CN115197310A

CN115197310A - 一种可分泌抗菌肽的功能型益生菌及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN115197310A
Application number: CN202210581290.8A
Authority: CN
Inventors: 肖爱波; 王虎; 张晓娟; 廉维江
Original assignee: Dalian Huapeptide Biotechnology Co ltd
Current assignee: Dalian Huapeptide Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-05-26
Filing date: 2022-05-26
Publication date: 2022-10-18

Abstract

本发明公开了一种可分泌抗菌肽的功能型益生菌及其制备方法与应用。本发明公开的可分泌抗菌肽的功能型益生菌可分泌氨基酸序列是序列4的多肽，该抗菌肽在低温下无抗菌活性，在37℃恢复抗菌活性。给断奶仔猪每日口服本发明的功能型益生菌可提升仔猪存活率14％，降低腹泻发生率12.5％；给肉鸡每日口服本发明的功能型益生菌可增重4.2％，存活率增加1.7％，料肉比下降7.9％。本发明的功能型益生菌与抗菌肽可用于畜禽的辅助养殖，有效降低发病率，降低生产成本，提升欧洲效益指数。因此，本发明彻底突破了抗菌肽难以发酵生产的技术难题，为抗菌肽的产业化奠定了基础，具有很好的应用前景。

Description

一种可分泌抗菌肽的功能型益生菌及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种可分泌抗菌肽的功能型益生菌及其制备方法与应用。

背景技术

随着我国养殖业的快速发展，畜禽的疫病防控一直是养殖过程中需要面对的问题。为了降低动物的发病率，大量抗生素被用于畜禽的防病治病。中国每年生产抗生素原料大约21万吨，其中有9.7万吨抗生素用于畜牧养殖业。动物长期食用后，抗生素会在动物体内蓄积，从而带来严重的食品安全问题，给人体健康带来危害。而且，由于抗生素滥用，导致细菌的加速进化，不断出现可以抵抗多种抗生素的“超级细菌”，严重干扰了我国的医疗卫生防控体系。为了有效提升我国人民的食品安全水平，农业部于2020年7月1日发布194号公告，禁止抗生素用于畜禽的养殖。但这带来了一个新问题，没有抗生素的辅助，畜禽发病率会上升，从而提高养殖成本，并最终导致畜禽产品的价格上升。因此，开发可以替代抗生素的抗菌产品变得尤为迫切。

抗菌肽广泛分布于自然界各种生物体中，是生物抵御病原菌侵入的第一道防线，在先天免疫反应中起着重要作用。抗菌肽具有较强热稳定性及广谱性杀菌作用，是目前最有潜力的替代抗生素的产品。尽管抗菌肽具有良好的安全性和抗菌能力，但一直难以实现对其规模化生产。研究人员最初尝试用大肠杆菌表达系统制备抗菌肽，但都以失败告终。其原因是抗菌肽会直接杀死用于表达的工程宿主菌，导致菌体无法繁殖。后有研究者尝试用昆虫细胞表达抗菌肽，尽管昆虫细胞可以实现有活性抗菌肽的表达，但由于成本过高，无法实现产业化。

枯草芽孢杆菌是一种广泛存在于土壤、植物中的革兰氏阳性细菌，其不分泌外毒素、内毒素，属于食品级安全微生物。由于其属于肠道益生菌，目前已被广泛应用于人用微生态制剂以及动物饲料添加剂中。枯草芽孢杆菌可以将蛋白高效分泌到细胞外，基于这一特性，研究人员将外源基因转入枯草芽孢杆菌，实现了多个目标蛋白的高效分泌表达，如淀粉酶、木聚糖酶、多糖单加氧酶等。另外，由于枯草芽孢杆菌具有良好的安全性和高效表达外源基因的特性，有研究人员进一步尝试将抗菌肽基因转入枯草芽孢杆菌，期望实现抗菌肽的表达，从而获得具有抗菌能力的功能性益生菌。但在实际操作中发现由于抗菌肽的抗菌特性，其对宿主菌存在毒性，导致含有抗菌肽基因的枯草芽孢杆菌难以生长，即使延长培养时间，获得的少量菌液也是丢失了抗菌肽基因的无效菌种。因此，采用枯草芽孢杆菌表达抗菌肽这一技术路线始终无法实现突破。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种抗菌活性的功能性益生菌及其制备方法与应用。

本发明首先提供了一种蛋白质，其名称为Cecropin-mut，为A1)或A2)：

A1)氨基酸序列是序列4的蛋白质；

A2)在A1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

本发明还提供了与Cecropin-mut相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B5)中的任一种：

B1)编码Cecropin-mut的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系、或含有B2)所述表达盒的细胞系。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码Cecropin-mut蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的Cecropin-mut蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码Cecropin-mut蛋白质且具有Cecropin-mut蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)：

b11)编码序列是序列表中序列4的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列4所示的DNA分子；

b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码Cecropin-mut的cDNA分子或DNA分子；

b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码Cecropin-mut的cDNA分子或DNA分子；

