CN115227810A - 一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗及其制备方法 - Google Patents
一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗及其制备方法，涉及农业科学技术领域，为解决现有的鸡球虫的疫苗大多数只有刺激保护性免疫功能，缺少快速修护球虫感染后造成的肠道菌群失调问题，导致养殖效益低的问题。包括以下步骤：步骤一：准备好制备材料和设备，依次进行质量检测，查看是够可以正常使用，其中培养基需要准备五个；步骤二：进行重组质粒pDGIEF‑EMIMP1C的构建；步骤三：进行重组枯草芽孢杆菌的构建；步骤四：进行重组枯草芽孢杆菌的鉴定，其中需要先进行淀粉酶活性检测，然后进行SDS‑PAGE分析表达产物，再进行western‑blot鉴定表达产物；其中，所述步骤一中的培养基包括培养基主体，所述培养基主体的上端设置有培养基盖。
Description
技术领域
本发明涉及农业科学技术领域，具体为一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗及其制备方法。
背景技术
巨型艾美耳球虫在所有球虫中的免疫原性最强，接种适宜的卵囊即可让机体对同源球虫产生坚强的免疫力，甚至有部分交叉免疫力。目前已鉴定的巨型艾美耳球虫的免疫保护性抗原有多种，其虫体表面抗原IMP1被证实具有较好的免疫保护原性；
例如公告号为CN111840530A的中国授权专利(一种柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗VNQS的制备及其在抗鸡球虫病中的应用方法)：包括步骤一，VNQS编码基因的克隆，根据鸡球虫基因序列设计上游引物SEQIDNO:3 和下游引物SEQIDNO:4,进行PCR扩增、电泳得到一条约1500bp的片段，将该产物连接转化后得到序列全长为1452bp的VNQS,其序列为SEQIDNO:1。
现有的鸡球虫的疫苗大多数只有刺激保护性免疫功能，缺少快速修护球虫感染后造成的肠道菌群失调问题，导致养殖效益低，为此，我们提供一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗及其制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的现有的鸡球虫的疫苗大多数只有刺激保护性免疫功能，缺少快速修护球虫感染后造成的肠道菌群失调问题，导致养殖效益低的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：准备好制备材料和设备，依次进行质量检测，查看是够可以正常使用，其中培养基需要准备五个；
步骤二：进行重组质粒pDGIEF-EMIMP1C的构建；
步骤三：进行重组枯草芽孢杆菌的构建；
步骤四：进行重组枯草芽孢杆菌的鉴定，其中需要先进行淀粉酶活性检测，然后进行SDS-PAGE分析表达产物，再进行western-blot鉴定表达产物；
其中，所述步骤一中的培养基包括培养基主体，所述培养基主体的上端设置有培养基盖，所述培养基主体的前后端均设置有限位固定柱，且限位固定柱与培养基主体为一体结构，所述培养基盖的上表面设置有第一进料管，所述第一进料管的一侧设置有第二进料管，且第一进料管和第二进料管与培养基盖均为一体结构，所述第一进料管和第二进料管的一侧均设置有密封塞，所述培养基盖的内壁设置有移动槽，所述移动槽的一端设置有限位槽，且移动槽和限位槽与培养基盖均为一体结构。
优选的，所述步骤二中重组质粒pDGIEF-EMIMP1C的构建需要根据 GenBank上的EmIMP1C基因序列将EmIMP1C片段插入pDGIEF质粒的Nco I 和Nhe I克隆位点上，将连接产物转化至DH5α，涂板过夜培养，挑取单菌落提取质粒利用其上的酶切位点进行酶切鉴定，经鉴定的阳性菌落进行重组子进行测序验证，将测序成功的菌株在50μg/mL的氯霉素压力下大量培养用以获得重组质粒pDGIEF-EMIMP1C。
