CN1548157A

CN1548157A - 抗传染性非典型性肺炎药物作用靶标及其预防和治疗药物

Info

Publication number: CN1548157A
Application number: CNA2003101025652A
Authority: CN
Inventors: 松李; 李松; 肖军海; 胡远东; 敖翼
Original assignee: BEIJING MUOLIKE SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING MUOLIKE SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2003-05-08
Filing date: 2003-10-23
Publication date: 2004-11-24
Anticipated expiration: 2023-10-23
Also published as: CN100478030C

Abstract

本发明涉及一种SARS半胱氨酸蛋白酶SACP作为治疗和/或预防SARS病毒感染药物作用靶标的用途。本发明还涉及反式环氧琥珀酸衍生物作为SACP抑制剂，用于治疗和/或预防SARS病毒感染的新用途。

Description

抗传染性非典型肺炎药物作用靶标及其预防和治疗药物

技术领域

本发明涉及识别抗传染性非典型肺炎(Severe Acute RespiratorySyndrome，SARS)药物作用靶标及其预防和/或治疗药物，识别的药物作用靶标是引起非典型性肺炎的冠状病毒(Coronaviruses)复制、转录、翻译和组装过程中必须的关键蛋白水解酶(SARS cysteineproteinase，SACP)，预防和/或治疗药物是作用在该靶酶SACP上的有机分子化合物或多肽化合物或寡糖化合物或单克隆抗体或核苷类化合物，及含有它们的药物组合物。

背景技术

传染性非典型肺炎称为严重急性呼吸综合征(Severe AcuteRespiratory Sydrome，SARS)。研究发现，一种新型的冠状病毒极可能是病因，但也有可能有其他协同因素如人间质肺炎病毒(humanmetapneumovirus，hMPV)使病情恶化，在香港和加拿大的病人和死亡病人的尸体中都分离出了这种病毒，在一些SARS病人的血清中也发现了抗hMPV的抗体。2003年4月16日，世界卫生组织(WHO)正式确认SARS病毒是传染性非典型肺炎的病因。传染性非典型肺炎病人中94％感染SARS病毒的人能够自愈，致死率约为6％。SARS病人的呼吸道切片和细胞培养物的电子显微镜照片显示，存在冠状病毒颗粒。这是一种新型的冠状病毒，与冠状病毒属中其他已知的成员不同，该病毒可引起绿猴肾细胞(VERO-E6)发生病变效应，病毒复制能够被SARS感染康复人的血清所抑制，可以利用感染的细胞和康复病人的血清进行免疫荧光检测法(Immunofluorescence assays，IFA)检测培养细胞中细胞感染有SARS病毒的情况，该方法表现出特异性的反应。美国、加拿大和香港的研究表明，非SARS病人的血清不能和新冠状病毒发生反应；传染性肠胃炎病毒(TransmissibleGastroenteritis Virus，TGEV)、鼠肝炎病毒(Murine Hepatitis Virus，MHV)、猫传染性腹膜炎病毒(Feline Infectious Peritonitis virus，FIPV)、229E人冠状病毒的超抗血清可以抑制培养的病毒生长。几个实验室对病毒的测序表明，新病毒和冠状病毒属相关，但不同于同属的其它冠状病毒个群，是冠状病毒的一个新的变种。

SARS冠状病毒在种属分类上属于正链RNA病毒(ssRNApositive-strand viruses)家系的巢状病毒(Nidovirales)族中的冠状病毒(Coronaviridae)系。它是冠状病毒家族中新出现的一个子类。2003年3月，科学家们发现了导致SARS的元凶SARS冠状病毒(SARSCoronaviruses，SARS-CoV)，并且成功地完成了SARS-CoV基因组的完整测序。SARS-CoV基因组共有29727个核苷酸、11个开放阅读框(Opening Reading Frames)组成。它的基因组结构和其他的冠状病毒非常相似。但通过比较遗传史和序列比对表明SARS-CoV的特征和以前发现的冠状病毒的特征并不完全相似，它不仅表现有其他冠状病毒共有的特征，还有SARS-CoV本身特有的特征(Rota et al.，Characterization of a Novel Coronavirus Associated with SevereAcute Respiratory Syndrome，Paul A.Published online 1 May 2003；10.1126/science.1085952)。科学家同时进行了SARS相关的冠状病毒加拿大多伦多(Tor2)分离株29751个碱基的基因组测序。基因组序列揭示这个冠状病毒与已知的冠状病毒(包括人类冠状病毒HcoV-OC43，HCoV-229E)无密切相关。预测病毒蛋白的种系分析表明，该冠状病毒与已知的三族冠状病毒均非密切相似。基因组序列将有助于人类了解SARS病毒感染的机制、潜在动物宿主的诊断检测(使用PCR和免疫测试法)，同时也有助于发展抗病毒制剂(包括中和抗体)和找出疫苗抗原决定簇(The Genome Sequence of theSARS-Associated Coronavirus，Marco A.Marra et al.，Publishedonline 1 May 2003；10.1126/science.1085953)。

但迄今为止，人们对SARS-CoV病毒的感染机制研究还很不充分，为降低感染率和死亡率，临床上对能够预防和/或治疗的SARS-CoV感染的特效药物有着十分紧迫的需求。

发明内容

本发明的目的是对SARS-CoV的基因表达产物进行深入的生物信息学分析，识别抗传染性非典型肺炎(Severe Acute RespiratorySyndrome，SARS)药物作用的靶标及其预防和/或治疗药物。

通过运用生物信息学的方法，本发明对SARS-CoV冠状病毒蛋白序列进行了全序列分析，对已测序的11个SARS-CoV BJ01、SARS-CoV BJ02、SARS-CoV BJ03、SARS-CoV BJ04，SARS-CoVCUHK-W1、SARS-CoV GZ01、SARS-CoV HKU-39849、SARS-CoVTaiwan、SARS-CoVTor2、SARS-CoV Urbani和SARS-CoV Vietnam的SARS-CoV冠状病毒的蛋白序列进行多序列比对分析，结果发现SARS-CoV病毒中的一段序列：

1 11 21 31 41 51

| | | | | |

1 SGFRKMAFPS GKVEGCMVQV TCGTTTLNGL WLDDTVYCPR HVICTAEDML NPNYEDLLIR 60

61 KSNHSFLVQA GNVQLRVIGH SMQNCLLRLK VDTSNPKTPK YKFVRIQPGQ TFSVLACYNG 120

121 SPSGVYQCAM RPNHTIKGSF LNGSCGSVGF NIDYDCVSFC YMHHMELPTG VHAGTDLEGK 180

181 FYGPFVDRQT AQAAGTDTTI TLNVLAWLYA AVINGDRWFL NRFTTTLNDF NLVAMKYNYE 240

241 PLTQDHVDIL GPLSAQTGIA VLDMCAALKE LLQNGMNGRT ILGSTILEDE FTPFDVVRQC 300

301 SGVTFQ

在所有的SARS-CoV病毒中高度保守，在所有已测序的11个SARS-CoV冠状病毒中该段序列完全相同。序列比对的结果显示该蛋白没有独立的信号肽，它是从第250位核苷酸开始编码长度为7074个氨基酸的多蛋白(putative orf1ab polyprotein)的一个独立的功能域，该功能域定位在SARS-CoV病毒7074个氨基酸多蛋白的3241氨基酸位至3547氨基酸的位置。本发明将该蛋白定义为SARS半胱氨酸蛋白酶(SARS Cysteine Proteinase，SACP)。该多蛋白和鼠肝炎病毒(murinehepatitis virus)的相应片断具有同源性。

