板转移至-80℃超低温冰箱冻融一次；
6)收集每孔液体至EP管中，4000rpm离心10min后收集上清测毒价。
7)准备生长状态良好的细胞，待长到80％左右后用胰酶消化，铺到96孔板中。
8)待96孔板中的细胞长到80％左右时，将病毒在灭菌的2mLEP管中进行10倍倍比稀释(首次用10-1到10-12)，每孔病毒悬液量为100μL，每个稀释度作8孔，并做好对照孔。
9)操作需在冰上进行，保证毒价的稳定，并且要震荡均匀，防止病毒聚团，导致测出的毒价偏差较大。
10)平稳地将96板移至含有5％CO2，37℃细胞培养箱。
11)48h后观察结果，取出96孔板在显微镜上看细胞病变，并记录结果。
12)按Reed和Muench两氏法计算病毒TCID50。
TCID50检测(图3)11-羰基-β-乙酰乳香酸在20μM、10μM、6.25μM、5μM、2.5μM、1.25μM和0时μM的TCID50分别为10-1.11/mL、10-2.47/mL、10-3.75/mL、10-6.63/mL、10-7.33/mL、10-7.45/mL。如图3所示在6.25μM可以下降1.3个滴度，大于25μM时病毒的毒价已经检测不出。
实施例3 11-羰基-β-乙酰乳香酸对病毒活性的间接免疫荧光检测
1)取生长状态良好的CRFK细胞进行消化传代，用细胞生长液调整细胞密度为1×105/mL，接种于96孔板100μL/孔，置于37℃、5％CO2培养箱培养12h；
2)12h后细胞长满单层，取出96孔板用无血清DMEM培养基清洗两遍，换成细胞维持液，加入11-羰基-β-乙酰乳香酸进行2倍倍比稀释，同时加入0.01MOI病毒液，使11-羰基-β-乙酰乳香酸终浓度为25μM、12.5μM、6.26μM、3.125μM、1.5625μM、和0.78125μM，同时设置病毒对照组和细胞对照组；
3)待细胞出现60％病变，弃掉孔中培养基，用PBS清洗2遍后加入4％多聚甲醛室温作用10min；
4)弃掉废液，用PBS洗2次后加入含1％BSA的PBST的封闭液，在37℃静置作用1h；
5)PBS洗2次后加入1:1000稀释的一抗(FIPVN蛋白兔多克隆抗体)，37℃静置作用1h；
6)PBST洗4次后加入1：2000加入羊抗兔荧光二抗，37℃避光静置作用1h；
7)弃掉二抗，用PBS洗4次，置于荧光显微镜下观察拍照。
间接免疫荧光检测(图4)可以看出11-羰基-β-乙酰乳香酸在25μM时，基本没检测到猫传染性腹膜炎病毒。随着药物浓度的下降，检测到的猫传染性腹膜炎病毒不断增加，在0.78125μM时，可以在细胞中检测到大量的猫传染性腹膜炎病毒。
实施例4 11-羰基-β-乙酰乳香酸对病毒活性WesternBlot的测定
1)将不同浓度11-羰基-β-乙酰乳香酸(10μM、6.25μM、5μM、2.5μM、1.25μM和0时μM)与0.01MOI病毒共同加入细胞中，待细胞病变约70％，先弃掉细胞培养液，用预冷的PBS洗一次细胞，吸干PBS后，再用1mL(6孔板)的PBS重悬细胞，装入2mL的EP管中；
2)4℃4000r/min离心5min，弃掉上清，加入120μL(6孔板)的细胞裂解液，重悬，在4℃旋转作用25min；
3)4℃12000r/min离心20min，收集上清，加入5×loadingbuffer，沸水中煮10min后冰上10min，4℃保存；
4)制备12％分离胶，混匀后加入玻璃板中，并在分离胶上加入一层去离子水，置于通风橱中室温放置30min左右；
5)待分离胶完全聚合后，将配置好的5％的浓缩胶加入分离胶之上，插入梳子，于通风橱中室温放置30min左右；
6)将配制好的聚丙烯酰胺凝胶置于垂直电泳槽中，往中间槽及外槽加入1×SDS-PAGE电泳缓冲液，于点样孔中加入适量体积的处理好的蛋白样品和蛋白Marker；
7)接上电源80V30mim，再120V 1h20min进行电泳；
8)转膜：SDS-PAGE电泳结束后，根据目的蛋白的分子量，以蛋白Marker为对照进行切胶，并裁剪合适大小的滤纸和PVDF膜。将切好的滤纸放入电转缓冲液中，将切好的PVDF膜放入甲醇中浸泡，然后分别放入纯水和电转缓冲液中浸泡，放入转膜槽中以120V电压转膜，根据蛋白大小，转膜时间60min；
9)封闭：轻轻用镊子将膜转入一个干净的平皿内，加入适量的封闭液(5％脱脂牛奶)，置于摇床温育2h；
10)一抗孵育：将膜用TBST涮洗一下，放入含事先稀释好一抗的平皿中，于室温摇床上孵育2.5h；
11)二抗孵育：将膜用TBST洗3次，每次15min，然后将膜放入含事先稀释好二抗的平皿中，于室温摇床上孵育2h，孵育完后将膜用TBST洗六遍，每次5min；
12)显色：将A液和B液等体积混匀，于显色仪器中显色；显色拍照后用TBST将膜清洗六遍，每次5min。同样方法孵育GAPDH一抗与羊抗兔二抗，显色后拍照保存。
Western blot检测(图6)可以看出随着药物浓度增加，细胞中检测到的病毒蛋白量不断减少，有明显剂量依耐性。在10μM药物浓度下，基本检测不到病毒蛋白。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.11-羰基-β-乙酰乳香酸在制备治疗猫传染性腹膜炎的药物中的应用。
2.11-羰基-β-乙酰乳香酸在制备抑制猫传染性腹膜炎病毒的药物中的应用。
3.一种治疗猫传染性腹膜炎的药物，其特征在于，有效成分包括11-羰基-β-乙酰乳香酸。
4.一种抑制猫传染性腹膜炎病毒的药物，其特征在于，有效成分包括11-羰基-β-乙酰乳香酸。
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