优选的，所述EmIMP1C基因序列为FN813227。
优选的，所述步骤三中重组枯草芽孢杆菌的构建需要将重组质粒 pDGIEF-EMIMP1C用Sac I酶切线性化后转化入枯草芽孢杆菌SCK6感受态细胞中，涂布于具有SPC抗性的LBG平板上；将在SPC抗性平板上生长的单克隆菌落接种至不含有SPC的LBG液体培养基中于37℃培养24h；取100μL然后涂布于含有1mM IPTG的LB平板上，挑取能够正常生长的单克隆并用PCR验证EMIMP1C基因的存在，阳性克隆命名为SCK6-EMIMP1C。
优选的，所述SPC是100μg/mL的壮观霉素，LBG是含1％的葡萄糖的 LB培养基。
优选的，所述步骤四中的淀粉酶活性检测是通过以下方法鉴定：将 SCK6-EMIMP1C重组菌与空白对照组SCK用无菌针点种于含有1％淀粉的LB 平板上，在37℃条件下培养12h，用碘液熏蒸后，观察点种的重组菌落周围是否会出现特异的透明圈，如无出现透明环则证明目的基因已整合至 SCK6的a-淀粉酶基因中：a-淀粉酶基因上由于同源重组插入了EMIMP1C 片段，破坏了a-淀粉酶基因的表达，所以没有透明圈的出现。
优选的，所述步骤四中的SDS-PAGE分析表达产物是通过以下方法鉴定：将淀粉酶活性检测无透明环的SCK6-EMIMP1C与空白对照SCK6-pDGIEF 活化，进行划线，第二天先挑取单菌落接种至LB液体中扩大培养过夜，取2mL菌液于6000g离心10min，并用PBS反复进行洗涤两到三次，然后加入200μLPBS震荡混匀，取样品20μL与5μL上样缓冲液震荡混匀，水浴锅中高温处理10min制备蛋白电泳样本进行SDS-PAGE电泳，鉴定出表达目标蛋白32Ku的阳性克隆，其中SDS-PAGE电泳是12.5％的凝胶，将分离胶电泳电压80V，蛋白电泳电压至150V。
优选的，所述步骤四中的western-blot鉴定表达产物是通过以下方法鉴定：使用western-blot对SCK6-EMIMP1C表达的EMIMP1C蛋白进行进一步鉴定，一抗为EMIMP1C多克隆鸡血清，经鉴定SCK6-EMIMP1C表达的 EMIMP1C蛋白可与EMIMP1C原核表达刺激产生的抗体进行免疫反应。
优选的，所述培养基盖的前后表面均设置有抬动圆柱架，且抬动圆柱架与培养基盖为一体结构。
优选的，所述第一进料管和第二进料管的外壁均设置有密封塞槽，且密封塞槽贯穿第一进料管和第二进料管的管壁，所述第一进料管和第二进料管的内壁均设置有连接槽，且连接槽与密封塞的一端相匹配。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明通过进行重组质粒pDGIEF-EMIMP1C的构建、进行重组枯草芽孢杆菌的构建和进行重组枯草芽孢杆菌的鉴定，将巨型艾美耳球虫的免疫保护性抗原EMIMP1蛋白基因通过pDGIEF质粒重组入枯草芽孢杆菌 SCK6基因组，制备鸡球虫EMIMP1C重组枯草芽孢杆菌口服活疫苗，拟实现对巨型艾美耳球虫的免疫保护的同时发挥枯草芽孢杆菌调节肠道菌群、改善鸡生长性能、增强机体免疫力的益生菌作用，使用的枯草芽孢杆菌为可应用于禽类养殖业的益生菌，具备调节肠道菌群、改善动物生长性能特点，利用该益生菌制备的疫苗可维持肠道菌群的多样性，从而提高养殖效益，并且枯草芽孢杆菌拌料、饮水等多种方式口服免疫，简单方便，同时制备的疫苗不携带抗生素耐药基因，提高安全性和降低成本，使用此方法制备，枯草芽孢杆菌孢子化后可常温条件下储存运输，保存期可达十二个月。
2、培养基主体前后表面均设置有限位固定柱，并且培养基盖内壁设置有移动槽和限位槽，移动槽和限位槽的一端互动，移动槽的另一端为开口形式，并且移动槽和限位槽均设置有两个，与两个限位固定柱对应，在盖上培养基盖的时候，两个移动槽沿着两个限位固定柱下移，下移到顶之后，转动培养基盖，使两个限位固定柱分别卡在两个限位槽内，这样便可以实现培养基盖与培养基主体固定，在拿取的时候就可以通过拿取培养基盖带动培养基主体取出，相对于现有必须拿取培养基主体才可以取出来说，便于快速取出培养基主体，不易导致培养基盖掉落损坏，并且在培养基盖上表面设置第一进料管和第二进料管，第一进料管和第二进料管结构一致，通过密封塞进行密封和开启，便于进行分类下料，并且也可以进行进行口气流通和密封，提高使用灵活性。