将SARS-CoV冠状病毒的蛋白序列与其他种类的冠状病毒的蛋白序列进行多序列比对分析，对比的序列包括：传染性肠胃炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV)、鼠肝炎病毒(MurineHepatitis Virus，MHeV)、牛冠状病毒(bovine coronavirus，BcoV)，猫传染性腹膜炎病毒(Feline Infectious Peritonitis virus，FIPV)、人冠状病毒229E(human coronavirus 229E，HcoV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)和鸟传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchiyis Virus，AIBV)。对比结果及其同源性如下，序列对比和同源性分析采用的方法为美国国家生物信息中心(NCBI)提供的蛋白序列同源性比对方法(NCBI，BLASTp)。

1、SARS半胱氨酸蛋白酶(SARS Cysteine Proteinase，SACP)对鼠肝炎病毒(Murine Hepatitis Virus，MHeV)，相同序列(Identities)＝154/306(相同性50％)，同源序列(Positives)＝198/306(同源性64％)，序列间隙(Gaps)＝3/306(0％)。

SACP：1 SGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDTVYCPRHVICTAEDMLNPNYEDLLIR 60

SG KM P+ KVE C+V VT G TLNGLWLDD VYCPRHVIC++ DM +P+Y +LL R

MHeV：1 SGIVKMVSPTSKVEPCIVSVTYGNMTLNGLWLDDKVYCPRHVICSSADMTDPDYPNLLCR 60

SACP：61 KSNHSFLVQAGNVQLRVIGHSMQNCLLRLKVDTSNPKTPKYKFVRIQPGQTFSVLACYNG 120

++ F V +G +L V+ + MQ C L L V NP TPKY F ++PG+TF+VLA YNG

MHeV：61 VTSSDFCVMSGRMSLTVMSYQMQGCQLVLTVTLQNPNTPKYSFGVVKPGETFTVLAAYNG 120

SACP：121 SPSGVYQCAMRPNHTIKGSFLNGSCGSVGFNIDYDCVSFCYMHHMELPTGVHAGTDLEGK 180

P G + +R +HTIKGSFL GSCGSVG+ +D V F YMH +EL TG H GTD G

MHeV：121 RPQGAFHVTLRSSHTIKGSFLCGSCGSVGYVLTGDSVRFVYMHQLELSTGCHTGTDFSGN 180

SACP：181 FYGPFVDRQTAQAAGTDTTITLNVLAWLYAAVINGDRWFLNRFTTTLNDFNLVAMKYNYE 240

FYGP +D Q Q D T T+NV+AWLYAA+ N WF+ + +L +FN +AM +

MHeV：181 FYGPYRDAQVVQLPVQDYTQTVNVVAWLYAAIFNRCNWFVQSDSCSLEEFNVWAMTNGFS 240

SACP：241 PLTQDHVDILGPLSAQTGIAVLDMCAALKELLQNGMNGRTILGSTILEDEFTPFDVVRQC 300

+ D V L L++ TG +V + AA+K L +G G+ ILGS +LEDE TP DV +Q

MHeV：241 SIKADLV--LDALASMTGVTVEQVLAAIKR-LHSGFQGKQILGSCVLEDELTPSDVYQQL 297

SACP：301 SGVTFQ 306

+GV Q

MHeV：298 AGVKLQ 303

2、SARS半胱氨酸蛋白酶(SARS Cysteine Proteinase，SACP)对牛冠状病毒(bovine coronavirus，BcoV)，相同序列(Identities)＝149/306(相同性48％)，同源序列(Positives)＝196/306(同源性64％)，序列间隙(Gaps)＝3/306(0％)。

SACP：1 SGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDTVYCPRHVICTAEDMLNPNYEDLLIR 60

SG KM P+ KVE C+V VT G TLNGLWLDD VYCPRHVIC+A DM NP+Y +LL R

BcoV：3247 SGIVKMVNPTSKVEPCIVSVTYGNMTLNGLWLDDKVYCPRHVICSASDMTNPDYTNLLCR 3306

SACP：61 KSNHSFLVQAGNVQLRVIGHSMQNCLLRLKVDTSNPKTPKYKFVRIQPGQTFSVLACYNG 120

++ F V + L V+ + MQ C+L L V N +TPKY F ++PG+TF+VLA YNG

BcoV：3307 VTSSDFTVLFDRLSLTVMSYQMQGCMLVLTVTLQNSRTPKYTFGVVKPGETFTVLAAYNG 3366

SACP：121 SPSGVYQCAMRPNHTIKGSFLNGSCGSVGFNIDYDCVSFCYMHHMELPTGVHAGTDLEGK 180

P G + MR ++TIKGSFL GSCGSVG+ I DCV F YMH +EL TG H GTD G

BcoV：3367 KPQGAFHVTMRSSYTIKGSFLCGSCGSVGYVIMGDCVKFVYMHQLELSTGCHTGTDFNGD 3426

SACP：181 FYGPFVDRQTAQAAGTDTTITLNVLAWLYAAVINGDRWFLNRFTTTLNDFNLVAMKYNYE 240

FYGP+ D Q Q D ++N +AWLYAA++N WF+ ++ DFN+ A+ +

BcoV：3427 FYGPYKDAQVVQLPVQDYIQSVNFVAWLYAAILNNCNWFVQSDKCSVEDFNVWALSNGFS 3486

SACP：241 PLTQDHVDILGPLSAQTGIAVLDMCAALKELLQNGMNGRTILGSTILEDEFTPFDVVRQC 300

+ D V + L++ TG+++ + AA+K L+NG GR I+GS EDE TP DV +Q

BcoV：3487 QVKSDLV--IDALASMTGVSLETLLAAIKR-LKNGFQGRQIMGSCSFEDELTPSDVYQQL 3543

SACP：301 SGVTFQ 306

+G+ Q

BcoV：3544 AGIKLQ 3549

3、SARS半胱氨酸蛋白酶(SARS Cysteine Proteinase，SACP)对猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)，相同序列(Identities)＝137/306(相同性44％)，同源序列(Positives)＝199/306(同源性64％)，序列间隙(Gaps)＝6/306(1％)。

SACP：1 SGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDTVYCPRHVICTA-EDMLNPNYEDLLI 59

+G RKMA PSG VE C+V+V G LNGLWL D V CPRHVI ++ ++ +Y ++

REDV：2998 AGLRKMAQPSGVVEKCIVRVCYGNMALNGLWLGDIVMCPRHVIASSTTSTIDYDYALSVL 3057

SACP：60 RKSNHSFLVQAGNVQLRVIGHSMQNCLLRLKVDTSNPKTPKYKFVRIQPGQTFSVLACYN 119

R H+F + +GNV L V+ +M+ LL++KV+ +N TPKY + ++PG++F++LACY+

PEDV：3058 RL--HNFSISSGNVFLGVVSATMRGALLQIKVNQNNVHTPKYTYRTVRPGESFNILACYD 3115

SACP：120 GSPSGVYQCAMRPNHTIKGSFLNGSCGSVGFNIDYDCVSFCYMHHMELPTGVHAGTDLEG 179

G+ +GVY MR N+TI+GSF+NG+CGS G+NI+ V FCY+H +EL +G H G+DL+G

PEDV：3116 GAAAGVYGVNMRSNYTIRGSFINGACGSPGYNINNGTVEFCYLHQLELGSGCHVGSDLDG 3175

SACP：180 KFYGPFVDRQTAQAAGTDTTITLNVLAWLYAAVINGDRWFLNRFTTTLNDFNLVAMKYNY 239

YG + D+ T Q G + T NVLA+LYAA+ING W+L+ ++ FN A+

PEDV：3176 VMYGGYEDQPTLQVEGASSLFTENVLAFLYAALINGSTWWLSSSRIAVDRFNEWAVHNGM 3235

SACP：240 EPLTQDHVDILGPLSAQTGIAVLDMCAALKELLQNGMNGRTILGSTILEDEFTPFDVVRQ 299

T + D L+A+TG+ V + A+++ L +N G+ ILG T L DEFT +VVRQ

PEDV：3236 T--TVGNTDCFSILAAKTGVDVQRLLASIQSLHKN-FGGKQILGHTSLTDEFTTGEVVRQ 3292

SACP：300 CSGVTFQ 306

GV Q

PEDV：3293 MYGVNLQ 3299

4、SARS半胱氨酸蛋白酶(SARS Cysteine Proteinase，SACP)对传染性肠胃炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV)，相同序列(Identities)＝134/306(相同性43％)，同源序列(Positives)＝186/306(同源性60％)，序列间隙(Gaps)＝4/306(1％)。

