CN100537753C - 鸡肾型传染性支气管炎hn99株病毒 - Google Patents
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Abstract
鸡肾型传染性支气管炎HN99株病毒,在电镜下见有冠状病毒粒子,直径90~105nm,有囊膜,周围有长约18nm的梨状突出,呈放射状排列;病毒分离物对NDV La Sota株病毒的繁殖产生干扰;病毒分离物对1%鸡红细胞不产生凝集;回归SPF鸡试验可出现呼吸道症状和肾肿、花斑肾等病变;特异性血清中和结果证明,病鸡的病毒分离物与HN99阳性血清呈阳性反应,而与NDV La Sota株、IBDV B87株、AIV H9N2株均呈阴性反应;HN99株阳性血清与T株、湖北株、天津株和山东株呈阳性反应,与其他株病毒均呈阴性反应。该毒株无外源病原污染,有较好的免疫原性,是一株效果良好的病毒株。
Description
技术领域
本发明涉及一种家禽传染性病毒,尤其涉及一种鸡肾型传染性支气管炎病毒。
背景技术
1999年,河南省荥阳某养鸡场爆发以呼吸道症状为临床特征、以肾脏肿胀、尿酸盐沉积为解剖特征的传染病,从鸡群典型病例的肾脏和输尿管中分离到一株病毒,代号为HN99株。通过SPF鸡胚传代,SPF雏鸡回归复壮后,测定其EID50为10-6.40/0.1ml;我们对发病鸡的肾脏进行了组织学观察,用电镜观察了该病毒的冠状病毒粒子的形态和大小,进行了生物学特征试验如血凝性、对NDV的干扰试验,测定了对热、酸、化学试剂(氯仿、乙醚等)的敏感程度和其他理化试验。用Holte、Gray和Ausc-T等国际古典肾型病毒株和河南、湖北、北京、天津、哈尔滨等地方毒株等进行了特异性试验和血清中和试验。试验结果证实该病毒株为肾型传染性支气管炎病毒,HN99病毒株与传统的呼吸型传染性支气管炎病毒M41株、H120株、H52株的血清型不同,是一株新的病毒株。用传统的M41株或H120株、H52株制备的疫苗不能预防HN99株病毒所致的肾型传染性支气管炎,只有用HN99株病毒制备的疫苗才能预防肾型传染性支气管炎。
发明内容
本发明目的在于提供一种新型的鸡肾型传染性支气管炎HN99株病毒。
本发明公开了一种新型的鸡肾型传染性支气管炎HN99株病毒,该病毒株于2006年5月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.1729。
该病毒具有以下特征:
(1)、在电镜下见有冠状病毒粒子,直径90~105nm,有囊膜,周围有长约18nm的梨状突出,呈放射状排列;
(2)、发病鸡症状除呼吸道症状外,大部份死鸡均有肾脏肿大、尿酸盐沉积、花斑肾等病变,用10日龄鸡胚接种病毒,并经盲传5代后,可见24~72小时之间死亡的鸡胚均有充血或出血、孵育至第17天的鸡胚有3/5呈现发育小、蜷曲、僵化、尿酸盐沉积;
(3)、病毒分离物对NDV La Sota株病毒的繁殖产生干扰;
(4)、病毒分离物对1%鸡红细胞不产生凝集;
(5)、回归SPF鸡试验可出现呼吸道症状和肾肿、花斑肾等病变;
(6)、特异性血清中和结果证明,病鸡的病毒分离物与HN99阳性血清呈阳性反应,而与NDV La Sota株、IBDV B87株、AIV H9N2株均呈阴性反应;
(7)、将HN99株阳性血清与100个EID50的M41株、Holte株、Gray株、T株和地方分离株湖北株、哈尔滨株、山东株、北京株、上海株、天津株等病毒做血清中和试验,结果显示,HN99株阳性血清与T株、湖北株、天津株和山东株呈阳性反应,与其他株病毒均呈阴性反应;
(8)所述病毒的保藏号为CGMCC No.1729。
本发明所述的鸡传染性支气管炎病毒株于2006年5月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏单位简称:CGMCC,保藏编号:CGMCC No.1729,分类命名:鸡肾型传染性支气管炎病毒,英文名称为Avain nephropathogenic Infectious bronchitis virusHN99 Strain,拉丁文名称为Tarpeia nephrite pulli,保藏单位地址:北京市海淀区中关村北一条13号,邮编:100080。
具体实施方式
本发明采用以下方法进行病毒的分离、培养、鉴定:
(一)、病毒分离培养