附图说明
图1为本发明的步骤流程示意图；
图2为本发明的EmIMP1C基因片段扩增引物示意图；
图3为本发明的EmIMP1C基因PCR扩增体系和反应条件示意图；
图4为本发明的SCK6-HPMEMIMP1C重组菌a-淀粉酶的活性检测示意图；
图5为本发明的EMIMP1C蛋白表达结果示意图；M:标准蛋白Marker;1:EMIMP1C重组蛋白 ;2: EMIMP1C重组蛋白；3：SCK6枯草芽孢杆菌对照
图6为本发明的Western Blot鉴定EMIMP1C表达的重组蛋白示意图；M:标准蛋白Marker;1:EMIMP1C重组蛋白（32Ku）;2:空白对照
图7为本发明的培养基结构示意图；
图8为本发明的培养基盖内壁结构示意图；
图9为本发明的第一进料管与密封塞连接结构示意图；
图中：1、培养基主体；2、培养基盖；3、第一进料管；4、第二进料管；5、密封塞；6、抬动圆柱架；7、限位固定柱；8、移动槽；9、限位槽；10、密封塞槽；11、连接槽。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
请参阅图1-9，本发明提供的一种实施例：一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：准备好制备材料和设备，依次进行质量检测，查看是够可以正常使用，其中培养基需要准备五个；
步骤二：进行重组质粒pDGIEF-EMIMP1C的构建；
步骤三：进行重组枯草芽孢杆菌的构建；
步骤四：进行重组枯草芽孢杆菌的鉴定，其中需要先进行淀粉酶活性检测，然后进行SDS-PAGE分析表达产物，再进行western-blot鉴定表达产物；
其中，所述步骤一中的培养基包括培养基主体1，培养基主体1的上端设置有培养基盖2，培养基主体1的前后端均设置有限位固定柱7，且限位固定柱7与培养基主体1为一体结构，培养基盖2的上表面设置有第一进料管3，第一进料管3的一侧设置有第二进料管4，且第一进料管3 和第二进料管4与培养基盖2均为一体结构，第一进料管3和第二进料管 4的一侧均设置有密封塞5，培养基盖2的内壁设置有移动槽8，移动槽8 的一端设置有限位槽9，且移动槽8和限位槽9与培养基盖2均为一体结构。
请参阅图1，步骤二中重组质粒pDGIEF-EMIMP1C的构建需要根据 GenBank上的EmIMP1C基因序列将EmIMP1C片段插入pDGIEF质粒的Nco I 和Nhe I克隆位点上，将连接产物转化至DH5α，涂板过夜培养，挑取单菌落提取质粒利用其上的酶切位点进行酶切鉴定，经鉴定的阳性菌落进行重组子进行测序验证，将测序成功的菌株在50μg/mL的氯霉素压力下大量培养用以获得重组质粒pDGIEF-EMIMP1C。
请参阅图1，EmIMP1C基因序列为FN813227。
请参阅图1、图2和图3，步骤三中重组枯草芽孢杆菌的构建需要将重组质粒pDGIEF-EMIMP1C用Sac I酶切线性化后转化入枯草芽孢杆菌 SCK6感受态细胞中，涂布于具有SPC抗性的LBG平板上；将在SPC抗性平板上生长的单克隆菌落接种至不含有SPC的LBG液体培养基中于37℃培养24h；取100μL然后涂布于含有1mM IPTG的LB平板上，挑取能够正常生长的单克隆并用PCR验证EMIMP1C基因的存在，阳性克隆命名为 SCK6-EMIMP1C，其中PCR反应体系和条件见说明书附图图2和说明书附图图3。
请参阅图1，SPC是100μg/mL的壮观霉素，LBG是含1％的葡萄糖的 LB培养基。