SACP：1 SGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDTVYCPRHVICTAEDMLNPNYEDLLIR 60

SG RKMA PSG VE C+V+V+ G LNGLWL D V CPRHVI + + NYE+ +

TGEV：2879 SGLRKMAQPSGLVEPCIVRVSYGNNVLNGLWLGDEVICPRHVIASDTTRV-INYENEMSS 2937

SACP：61 KSNHSFLVQAGNVQLRVIGHSMQNCLLRLKVDTSNPKTPKYKFVRIQPGQTFSVLACYNG 120

H+F V NV L V+ + L LKV+ NP TP++KF I+ G++F++LACY G

TGEV：2938 VRLHNFSVSKNNVFLGVVSARYKGVNLVLKVNQVNPNTPEHKFKSIKAGESFNILACYEG 2997

SACP：121 SPSGVYQCAMRPNHTIKGSFLNGSCGSVGFNIDYDCVSFCYMHHMELPTGVHAGTDLEGK 180

P VY MR TIKGSF+ G+CGSVG+ ++ + F YMHH+EL G H G++ EG+

TGEV：2998 CPGSVYGVNMRSQGTIKGSFIAGTCGSVGYVLENGILYFVYMHHLELGNGSHVGSNFEGE 3057

SACP：181 FYGPFVDRQTAQAAGTDTTITLNVLAWLYAAVINGDRWFLNRFTTTLNDFNLVAMKYNYE 240

YG + D+ + Q GT+ + NV+A+LYAA+ING+RWF+ + +L +N A ++

TGEV：3058 MYGGYEDQPSMQLEGTNVMSSDNVVAFLYAALINGERWFVTNTSMSLESYNTWAKTNSFT 3117

SACP：241 PLTQDHVDILGPLSAQTGIAVLDMCAALKELLQNGMNGRTILGSTILEDEFTPFDVVRQC 300

L+ D L+A+TG +V + ++ L G GRTIL L DEFTP +V+RQ

TGEV：3118 ELSS--TDAFSMLAAKTGQSVEKLLDSIVR-LNKGFGGRTILSYGSLCDEFTPTEVIRQM 3174

SACP：301 SGVTFQ 306

GV Q

TGEV：3175 YGVNLQ 3180

5、SARS半胱氨酸蛋白酶(SARS Cysteine Proteinase，SACP)对猫传染性腹膜炎病毒(Feline Infectious Peritonitis virus，FIPV)，相同序列(Identities)＝134/306(相同性43％)，同源序列(Positives)＝184/306(同源生60％)，序列间隙(Gaps)＝4/306(1％)。

SACP：1 SGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDTVYCPRHVICTAEDMLNPNYEDLLIR 60

SG RKMA PSG VE C+V+V G LNGLWL D V CPRHVI + + NYE+L

FIPV：11 SGLRKMAQPSGVVEPCIVRVAYGNNVLNGLWLGDEVICPRHVIASDTSRV-INYENELSS 69

SACP：61 KSNHSFLVQAGNVQLRVIGHSMQNCLLRLKVDTSNPKTPKYKFVRIQPGQTFSVLACYNG 120

H+F + N L V+ + L LKV+ NP TP++KF ++PG++F++LACY G

FIPV：70 VRLHNFSIAKNNAFLGVVSAKYKGVNLVLKVNQVNPNTPEHKFKSVRPGESFNILACYEG 129

SACP：121 SPSGVYQCAMRPNHTIKGSFLNGSCGSVGFNIDYDCVSFCYMHHMELPTGVHAGTDLEGK 180

P VY MR TIKGSF+ G+CGSVG+ ++ + F YMHH+EL G H G++LEG+

FIPV：130 CPGSVYGVNMRSQGTIKGSFIAGTCGSVGYVLENGTLYFVYMHHLELGNGSHVGSNLEGE 189

SACP：181 FYGPFVDRQTAQAAGTDTTITLNVLAWLYAAVINGDRWFLNRFTTTLNDFNLVAMKYNYE 240

YG + D+ + Q GT+ + NV+A+LYAA+ING+RWF+ + TL +N A ++

FIPV：190 MYGGYEDQPSMQLEGTNVMSSDNVVAFLYAALINGERWFVTNTSMTLESYNAWAKTNSFT 249

SACP：241 PLTQDHVDILGPLSAQTGIAVLDMCAALKELLQNGMNGRTILGSTILEDEFTPFDVVRQC 300

+ D L+A+TG +V + + L G GRTIL L DEFTP +V+RQ

FIPV：250 EIVS--TDAFNMLAAKTGYSVEKLLECIVR-LNKGFGGRTILSYGSLCDEFTPTEVIRQM 306

SACP：301 SGVTFQ 306

GV Q

FIPV：307 YGVNLQ 312

6、SARS半胱氨酸蛋白酶(SARS Cysteine Proteinase，SACP)对人冠状病毒229E(human coronavirus 229E，HcoV)，相同序列(Identities)＝124/306(相同性40％)，同源序列(Positives)＝186/306(同源性60％)，序列间隙(Gaps)＝6/306(1％)。

SACP：1 SGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDTVYCPRHVICT-AEDMLNPNYEDLLI 59

+G RKMA PSG VE C+V+V G T LNGLWL D VYCPRHVI + ++ ++E ++

HcoV：2966 AGLRKMAQPSGFVEKCVVRVCYGNTVLNGLWLGDIVYCPRHVIASNTTSAIDYDHEYSIM 3025

SACP：60 RKSNHSFLVQAGNVQLRVIGHSMQNCLLRLKVDTSNPKTPKYKFVRIQPGQTFSVLACYN 119

R H+F + +G L V+G +M L++KV +N TP++ F ++ G+ F++LACY+

HcoV：3026 RL--HNFSIISGTAFLGVVGATMHGVTLKIKVSQTNMHTPRHSFRTLKSGEGFNILACYD 3083

SACP：120 GSPSGVYQCAMRPNHTIKGSFLNGSCGSVGFNIDYDCVSFCYMHHMELPTGVHAGTDLEG 179

G GV+ MR N TI+GSF+NG+CGS G+N+ V F YMH+EL +G H G+ +G

HcoV：3084 GCAQGVFGVNMRTNWTIRGSFINGACGSPGYNLKNGEVEFVYMHQIELGSGSHVGSSFDG 3143

SACP：180 KFYGPFVDRQTAQAAGTDTTITLNVLAWLYAAVINGDRWFLNRFTTTLNDFNLVAMKYNY 239

YG F D+ Q + +T+NV+A+LYAA++NG W+L + +N A +

HcoV：3144 VMYGGFEDQPNLQVESANQMLTVNVVAFLYAAILNGCTWWLKGEKLFVEHYNEWAQANGF 3203

SACP：240 EPLTQDHVDILGPLSAQTGIAVLDMCAALKELLQNGMNGRTILGSTILEDEFTPFDVVRQ 299

+ + D L+A+TG+ V + A+ ++L NG G+ ILG + L DEF+ +VV+Q

HcoV：3204 TAMNGE--DAFSILAAKTGVCVERLLHAI-QVLNNGFGGKQILGYSSLNDEFSINEVVKQ 3260

SACP：300 CSGVTFQ 306

GV Q

HcoV：3261 MFGVNLQ 3267

7.SARS半胱氨酸蛋白酶(SARS Cysteine Proteinase，SACP)对鸟传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchiyis Virus，AIBV)，相同序列(Identities)＝127/316(相同性40％)，同源序列(Positives)＝179/316(同源性56％)，序列间隙(Gaps)＝19/316(6％)。