无菌采集病鸡肺、肾,称重后按1:5重量比添加灭菌生理盐水研磨,以3000rpm离心15分钟,取上清液,按每毫升加青霉素2000IU、链霉素2000μg,4~8℃作用12小时备用。取上清液尿囊腔接种10日龄SPF胚10个,每胚0.2ml,剔除30小时内死亡的鸡胚。从接种后30小时起,每隔4~6小时观察1次,挑出死亡胚,放2~8℃冷存,至72小时取出所有胚,无菌收取尿囊液,加入青链霉素各1000IU/ml。其余5枚继续孵化5天,观察并记录胚胎病变。如此连续盲传3代,-70℃以下保存,将此病毒液按1:2-3的比例(V/V)加入蔗糖牛奶保护剂,用真空冷冻干燥机进行冻干后,保存于-80℃低温冰箱内保存。
(二)、病毒鉴定
1.电镜检查结果
HN99毒株在电镜下见有冠状病毒粒子,直径90~105nm,有囊膜,周围有长约18nm的梨状突出,呈放射状排列。对照尿囊液未见有上述病毒粒子存在。
2.HN99、HX病毒血凝性试验EID50测定和对NDV的干扰试验
HN99未经胰酶处理的鸡胚分离物对1%的鸡红细胞不发生凝集(HA试验阴性),而HX病毒分离物对1%的鸡红细胞发生凝集,HA为1:4,证明有血凝性的病毒污染,因此舍弃不再做其它试验。
经胰酶处理的HN99鸡胚病毒分离物对1%的鸡红细胞发生凝集,平均凝集价HA为1:2。
经磷酸酯酶C处理后的HN99鸡胚病毒分离物可使1%的鸡红细胞发生凝集,平均凝集价HA为1:4。
病毒分离物的EID50测定将HN99鸡胚病毒尿囊液,测定其EID50,结果为10-6.0~10-7.0/0.1ml。
3.对NDV的干扰试验
对NDV的干扰试验证明,加分离毒HN99的HA为1:128,不加分离毒的HA为1:1024,说明分离毒HN99能抑制NDV La Sota在鸡胚内增殖。该试验结果表明,分离毒HN99符合IBV的生物学特性。
4.理化试验
病毒分离物加入20%的乙醚,在2~8℃处理24小时后接种鸡胚,对鸡胚已无感染力。证明病毒物对乙醚敏感。
向病毒分离物内加入氯仿,使其最终浓度为4.8%,在4℃温度下充分混合30min,接种敏感鸡胚,对鸡胚的EID50仅为10-3.5/0.1ml,比未加氯仿的对照组(EID50为10-6.30/0.1ml)下降约3个滴度,证明病毒分离物对氯仿敏感。
将病毒分离物PH值调至3.0,用敏感鸡胚测定EID50为10-5.5/0.1ml,比对照仅下降10-0.5左右,病毒对鸡胚仍具有一定的感染力,证明病毒分离物对酸有耐受性。
病毒分离物56℃下经30分钟,对敏感鸡胚已无感染力,证明病毒分离物不耐热。
5.动物回归试验
用7日龄SPF鸡10只,用点眼、滴鼻和气管内接种HN99鸡胚病毒尿囊液各0.2ml,接种后观察14日。接种后从第48小时开始,有8只鸡精神欠佳,饮食减少,病鸡出现咳嗽、甩鼻等现象,其中1只鸡死亡。对有症状的鸡进行解剖,可见气管、肺脏有充血病变。病死鸡有肾肿,花斑肾,输尿管内有尿酸盐沉积等症状,对此病死鸡的肾脏作了组织切片,进行组织学观察,见肾脏的主要病变是肾曲管发生颗粒变性、空泡变性和玻璃样变,间质水肿,内有淋巴细胞等浸润,有的肾实质组织坏死,形成大小不等的病灶区。
6.特异性血清中和试验
用HN99抗传染性支气管炎阳性血清分别和病毒分离物HN99、NDV LaSota、IBDV B87、AIV H9N2和M41株病毒用鸡胚进行中和试验,结果仅有病毒分离物HN99与HN99抗传染性支气管炎血清呈现阳性反应,其中和物接种10日龄SPF鸡胚,孵化至144小时后,未发现鸡胚有任何病变,而HN99株病毒液阳性对照的鸡胚有死亡、或发育小、蜷缩、僵化、尿酸盐沉积等症状。NDV La Sota、IBDV B87、AIV H9N2与抗传染性支气管炎呈现阴性反应,其中和物接种SPF鸡胚后胎儿均有充血、出血、水肿、死亡等症状。HA试验表明,NDV La Sota株和AIV H9N2的鸡胚尿囊液均有1:128~512的血凝价,结果如下表:
特异性血清中和试验
将HN99阳性血清与100个EID50的M41株、Holte株、Gray株、T株、湖北株、HB株、BJ株、TJ株、SH株、SD株等病毒液等量混合,在20~25℃条件下中和1小时,接种10日龄SPF鸡胚6个,每胚0.2ml,同时设病毒对照组和正常对照组,在37℃继续孵化,观察至144小时,以试验组至少5/6健活、病毒对照组至少50%出现典型病变或死亡、正常对照组全部健活为标准。结果如下表:
用M41株、T株、HO株、G株、HN99阳性血清作1:8(V/V)稀释,与100个EID50HN99株病毒液等量混合,在20~25℃条件下中和1小时,接种SPF鸡胚6个,每胚0.2ml,同时设病毒对照和正常对照,在37℃继续孵化,观察至144小时,以试验组至少5/6健活、病毒对照组至少50%出现典型病变或死亡、正常对照组全部健活为标准。结果如下表:
本发明采用以下方法对病毒HN99株进行纯化和免疫原性试验:
用鸡胚肾细胞终点稀释法对IBV HN99进行了纯化试验,并将其回归SPF鸡胚,其毒价基本无变化。用该毒株的鸡胚病毒液制成灭活苗,免疫SPF鸡进行免疫原性测定,证明IBV HN99株有较好的免疫原性。
1、SPF鸡胚肾细胞(CEK)的制备
用18日龄的SPF鸡胚,无菌操作取出鸡胚肾脏,用hank’s液洗涤3次,用剪刀剪成小块,加入体积百分比0.25%的胰酶,于37℃水浴消化18~20分钟,弃去胰酶,再用hank’s液洗一次,加入含体积百分比8~10%犊牛血清的1640培养液,用吸管反复吹打细胞后,用4~6层无菌纱布过滤至细胞培养瓶和细胞培养板,于37℃ CO2培养箱培养,待长成良好的单层后接毒。
2、传代与纯化
将HN99株病毒液接种于长成单层的SPF鸡胚肾细胞,置37℃ CO2培养箱继续培养,48小时后细胞逐渐出现病变,如圆缩或拉网变长,至96小时后收毒,反复冻融3次,用此法将HN99株病毒传了4代。将第3代细胞毒作10倍系列稀释,取10-5、10-6、10-7、10-8稀释度分别接种于SPF胚CEK单层,每滴度10个孔。培养96小时后,将最高稀释度有病变的孔扩大培养,测定EID50后进行第二次终点稀释。将第二次终点稀释后得到的细胞病变液接种9~10日龄SPF胚,进行病毒复壮和增殖。
3、HN99株病毒的增殖与鉴定
将纯化的HN99病毒液,接种9~10日龄SPF鸡胚,接种后剔除30小时以前的死胚,30小时后每隔4~6小时观察一次,挑出死亡胚,放2~8℃保存,至72小时挑出所有胚。无菌收取尿囊液,并进行各项生物学特性试验、电镜观察、动物回归病毒试验、理化试验、特异性试验和血清中和试验、无菌检验,选择无菌生长、EID50≤10-6.0/0.1ml、各项试验合乎要求的HN99株病毒尿囊液,分装冻干保存,作为毒种。
将纯化的毒株送美国SPAFA济南试验室,进行了外源病原检测,结果表明,该毒株无外源病原污染。
4、HN99株病毒纯化后的免疫原性试验
将HN99株纯化,选择无菌检验合格、EID50≤10-6.0/0.1ml的HN99株病毒尿囊液,经灭活后加入4%(V/V)的灭菌后的吐温—80,制成水相。然后按水相:油相为1:3(V/V)的比例,用高速组织捣碎机乳化成油乳剂。
将HN99株油乳剂按0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml5组不同的剂量免疫28日龄SPF鸡,每组8只。3周后,免疫鸡和条件相同的4只对照鸡一起,攻击HN99强毒,每鸡气管内注射0.2ml的HN99株病毒尿囊液0.2ml,观察14日,结果如下表。
HN99株不同免疫剂量试验结果
HN99株不同免疫剂量的试验证明,该毒株免疫0.1ml的免疫鸡攻毒后可保护6/8,免疫0.2~0.5ml的免疫鸡攻毒后均可获全保护。对照鸡发病4/4,鸡只出现咳嗽、甩鼻,解剖后有肾肿、支气管、肺脏充血或出血等不同症状。试验表明,HN99株有较好的免疫原性,是一株效果良好的病毒株。
Claims (1)
1、鸡肾型传染性支气管炎病毒(Tarpeia nephrite pulli)HN99,其特征在于,
(1)、在电镜下见有冠状病毒粒子,直径90~105nm,有囊膜,周围有长约18nm的梨状突出,呈放射状排列;
(2)、病毒分离物对NDV La Sota株病毒的繁殖产生干扰;
(3)、病毒分离物对1%鸡红细胞不产生凝集;
(4)、回归SPF鸡试验可出现呼吸道症状和肾肿、花斑肾病变;
(5)、特异性血清中和结果证明,病鸡的病毒分离物与HN99阳性血清呈阳性反应,而与NDV La Sota株、IBDV B87株、AIV H9N2株均呈阴性反应;
(6)、将HN99株阳性血清与EID50的M41株、Holte株、Gray株、T株和地方分离株湖北株、哈尔滨株、山东株、北京株、上海株、天津株病毒做血清中和试验,结果显示,HN99株阳性血清与T株、湖北株、天津株和山东株呈阳性反应,与其他株病毒均呈阴性反应;
(7)所述病毒的保藏号为CGMCC No.1729。
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鸡传染性支气管炎病毒HN99 株S1 基因的克隆与序列测定. 陈红英等.动物医学进展,第25卷第6期. 2004 |
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