请参阅图1和图4，步骤四中的淀粉酶活性检测是通过以下方法鉴定：将SCK6-EMIMP1C重组菌与空白对照组SCK用无菌针点种于含有1％淀粉的 LB平板上，在37℃条件下培养12h，用碘液熏蒸后，观察点种的重组菌落周围是否会出现特异的透明圈，如无出现透明环则证明目的基因已整合至SCK6的a-淀粉酶基因中：a-淀粉酶基因上由于同源重组插入了EMIMP1C 片段，破坏了a-淀粉酶基因的表达，所以没有透明圈的出现，如说明书附图图4所示。
请参阅图1和图5，步骤四中的SDS-PAGE分析表达产物是通过以下方法鉴定：将淀粉酶活性检测无透明环的SCK6-EMIMP1C与空白对照 SCK6-pDGIEF活化，进行划线，第二天先挑取单菌落接种至LB液体中扩大培养过夜，取2mL菌液于6000g离心10min，并用PBS反复进行洗涤两到三次，然后加入200μLPBS震荡混匀，取样品20μL与5μL上样缓冲液震荡混匀，水浴锅中高温处理10min制备蛋白电泳样本进行SDS-PAGE 电泳，鉴定出表达目标蛋白32Ku的阳性克隆，EMIMP1C蛋白表达结果见说明书附图图5，其中SDS-PAGE电泳是12.5％的凝胶，将分离胶电泳电压 80V，蛋白电泳电压至150V。
请参阅图1和图6，步骤四中的western-blot鉴定表达产物是通过以下方法鉴定：使用western-blot对SCK6-EMIMP1C表达的EMIMP1C蛋白进行进一步鉴定，一抗为EMIMP1C多克隆鸡血清，经鉴定SCK6-EMIMP1C 表达的EMIMP1C蛋白可与EMIMP1C原核表达刺激产生的抗体进行免疫反应，Western Blot鉴定EMIMP1C表达的重组蛋白见说明书附图图6。
请参阅图7，培养基盖2的前后表面均设置有抬动圆柱架6，且抬动圆柱架6与培养基盖2为一体结构。
请参阅图7和图9，第一进料管3和第二进料管4的外壁均设置有密封塞槽10，且密封塞槽10贯穿第一进料管3和第二进料管4的管壁，第一进料管3和第二进料管4的内壁均设置有连接槽11，且连接槽11与密封塞5的一端相匹配。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (10)
1.一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：准备好制备材料和设备，依次进行质量检测，查看是够可以正常使用，其中培养基需要准备五个；
步骤二：进行重组质粒pDGIEF-EMIMP1C的构建；
步骤三：进行重组枯草芽孢杆菌的构建；
步骤四：进行重组枯草芽孢杆菌的鉴定，其中需要先进行淀粉酶活性检测，然后进行SDS-PAGE分析表达产物，再进行western-blot鉴定表达产物；
其中，所述步骤一中的培养基包括培养基主体(1)，所述培养基主体(1)的上端设置有培养基盖(2)，所述培养基主体(1)的前后端均设置有限位固定柱(7)，且限位固定柱(7)与培养基主体(1)为一体结构，所述培养基盖(2)的上表面设置有第一进料管(3)，所述第一进料管(3)的一侧设置有第二进料管(4)，且第一进料管(3)和第二进料管(4)与培养基盖(2)均为一体结构，所述第一进料管(3)和第二进料管(4)的一侧均设置有密封塞(5)，所述培养基盖(2)的内壁设置有移动槽(8)，所述移动槽(8)的一端设置有限位槽(9)，且移动槽(8)和限位槽(9)与培养基盖(2)均为一体结构。
2.根据权利要求1所述的一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤二中重组质粒pDGIEF-EMIMP1C的构建需要根据GenBank上的EmIMP1C基因序列将EmIMP1C片段插入pDGIEF质粒的Nco I和Nhe I克隆位点上，将连接产物转化至DH5α，涂板过夜培养，挑取单菌落提取质粒利用其上的酶切位点进行酶切鉴定，经鉴定的阳性菌落进行重组子进行测序验证，将测序成功的菌株在50μg/mL的氯霉素压力下大量培养用以获得重组质粒pDGIEF-EMIMP1C。
3.根据权利要求2所述的一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗的制备方法，其特征在于：所述EmIMP1C基因序列为FN813227。