SACP：1 SGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDTVYCPRHVICTAEDMLNPNYEDLLIR 60

+GF+K+A PS VE C+V V+ LNGLWL D++YCPRHV+ ++D+L

AIBV：2799 AGFKKLAAPSSAVEKCIVSVSYRGNNLNGLWLGDSIYCPRHVL---GKFSGDQWDDVLNL 2855

SACP：61 KSNHSFLVQAGN-VQLRVIGHSMQNCLLRLKVDTSNPKTPKYKFVRIQPGQTFSVLACYN 119

+NH F V GN V L V+ ++ +L L+ +N +TPKYKF++ G +F++ Y

AIBV：2856 ANNHEFEVVTGNGVTLAVVSRRLRGAVLILQTAIANAETPKYKFMKANCGDSFTIACSYG 2915

SACP：120 GSPSGVYQCAMRPNHTIKGSFLNGSCGSVGFNIDYDCVSFCYMHHMELPTGVHAGTDLEG 179

G+ G+Y MR N TI+ SFL G+CGSVGFNI+ V+F YMHH+ELP +H GTDL G

AIBV：2916 GTVIGLYPVTMRSNGTIRASFLAGACGSVGFNIERGVVNFYYMHHLELPNALHTGTDLNG 2975

SACP：180 KFYGPFVDRQTAQAAGTDTTITLNVLAWLYAAVI-------NGDRWFLNRFTTTLNDFNL 232

FYG VD + AQ D +T N++AWLYAA+I + +W L T +++D+N

AIBV：2976 AFYGGCVDEEVAQRVPPDNLVTNNIVAWLYAAIISVKESSFSTPKW-LESTTVSVDDYNK 3034

SACP：233 VAMKYNYEPLTQDHVDILGPLSAQTGIAVLDMCAALKELL--QNGMNGRTILGSTILEDE 290

A + P + + LSA TG +D+C L+ ++ + ILG EDE

AIBV：3035 WAGDNGFTPFSTSTA--ITKLSAITGV---DVCKLLRTIMVKSSQWGNEPILGQYNFEDE 3089

SACP：291 FTPFDVVRQCSGVTFQ 306

TP V Q GV Q

AIBV：3090 LTPESVFNQVGGVRLQ 3105

通过这些序列对比和同源性分析发现各序列与SARS半胱氨酸蛋白酶(SARS Cysteine Proteinase，SACP)的同源性很高，序列相同性均大于40％、同源性均大于55％、序列间隙均小于6％，提示这些序列代表的蛋白在病毒复制过程中执行相似的功能。

通过序列对比和同源性分析发现与SARS半胱氨酸蛋白酶SACP同源的序列在种属分类上属于正链RNA病毒(ssRNA positive-strandviruses)家系的巢状病毒(Nidovirales)族中的冠状病毒(Coronaviridae)系。序列同源性比对没有发现其它族系的蛋白与SACP蛋白的同源性超过10％。表明这些蛋白是巢状病毒(Nidovirales)族中特有的关键蛋白。

根据John Ziebuhr等人(John Ziebuhr et al.，Virus-encodedproteinases and proteolytic processing in the Nidovirales.J Gen Virol.2000，81：853-79.)对Nidovirales族中的冠状病毒(Coronaviridae)系包括传染性肠胃炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV)、鼠肝炎病毒(Murine Hepatitis Virus，MHeV)、牛冠状病毒(bovinecoronavirus，BcoV)，猫传染性腹膜炎病毒(Feline Infectious Peritonitisvirus，FIPV)、人冠状病毒229E(human coronavirus 229E，HcoV)和鸟传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchiyis Virus，AIBV)的分析结果，与SACP蛋白同源的序列属于半胱氨酸蛋白酶(CysteineProteinase，也称为3C-like Proteinase)。

在冠状病毒族系中半胱氨酸蛋白酶的功能为：该蛋白酶是冠状病毒基因组编码表达的一类特有的蛋白，和其它非冠状病毒及细胞表达的同类蛋白酶相比同源性和相似性都极低。它与冠状病毒RNA复制酶的合成有着极其紧密的联系，其突出特征是在成熟的病毒颗粒中并没有RNA聚合酶存在，而是在病毒侵入宿主细胞之后才合成。在侵入宿主细胞后，冠状病毒首先由占其基因组近三分之二的开放阅读框表达RNA复制酶前体，该前体含有约7200个氨基酸，进而在病毒自身编码表达的半胱氨酸蛋白酶的作用下列解成十多个具有功能蛋白，在这些蛋白的调控下冠状病毒完成自身的复制、转录、翻译和组装。因此冠状病毒的半胱氨酸蛋白酶对病毒的复制、转录、翻译和组装都起着至关重要的作用。

根据序列比对结果和SARS半胱氨酸蛋白酶(SARS CysteineProteinase，SACP)同源冠状病毒族系中其它蛋白水解酶功能的提示，本发明对SARS半胱氨酸蛋白酶SACP的功能做出认定，SARS半胱氨酸水解蛋白酶SACP是一个含306个氨基酸残基的蛋白，其中羧基端的约110个残基对其催化水解功能有重要的影响。其催化水解活性位点与其它冠状病毒族系的半胱氨酸蛋白酶区别在于缺少高度保守的催化三联体His，Asp(或Glu)，Cys中的酸性残基Asp(或Glu)，在SARS半胱氨酸水解蛋白酶中His为催化位点提供碱性基团，Cys为催化位点提供亲核基团。其底物结合区与其它冠状病毒族系的半胱氨酸蛋白酶相似，但作为底物结合中催化核心的三联体：由Gly-X-His变为Tyr-X-His，其中His是必不可少的残基，该位点的变异将导致活性的丧失。

在认定SARS半胱氨酸蛋白酶SACP功能的基础上，本发明采用二级结构预测和同源模建的方法建立了SARS半胱氨酸蛋白酶SACP的二级结构和三维空间结构。

二级结构预测采用Rost等人发展的神经网络方法(Rost B，predicting one-dimensional protein structure by profile-based neuralnetworks.Methods Enzymol 1996；266：525-39)预测结果见附图1。预测结果显示SARS半胱氨酸蛋白酶结构为α螺旋加β片层结构。

三维空间结构的建立使用Clustal X序列对比软件版本1.81提供的方法进行序列搜索对比，结果发现传染性肠胃炎病毒TGEV蛋白的A链，三维结构数据库代码为PDB：1LVO与SARS半胱氨酸蛋白酶SACP的序列同源性为46.5％，将二者的序列进行比对(PDB：1LVO A链序列与NCBI：NP_828863.1序列)，识别出两者间序列保守和同源的区域，结果显示在附图2。

用TGEV蛋白A链结构PDB：1LVO A为模板，用同源模建的方法模建SARS半胱氨酸蛋白酶SACP的三维空间结构，结果见附图3。SACP与TGEV蛋白A链的三维结构相似，结构中包含三个功能区，其中包括两个β片层结构富集区D1、D2和一个α螺旋结构富集区D3。在D1和D2间的柔性区域，是SACP的催化活性位点和底物结合区。

本发明发现SARS半胱氨酸蛋白酶SACP中，关键的活性位点为41号组氨酸His41和145号半胱氨酸Cys145，它们之间的硫原子与ε2氮原子间的距离为3.93埃。Asp186、Arg40间的距离为2.53埃，Asp186和Arg40间能生成合理的盐桥。附图4显示的是SACP与TGEV活性位点比较的情况。

SACP的底物结合位点与TGEV相近，二者基本能较好地重合。TGEV底物结合位点由编号为41、47、51、139、160、161、162、163、164、165、166、167、171、186、187、188、189、190等18个氨基酸构成，SACP与TGEV催化活性残基的对比见表1，在SACP结构的β片层结构富集区D1中，与催化活性相关的残基构成第一活性亚单元区(见表1)变异不大，仅有一个位点发生突变，由Ile变为Leu，对SACP的催化水解活性的影响不大。在SACP结构的β片层结构富集区D2中与催化活性相关的残基构成第二活性亚单元区(见表1)发生的变异较明显，6个残基中有4个残基发生了变异(见表1)，但这些变异位点残基侧链均指向与结合区相反的方向，对底物结合位点的几何形状并未产生明显改变。

表1 SACP与TGEV催化活性残基的对比

第一活性亚单元区

残基号 139 140 160 161 162 163 165 171

1LVO F I Y M H H E H

SACP F L Y M H H E H

第二活性亚单元区

残基号 41 47 51 164 188

1LVO H T I L P

SACP H E N M Q

1 11 21 31 41 51

| | | | | |

1 SGFRKMAFPS GKVEGCMVQV TCGTTTLNGL WLDDTVYCPR HVICTAEDML NPNYEDLLIR 60

61 KSNHSFLVQA GNVQLRVIGH SMQNCLLRLK VDTSNPKTPK YKFVRIQPGQ TFSVLACYNG 120

121 SPSGVYQCAM RPNHTIKGSF LNGSCGSVGF NIDYDCVSFC YMHHMELPTG VHAGTDLEGK 180

181 FYGPFVDRQT AQAAGTDTTI TLNVLAWLYA AVINGDRWFL NRFTTTLNDF NLVAMKYNYE 240

241 PLTQDHVDIL GPLSAQTGIA VLDMCAALKE LLQNGMNGRT ILGSTILEDE FTPFDVVRQC 300

301 SGVTFQ

本发明的另一方面涉及半胱氨酸蛋白酶SACP控制病毒的复制过程，阻断SACP催化水解蛋白的功能，可以阻断SARS病毒的复制、转录、翻译和组装，可以用于治疗和/或预防SARS病毒感染的药物研究用途，揭示SARS半胱氨酸蛋白酶SACP是治疗和/或预防SARS病毒感染特效药物的作用靶标。即本发明涉及SACP在筛选预防和/或SARS病毒药物中的用途。

本发明系统的序列对比分析证实没有其它族系蛋白与SACP的同源性超过10％。这表明SACP蛋白是SARS病毒特有的关键催化水解蛋白酶，阻断它的功能不会对感染SARS病毒的人或动物正常的生理过程产生不良影响，揭示基于SARS半胱氨酸蛋白酶SACP这一新靶标，可以研发出高效低毒副作用的特效药物。

根据以上生物信息学试验的结果，本发明确定SARS半胱氨酸蛋白酶SACP是治疗和/或预防SARS病毒感染的药物作用靶标。

靶标是指疾病发生和发展过程中能够在最关键病理环节上起决定作用的关键功能蛋白或功能基因，包括细胞膜受体、蛋白酶、激素与细胞因子、离子通道、DNA、RNA、核受体等。现代药物研究的核心是以药物作用靶标为基础，筛选或设计与靶标结构互补、能够激动或拮抗靶标介导的生物功能，具有治疗作用的药物先导物。这种基于机理和结构的新药物发现可以选择性地阻断疾病发生和发展过程中最关键的病理环节，研发出高效低毒副作用的特异性药物。本发明涉及的SARS半胱氨酸蛋白酶SACP作为治疗和/或预防SARS病毒感染药物作用靶标的用途。

本发明另一方面涉及依据确定的药物作用靶标SARS半胱氨酸蛋白酶SACP，采用分子模建试验建立SACP的三维空间结构，并确定其催化水解蛋白的活性位点。即本发明的SACP功能区域指SACP序列编号为41、47、51、139、160、161、162、163、164、165、166、167、171、186、187、188、189、190号氨基酸残基所构成的区域。更进一步讲，本发明的SACP功能区域优选由序列编号为41号的组氨酸和序列编号为145号半胱氨酸构成，构成功能区域Cys145的硫原子与His41的ε1氮原子间的距离为3.0-6.0埃。

本发明还涉及SACP的抑制剂，其包括能与SACP功能区域结构互补的物质。所述物质可选自有机化合物，多肽化合物，寡糖化合物，单克隆抗体或核苷类化合物，优选有机化合物或多肽。

本发明人根据上述发现进行了治疗和/或预防SARS病毒感染药物的筛选研究，发现具有通式I的反式环氧琥珀酸衍生物可以特异地与靶标半胱氨酸蛋白酶SACP结构互补(互补结构见附图5)，可以阻断靶标半胱氨酸蛋白酶SACP介导的SARS病毒的复制、转录、翻译和组装，可以用于治疗和/或预防SARS病毒感染的用途。

美国专利US3911111、US4333879和US4393228披露了含有通式I的化合物可以用于作为神经损伤的抑制剂(Neuronal injury inhibitor)和巯基蛋白酶抑制剂(Thiol protease inhibitor)及其制备方法。日本专利JP55115878和JP60174777披露了含有通式I的化合物新的制备方法。本发明人在实验中发现含有通式I的化合物包括其消旋体或旋光异构体或其可药用盐或水合物，可以特异地靶向SARS半胱氨酸蛋白酶SACP，从而可以用于作为SACP的抑制剂

因此，本发明再一方面涉及式I化合物在制备用于预防和/或治疗SARS病毒感染的药物中用途。

其中：

R₁和R₂独立选自氢，C₁～C₄直链或支链烷基，C₂～C₄直链或支链烯基，C₃～C₈环烷基，C₅～C₈环烯基，其中的烷基或者烯基链上可以无取代，也可以被选自下面的一个或者多个基团所取代：卤素，C₃～C₈环烷基，C₅～C₇环烯基，芳香碳环其中的环可以是单环或双环，每个环由5～6个碳组成，环上可以无取代，也可以被1-3个选自下面的取代基取代：卤素，硝基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，

R₃和R₄独立选自氢，C₁～C₈直链或支链烷基，C₂～C₈直链或支链烯基，C₃～C₈环烷基，C₅～C₈环烯基，羟基，C₁～C₄烷氧基，C₁～C₄烷氨基，其中的烷基或者烯基链上可以无取代，也可以被选自下面的一个或者多个基团所取代：卤素，苯基，羟基，C₃～C₈环烷基，C₅～C₇环烯基，硝基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，R₃和R₄一起组成5～6元的杂环，或与氮原子、氧原子一起组成5～6元的杂环，环上可以无取代，也可以被1-3个选自下面的取代基取代：卤素，硝基，羟基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，二膦酸基，C₁～C₆直链或支链烷基，C₂～C₆直链或支链烯基，C₁～C₄烷氧基，C₂～C₄烯氧基，苯氧基，苄氧基，磺酰胺基，甲基磺酰胺基，二甲基磺酰胺基。

本发明另一方面还涉及用于预防和/或治疗SARS感染的药物组合物，其包括至少一种通式I化合物或者其药用盐或其水合物以及药用载体或赋形剂。

本发明还涉及预防和/或治疗SARS感染的方法，其包括将预防和/或治疗有效量的至少一种式I化合物或者其药用盐或其水合物给予需要上述预防和/或治疗的患者。

本发明还涉及式I化合物其药学上可以接受的盐，其包括无机盐或有机盐，其包括但不限于：碱金属盐，碱土金属盐，盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，硝酸盐，硫酸盐，硫酸氢盐，磷酸盐，磷酸氢盐，乙酸盐，丙酸盐，丁酸盐，草酸盐，三甲基乙酸盐，己二酸盐，藻酸盐，乳酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐，琥珀酸盐，马来酸盐，富马酸盐，苦味酸盐，天门冬氨酸盐，葡糖酸盐，苯甲酸盐，甲磺酸盐，乙磺酸盐，苯磺酸盐，对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐。