4.根据权利要求1所述的一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤三中重组枯草芽孢杆菌的构建需要将重组质粒pDGIEF-EMIMP1C用SacI酶切线性化后转化入枯草芽孢杆菌SCK6感受态细胞中，涂布于具有SPC抗性的LBG平板上；将在SPC抗性平板上生长的单克隆菌落接种至不含有SPC的LBG液体培养基中于37℃培养24h；取100μL然后涂布于含有1mM IPTG的LB平板上，挑取能够正常生长的单克隆并用PCR验证EMIMP1C基因的存在，阳性克隆命名为SCK6-EMIMP1C。
5.根据权利要求4所述的一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗的制备方法，其特征在于：所述SPC是100μg/mL的壮观霉素，LBG是含1％的葡萄糖的LB培养基。
6.根据权利要求1所述的一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤四中的淀粉酶活性检测是通过以下方法鉴定：将SCK6-EMIMP1C重组菌与空白对照组SCK用无菌针点种于含有1％淀粉的LB平板上，在37℃条件下培养12h，用碘液熏蒸后，观察点种的重组菌落周围是否会出现特异的透明圈，如无出现透明环则证明目的基因已整合至SCK6的a-淀粉酶基因中：a-淀粉酶基因上由于同源重组插入了EMIMP1C片段，破坏了a-淀粉酶基因的表达，所以没有透明圈的出现。
7.根据权利要求1所述的一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤四中的SDS-PAGE分析表达产物是通过以下方法鉴定：将淀粉酶活性检测无透明环的SCK6-EMIMP1C与空白对照SCK6-pDGIEF活化，进行划线，第二天先挑取单菌落接种至LB液体中扩大培养过夜，取2mL菌液于6000g离心10min，并用PBS反复进行洗涤两到三次，然后加入200μLPBS震荡混匀，取样品20μL与5μL上样缓冲液震荡混匀，水浴锅中高温处理10min制备蛋白电泳样本进行SDS-PAGE电泳，鉴定出表达目标蛋白32Ku的阳性克隆，其中SDS-PAGE电泳是12.5％的凝胶，将分离胶电泳电压80V，蛋白电泳电压至150V。
8.根据权利要求1所述的一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤四中的western-blot鉴定表达产物是通过以下方法鉴定：使用western-blot对SCK6-EMIMP1C表达的EMIMP1C蛋白进行进一步鉴定，一抗为EMIMP1C多克隆鸡血清，经鉴定SCK6-EMIMP1C表达的EMIMP1C蛋白可与EMIMP1C原核表达刺激产生的抗体进行免疫反应。
9.根据权利要求1所述的一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗的制备方法，其特征在于：所述培养基盖(2)的前后表面均设置有抬动圆柱架(6)，且抬动圆柱架(6)与培养基盖(2)为一体结构。
10.根据权利要求1所述的一种鸡抗巨型艾美耳球虫口服重组芽孢疫苗的制备方法，其特征在于：所述第一进料管(3)和第二进料管(4)的外壁均设置有密封塞槽(10)，且密封塞槽(10)贯穿第一进料管(3)和第二进料管(4)的管壁，所述第一进料管(3)和第二进料管(4)的内壁均设置有连接槽(11)，且连接槽(11)与密封塞(5)的一端相匹配。
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| CN116254214A (zh) * | 2022-12-29 | 2023-06-13 | 佛山科学技术学院 | 一种枯草芽孢杆菌重组菌株及其制备方法和应用 |
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