根据本发明，本发明式I化合物或其药用盐或水合物优选下面的化合物：

化合物

结构

其中最优选的化合物为Loxistatin，(+)-(2S，3S)-2，3-环氧-N-[1-(S)-(N-异戊基氨基甲酰基-3-甲基丁基)]琥珀酸乙酯

本发明的另一个方面涉及药物组合物，其含有本发明化合物的消旋体或旋光异构体和至少一种药学上可接受的载体，其可用于体内治疗并具有生物相容性。所述药物组合物可以根据不同给药途径而制备成各种形式。本发明所提及的化合物也可以被制备成各种药学可接受的盐，本发明所说的药物组合物可以用于预防和/或治疗由于冠状病毒感染造成的传染性非典型性肺炎(Severe Acute RespiratorySyndrome，SARS)。

本发明涉及的可以用于预防和/或治疗由于冠状病毒感染造成的传染性非典型性肺炎(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)的药物组合物是指包括有效剂量的本发明式I化合物或其可药用盐或水合物和一种或多种适宜的可药用载体。这里的药用载体包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛脂。

本发明涉及阻断SACP的催化水解蛋白功能，阻断SARS病毒的复制、转录、翻译和组装，阻断SACP蛋白酶的功能不会对感染SARS病毒的人或动物正常的生理过程产生不良影响，可以用于治疗和/或预防SARS病毒感染的医药用途。

本发明化合物的药物组合物可以以下面的任意方式施用：口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，局部用药，非肠道用药，如皮下，静脉，肌内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中预防SARS病毒感染时优选口服、治疗SARS病毒感染时优选腹膜内或静脉内给药方式。

当口服用药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊制剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。如果需要，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。

当局部用药时，特别是治疗局部外敷容易达到的患面或器官，如眼睛、皮肤或下肠道神经性疾病时，可根据不同的患面或器官将本发明化合物制成不同的局部用药制剂形式，具体说明如下：

当眼部局部施用时，本发明化合物可配制成一种微粉化悬浮液或溶液的制剂形式，所使用载体为等渗的一定pH的无菌盐水，其中可加入也可不加防腐剂如氯化苄基烷醇盐。对于眼用，也可将化合物制成膏剂形式如凡士林膏。

当皮肤局部施用时，本发明化合物可制成适当的软膏、洗剂或霜剂制剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿物油，液体凡士林，白凡士林，丙二醇，聚氧化乙烯，聚氧化丙烯，乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油，脱水山梨糖醇单硬脂酸酯，吐温60，十六烷酯蜡，十六碳烯芳醇，2-辛基十二烷醇，苄醇和水。

本发明化合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液或无菌注射溶液。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。

另外需要指出，本发明化合物的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。优选的使用剂量介于0.01～100mg/kg体重/天，其中最优剂量在1mg/kg-50mg/kg体重/天。

附图说明

图1.SARS半胱氨酸蛋白酶SACP的二级结构预测

图2.SARS半胱氨酸蛋白酶SACP与TGEV 1LVO的序列比对，图中“*”号表示完全相同的残基位点，“.”表示保守性极高的残基位点；“.”号代表保守性略低的残基位点，曲线代表序列比对的准确率。

图3.模建的SARS半胱氨酸蛋白酶SACP的三维空间结构

图4.SARS半胱氨酸蛋白酶SACP与TGEV空间结构活性位点的对比，SACP中，从图中可以看到SACP与TGEV的关键的活性位点41号组氨酸(His41)和145号半胱氨酸Cys145可以较好地重叠在一起

图5.药物(+)-(2S，3S)-2，3-环氧-N-[1-(S)-(N-异戊基氨基甲酰基-3-甲基丁基)]琥珀酸乙酯与SARS半胱氨酸蛋白酶SACP的分子对接，图中药物(+)-(2S，3S)-2，3-环氧-N-[1-(S)-(N-异戊基氨基甲酰基-3-甲基丁基)]琥珀酸乙酯用球棍图表示，活性位点的关键残基His41，Cys145，His163用棒状图表示，半胱氨酸蛋白酶SACP用飘带图表示。

图6.反相-HPLC方法检测细菌表达的SARS 3CL^pro活性的HPLC图谱。RT＝10.7的为底物的峰，RT＝7.6及8.5的为底物被SARS 3CL^pro裂解的主要产物峰。

图7.反相-HPLC方法检测药物(+)-(2S，3S)-2，3-环氧-N-[1-(S)-(N-异戊基氨基甲酰基-3-甲基丁基)]琥珀酸乙酯对细菌表达的SARS3CL^pro抑制活性的HPLC图谱。RT＝10.7的为底物的峰，RT＝7.6及8.5的为底物被SARS 3CL^pro裂解的主要产物峰。

实施例

下面的实施例是本发明说明性优选实施方案，对本发明不构成任何限制。

实施例1：人SARS-CoV冠状病毒SACP蛋白序列的多重对比结果

SACP ：SGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDTVYCPRHVICTAEDML

BJ01 ：SGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDTVYCPRHVICTAEDML

Vietnam ：SGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDTVYCPRHVICTAEDML

CUHK-W1 ：SGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDTVYCPRHVICTAEDML

Tor2 ：SGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDTVYCPRHVICTAEDML

BJ02 ：SGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDTVYCPRHVICTAEDML

HKU39849：SGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDTVYCPRHVICTAEDML

Canada ：SGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDTVYCPRHVICTAEDML

BJ03 ：SGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDTVYCPRHVICTAEDML

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BJ01 ：NPNYEDLLIRKSNHSFLVQAGNVQLRVIGHSMQNCLLRLKVDTSNPKTPK

Vietnam ：NPNYEDLLIRKSNHSFLVQAGNVQLRVIGHSMQNCLLRLKVDTSNPKTPK

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BJ03 ：NPNYEDLLIRKSNHSFLVQAGNVQLRVIGHSMQNCLLRLKVDTSNPKTPK

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BJ01 ：YKFVRIQPGQTFSVLACYNGSPSGVYQCAMRPNHTIKGSFLNGSCGSVGF

Vietnam ：YKFVRIQPGQTFSVLACYNGSPSGVYQCAMRPNHTIKGSFLNGSCGSVGF

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Canada ：YKFVRIQPGQTFSVLACYNGSPSGVYQCAMRPNHTIKGSFLNGSCGSVGF

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实施例2：SARS-CoV冠状病毒中SACP序列与其他种类的冠状病毒的蛋白序列进行多序列比对多重对比结果

序列对比使用CLUSTAL X，版本1.81完成，对比的其他种类的冠状病毒的蛋白序列包括：传染性肠胃炎病毒(TransmissibleGastroenteritis Virus，TGEV)、鼠肝炎病毒(Murine Hepatitis Virus，MHeV)、牛冠状病毒(bovine coronavirus，BcoV)，猫传染性腹膜炎病毒(Feline Infectious Peritonitis virus，FIPV)、人冠状病毒229E(human coronavirus 229E，HcoV)和鸟传染性支气管炎病毒(AvianInfectious Bronchiyis Virus，AIBV)。对比结果及其同源性“*”号表示完全相同的残基位点，“.”表示保守性极高的残基位点；“.”号代表保守性略低的残基位点。从对比结果可以看出重要的氨基酸残基包括起催化作用的Cys145和His41完全相同的(氨基酸序号依据SARS冠状病毒SACP序列编号)。

SACP SGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDTVYCPRHVICTAEDMLNPNYEDLLIR 60

TGEV SGLRKMAQPSGLVEPCIVRVSYGNNVLNGLWLGDEVICPRHVIAS-DTTRVINYENEMSS 59

FIPV SGLRKMAQPSGVVEPCIVRVAYGNNVLNGLWLGDEVICPRHVIAS-DTSRVINYENELSS 59

HCoV AGLRKMAQPSGFVEKCVVRVCYGNTVLNGLWLGDIVYCPRHVIAS-NTTSAIDYDHEYSI 59

BCoV SGIVKMVNPTSKVEPCIVSVTYGNMTLNGLWLDDKVYCPRHVICSASDMTNPDYTNLLCR 60

MHV SGIVKMVSPTSKVEPCVVSVTYGNMTLNGLWLDDKVYCPRHVICSSADMTDPDYPNLLCR 60

IBV SGFKKLVSPSSAVEKCIVSVSYRGNNLNGLWLGDTIYCPRHVLGK---FSGDQWNDVLNL 57

:*: *:. *:. ** *:* * ******.* : *****: . :: .

SACP KSNHSFLVQAGN-VQLRVIGHSMQNCLLRLKVDTSNPKTPKYKFVRIQPGQTFSVLACYN 119

TGEV VRLHNFSVSKNN-VFLGVVSARYKGVNLVLKVNQVNPNTPEHKFKSIKAGESFNILACYE 118

FIPV VRLHNFSIAKNN-AFLGVVSAKYKGVNLVLKVNQVNPNTPEHKFKSVRPGESFNILACYE 118

HCoV MRLHNFSIISGT-AFLGVVGATMHGVTLKIKVSQTNMHTPRHSFRTLKSGEGFNILACYD 118

BCoV VTSSDFTVLFDR-LSLTVMSYQMQGCMLVLTVTLQNSRTPKYTFGVVKPGETFTVLAAYN 119

MHV VTSSDFCVMSDR-MSLTVMSYQMQGSLLVLTVTLQNPNTPKYSFGVVKPGETFTVLAAYN 119

IBV ANNHEFEVTTQHGVTLNVVSRRLKGAVLILQTAVANAETPKYKFIKANCGDSFTIACAYG 117

.*: * *:. : . * :. *.**.:.* . *: *.:..*

SACP GSPSGVYQCAMRPNHTIKGSFLNGSCGSVGFNIDYDCVSFCYMHHMELPTGVHAGTDLEG 179

TGEV GCPGSVYGVNMRSQGTIKGSFIAGTCGSVGYVLENGILYFVYMHHLELGNGSHVGSNFEG 178

FIPV GCPGSVYGVNMRSQGTIKGSFIAGTCGSVGYVLENGTLYFVYMHHLELGNGSHVGSNLEG 178

HCoV GCAQGVFGVNMRTNWTIRGSFINGACGSPGYNLKNGEVEFVYMHQIELGSGSHVGSSFDG 178

BCoV GKPQGAFHVTMRSSYTIKGSFLCGSCGSVGYVLMGDCVKFVYMHQLELSTGCHTGTDFNG 179

MHV GRPQGAFHVVMRSSHTIKGSFLCGSCGSVGYVLTGDSVRFVYMHQLELSTGCHTGTDFSG 179

VIBV GTVVGLYPVTMRSNGTIRASFLAGACGSVGFNIEKGVVNFFYMHHLELPNALHTGTDLMG 177

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SACP KFYGPFVDRQTAQAAGTDTTITLNVLAWLYAAVINGDR------WFLNRFTTTLNDFNLV 233

TGEV EMYGGYEDQPSMQLEGTNVMSSDNVVAFLYAALINGER------WFVTNTSMSLESYNTW 232

FIPV EMYGGYEDQPSMQLEGTNVMSSDNVVAFLYAALINGER------WFVTNTSMTLESYNAW 232

HCoV VMYGGFEDQPNLQVESANQMLTVNVVAFLYAAILNGCT------WWLKGEKLFVEHYNEW 232

BCoV DFYGPYKDAQVVQLPVQDYIQSVNFVAWLYAAILNNCN------WFVQSDKCSVEDFNVW 233

MHV NFYGPYRDAQVVQLPVQDYTQTVNVVAWLYAAILNRCN------WFVQSDSCSLEEFNVW 233

IBV EFYGGYVDEEVAQRVPPDNLVTNNIVAWLYAAIISVKESSFSLPKWLESTTVSVDDYNKW 237

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SACP AMKYNYEPLTQDHVDILGPLSAQTGIAVLDMCAALKELLQNGMNGRTILGSTILEDEFTP 293

TGEV AKTNSFTELSSTDA--FSMLAAKTGQSVEKLLDSIVR-LNKGFGGRTILSYGSLCDEFTP 289

FIPV AKTNSFTEIVSTDA--FNMLAAKTGYSVEKLLECIVR-LNKGFGGRTILSYGSLCDEFTP 289

HCoV AQANGFTAMNGEDA--FSILAAKTGVCVERLLHAIQV-LNNGFGGKQILGYSSLNDEFSI 289

BCoV ALSNGFSQVKSDLV--IDALASMTGVSLETLLAAIKR-LKNGFQGRQIMGSCSFEDELTP 290

MHV AMTNGFSSIKADLV--LDALASMTGVTVEQVLAAIKR-LHSGFQGKQILGSCVLEDELTP 290

IBV AGDNGFTPFSTSTA--ITKLSAITGVDVCKLLRTIMV-KNSQWGGDPILGQYNFEDELTP 294

* .: . . : *:: ** : : : :. * *:. : **::

SACP FDVVRQCSGVTFQ 306

TGEV TEVIRQMYGVNLQ 302

FIPV TEVIRQMYGVNLQ 302

HCoV NEVVKQMFGVNLQ 302

BCoV SDVYQQLAGIKLQ 303

MHV SDVYQQLAGVKLQ 303

IBV ESVFNQIGGVRLQ 307

.*.* *: :*

实施例3：Loxistatin，(+)-(2S，3S)-2，3-环氧-N-[1-(S)-(N-异戊基氨基甲酰基-3-甲基丁基)]琥珀酸乙酯靶向SARS半胱氨酸蛋白酶SACP

首先按照手性要求用InsightII(MSI company LtD，San Diego)构建分子Loxistatin，(+)-(2S，3S)-2，3-环氧-N-[1-(S)-(N-异戊基氨基甲酰基-3-甲基丁基)]琥珀酸乙酯的三维结构，经分子力学和分子动力学优化获得低能构象。接着采用分子对接的方法将Loxistatin对接到SACP的活性部位，进行对接时除考虑Loxistatin与活性部位的几何互补外，还通过对Loxistatin中可旋转键进行旋转，选取Loxistatin的多种不同构象以考察Loxistatin与SACP的相互作用。最后对复合物结构进行分子力学和分子动力学优化，选取能量最低的构象作为最终复合物结构，该结构中Loxistatin与SACP的相互作用能为-47.83Kcal/mol，其中范德华相互作用能为-34.23Kcal/mol，静电相互作用能为-13.60Kcal/mol。分子对接显示结果附图5中。从图中可以看出，Loxistatin可以很好地靶向SACP的活性位点，作用进靶标SACP编号为41、47、51、139、160、161、162、163、164、165、166、167、171、186、187、188、189、190号氨基酸残基所围成的功能区域，采用的作用方式为占据SACP的His41和Cys145催化位点，从而阻断His41和Cys145的催化作用，实现对靶标SACP蛋白催化水解活性的抑制。

实施例4：药物(+)-(2S，3S)-2，3-环氧-N-[1-(S)-(N-异戊基氨基甲酰基-3-甲基丁基)]琥珀酸乙酯对Vero E6细胞的细胞毒性试验

(+)-(2S，3S)-2，3-环氧-N-[1-(S)-(N-异戊基氨基甲酰基-3-甲基丁基)]琥珀酸乙酯按照美国专利US3911111提供的方法制备。将处理好的长成单层的非洲绿猴肾细胞(Vero E6)，接种于10mL细胞培养瓶中，37℃吸附2h，然后吸出标本液、加含有2％小牛血清的细胞维持液，置37℃ CO₂培养箱培养。分别加入1微克/毫升、10微克/毫升和100微克/毫升的药物，五天后观察药物对Vero E6细胞的毒性。对Vero E6细胞的毒性的实验结果表明在1微克/毫升、10微克/毫升的药物浓度下，药物对Vero E6细胞没有毒性，完全不影响Vero E6细胞增殖和生长。

实施例5：药物(+)-(2S，3S)-2，3-环氧-N-[1-(S)-(N-异戊基氨基甲酰基-3-甲基丁基)]琥珀酸乙酯对抗SARS病毒感染的筛选试验

体外(in vitro)Vero E6细胞筛选试验，将处理好的SARS病毒标本，采用病毒浓度为能使半数Vero E6细胞感染浓度的100倍(100TCID₅₀)，攻击长成单层绿猴肾细胞(Vero E6)，然后接种于10mL细胞培养瓶中，每份标本接种两瓶，37℃吸附2h，然后吸出标本液、洗去病毒，加含有2％小牛血清的细胞维持液，置37℃ CO₂培养箱培养。用96孔板测试药物对病毒感染细胞的保护作用，设不加药的阴性对照和加入10微克/毫升的药物，药物加入至少4个孔，五天后观察药物对防止SARS病毒感染Vero E6细胞的保护作用，实验结果表明，在10微克/毫升药物浓度下，药物(+)-(2S，3S)-2，3-环氧-N-[1-(S)-(N-异戊基氨基甲酰基-3-甲基丁基)]琥珀酸乙酯可以完全对抗SARS病毒对Vero E6感染，四个孔的结果平行，没有加药和加阴性对照药物孔中的细胞则完全感染。药物(+)-(2S，3S)-2，3-环氧-N-[1-(S)-(N-异戊基氨基甲酰基-3-甲基丁基)]琥珀酸乙酯保护Vero E6细胞对抗SARS病毒感染结果见下表中。+表示细胞病变的程度。EC50＜1μg/ml，TC50～50μg/ml，治疗指数TC50/EC50＞50。

表二抗病毒感染实验结果

20μg/ml	10μg/ml	5μg/ml	2.5μg/ml	1.2μg/ml	细胞对照	病毒对照
20μg/ml	10μg/ml	5μg/ml	2.5μg/ml	1.2μg/ml	细胞对照	病毒对照	-	-	-	-	-	-	++++
-	-	-	-	-	-	++++	-	-	-	-	-	-	++++
-	-	-	-	-	-	++++	-	-	+	-	-	-	++++

实验例6 反相-HPLC方法检测细菌表达的SARS 3CL^pro活性以及抑制剂活性测定：

根据冠状病毒蛋白酶催化底物的特异性具有保守性的特点，设计10肽酶活性检测底物，用反相-HPLC法对半胱氨酸蛋白酶水解活性进行检测。该底物序列为：H₂N- SAVLQSGFRK-COOH。取底物2.5mmol，蛋白酶浓度0.7μmol于37℃在20μl20mmol Bis-Tris-HCl(pH7.0)反应缓冲液中进行酶切反应，反应结束后加入0.1％三氟醋酸-70℃存。反应产物用5-90％浓度的0.1％三氟醋酸在Delta Pak C18柱(3.9×150mm；Waters)中进行反相-HPLC分离，215nm波长检测洗脱产物。抑制剂预先与不同浓度的蛋白酶于37℃预孵育60min，加入肽底物(终浓度为2.5mmol)裂解30min后，根据底物的水解程度测定蛋白酶活性。结果表明药物(+)-(2S，3S)-2，3-环氧-N-[1-(S)-(N-异戊基氨基甲酰基-3-甲基丁基)]琥珀酸乙酯能够有效地抑制细菌表达的SARS 3CL^pro活性，在10mmol浓度下的抑制作用达到了50％。

表三 HPLC法测定药物活性结果

无抑制剂			有抑制剂
无抑制剂			有抑制剂			RT	AREA	AREA(％)	RT	AREA	AREA(％)
7.649	804.3	42.8	7.663	333.9	20.1	RT	AREA	AREA(％)	RT	AREA	AREA(％)
7.649	804.3	42.8	7.663	333.9	20.1	8.808	414.7	22.1	8.517	129.5	7.8
10.745	660.3	35.1	10.753	1201.1	72.1	8.808	414.7	22.1	8.517	129.5	7.8

Claims

1.SARS半胱氨酸蛋白酶SACP作为治疗和/或预防SARS病毒感染药物作用靶标的用途。靶标SACP的序列特征及其编号为：

1 SGFRKMAFPS GKVEGCMVQV TCGTTTLNGL WLDDTVYCPR HVICTAEDML NPNYEDLLIR

61 KSNHSFLVQA GNVQLRVIGH SMQNCLLRLK VDTSNPKTPK YKFVRIQPGQ TFSVLACYNG

121 SPSGVYQCAM RPNHTIKGSF LNGSCGSVGF NIDYDCVSFC YMHHMELPTG VHAGTDLEGK

181 FYGPFVDRQT AQAAGTDTTI TLNVLAWLYA AVINGDRWFL NRFTTTLNDF NLVAMKYNYE

241 PLTQDHVDIL GPLSAQTGIA VLDMCAALKE LLQNGMNGRT ILGSTILEDE FTPFDVVRQC

301 SGVTFQ

2.SACP在筛选预防和/或治疗SARS感染药物中的用途，SACP的序列特征及其编号为：

1 SGFRKMAFPS GKVEGCMVQV TCGTTTLNGL WLDDTVYCPR HVICTAEDML NPNYEDLLIR

61 KSNHSFLVQA GNVQLRVIGH SMQNCLLRLK VDTSNPKTPK YKFVRIQPGQ TFSVLACYNG

121 SPSGVYQCAM RPNHTIKGSF LNGSCGSVGF NIDYDCVSFC YMHHMELPTG VHAGTDLEGK

181 FYGPFVDRQT AQAAGTDTTI TLNVLAWLYA AVINGDRWFL NRFTTTLNDF NLVAMKYNYE

241 PLTQDHVDIL GPLSAQTGIA VLDMCAALKE LLQNGMNGRT ILGSTILEDE FTPFDVVRQC

301 SGVTFQ

3.权利要求1或2的用途，其中，靶标SACP功能区域指由序列编号为41、47、51、139、160、161、162、163、164、165、166、167、171、186、187、188、189、190号氨基酸残基所构成的区域。

4.权利要求3的用途，其中靶标SACP功能区域指由序列编号为41号的组氨酸和序列编号为145号半胱氨酸构成，构成功能区域Cys145的硫原子与His41的ε1氮原子间的距离为3.0-6.0埃。

5.SACP抑制剂，其为与权利要求1或2的SACP序列或权利要求3或4的SACP功能区域结构互补的物质。

6.权利要求5的抑制剂，其中所述SACP功能区域为权利要求4中定义的功能区域。

7.权利要求5或6的抑制剂，其中所述物质选自有机分子化合物或多肽化合物，寡糖化合物，单克隆抗体或核苷类化合物。

8.权利要求6或7的抑制剂，其中所述物质为有机分子化合物或多肽化合物。

9.通式I反式环氧琥珀酸衍生物包括其消旋体或旋光异构体或其可药用的盐或水合物在制备用于治疗和/或预防SARS病毒感染的药物中用途，

其中：

R₃和R₄独立选自氢，C₁～C₈直链或支链烷基，C₂～C₈直链或支链烯基，C₃～C₈环烷基，C₅～C₈环烯基，羟基，C₁～C₄烷氧基，C₁～C₄烷氨基，其中的烷基或者烯基链上可以无取代，也可以被选自下面的一个或者多个基团所取代：卤素，苯基，羟基，C₃～C₈环烷基，C₅～C₇环烯基，硝基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，R₃和R₄一起组成5～6元的杂环，或与氮原子、氧原子一起组成5～6元的杂环，环上可以无取代，也可以被1-3个选自下面的取代基取代：卤素，硝基，羟基，羟甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，二瞵酸基，C₁～C₆直链或支链烷基，C₂～C₆直链或支链烯基，C₁～C₄烷氧基，C₂～C₄烯氧基，苯氧基，苄氧基，磺酰胺基，甲基磺酰胺基，二甲基磺酰胺基。

10.权利要求9的用途，其中化合物为：Loxistatin，(+)-(2S，3S)-2，3-环氧-N-[1-(S)-(N-异戊基氨基甲酰基-3-甲基丁基)]琥珀酸乙酯。