B3)所述重组载体为将编码Cecropin-mut的核酸分子导入表达载体得到的能够表达Cecropin-mut的重组表达载体；

B4)所述重组微生物为将编码Cecropin-mut的核酸分子导入出发微生物得到的能够表达Cecropin-mut的重组微生物。

B4)所述重组微生物可将B3)所述重组载体导入所述出发微生物中得到。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述生物材料中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码Cecropin-mut蛋白质的核酸分子的表达盒(Cecropin-mut基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达Cecropin-mut蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动Cecropin-mut基因转录的启动子，还可包括终止Cecropin-mut基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有所述Cecropin-mut基因表达盒的重组载体。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为枯草芽孢杆菌分泌表达载体，如pWB980。

B3)所述重组载体具体可为pWB980/Cecropin。所述pWB980/Cecropin为将pWB980载体的HindIII和NheI识别序列间的DNA片段替换为序列3所示的DNA片段得到的重组载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为枯草芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌WB600或WB800菌株。

B4)所述重组微生物具体可为WB600/pWB980/Cecropin，WB600/pWB980/Cecropin为将pWB980/Cecropin导入枯草芽孢杆菌WB600菌株得到的重组菌株。

上述生物材料中，所述细胞系不包括繁殖材料。

本发明还提供了制备重组微生物的方法，所述方法包括：将含有编码Cecropin-mut的核酸分子的表达盒或含有所述表达盒的重组表达载体导入出发微生物中，得到重组微生物。

所述微生物可为枯草芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌WB600或WB800菌株。

本发明还提供了制备Cecropin-mut的方法，所述方法包括：培养利用所述制备重组微生物的方法得到的重组微生物，得到Cecropin-mut。

Cecropin-mut或所述生物材料的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：

X1)饲养动物；

X2)提高动物成活率；

X3)提高动物免疫力；

X4)降低动物腹泻；

X5)促进动物生长；

X6)降低动物料肉比；

X7)提高动物欧洲效益指数；

X8)制备饲养动物产品；

X9)制备提高动物成活率产品；

X10)制备提高动物免疫力产品；

X11)制备降低动物腹泻产品；

X12)制备促进动物生长产品；

X13)制备降低动物料肉比产品；

X14)提高动物欧洲效益指数产品。

上述应用中，所述动物可为哺乳动物或家禽(如鸡)或家畜(如猪)。

本发明还提供了一种动物饲养方法，所述方法包括：将Cecropin-mut或所述生物材料作为饲料添加物添加至动物饲料中，得到混合饲料，利用所述混合饲料饲喂动物进行动物的饲养。

上述方法中，所述动物可为哺乳动物或家禽(如鸡)或家畜(如猪)。

一种含有Cecropin-mut或所述生物材料的动物饲料，也属于本发明的保护范围。

本发明获得了一种在28℃以下无抗菌活性，而在37℃恢复抗菌活性的改良型抗菌肽Cecropin-mut。与传统抗菌肽相比，含有该改良型抗菌肽基因的枯草芽孢菌株可以在28℃以下实现高密度发酵培养，同时高效表达抗菌肽。由于表达的抗菌肽在低温下无抗菌活性，因此不会抑制菌种的繁殖。当发酵完成后，将发酵液恢复至37℃，抗菌肽恢复抗菌活性，从而可实现高密度发酵，适合规模化生产。给断奶仔猪每日口服该益生菌可提升仔猪存活率14％，降低腹泻发生率12.5％；给肉鸡每日口服该益生菌可增重4.2％，存活率增加1.7％，料肉比下降7.9％。该益生菌可用于畜禽的辅助养殖，有效降低发病率，降低生产成本，提升欧洲效益指数。因此，本发明彻底突破了抗菌肽难以发酵生产的技术难题，为抗菌肽的产业化奠定了基础，具有很好的应用前景。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的PWB980质粒和枯草芽孢杆菌WB600菌株记载于文献“木聚糖酶xynZF 318在枯草芽孢杆菌WB600中的表达及发酵条件优化，食品工业科技，2020”中。

实施例1、温度敏感性抗菌肽的定向进化筛选

1、对黑水牤抗菌肽基因Cecropin进行优化，并且引入随机突变，得到含黑水牤抗菌肽随机突变基因。

基因优化后的野生型黑水牤抗菌肽基因如序列表的序列1所示，编码序列表的序列2所示的蛋白质。

2、将步骤1得到的黑水牤抗菌肽突变基因插入枯草芽孢杆菌分泌表达载体pWB980(北京天恩泽基因科技有限公司，货号：60908-6945y)的HindIII和NheI酶切位点之间(即将pWB980的HindIII和NheI识别序列间的DNA片段替换为黑水牤抗菌肽突变基因)，得到包含黑水牤抗菌肽突变基因的表达载体，命名为pWB980/Cecropin。

3、将步骤2得到的包含黑水牤抗菌肽突变基因的表达载体电转化枯草芽孢杆菌WB600(北京天恩泽基因科技有限公司，货号：12-210y)，电转条件：2.5毫秒，1.5千伏，将电转的菌液涂含100微克/毫升卡那霉素(华北制药)的LB平板；28摄氏度培养36小时。

4、挑取单菌落，平行点种在两块无抗LB平板上，即单个菌落分别点种在两块平板上，两块平板的菌落位置一一对应；

5、将两块点种后的平板分别放置28℃和37℃培养24小时；

6、选择28℃菌体增殖，而37℃菌体未出现增殖的菌落，即为表达温度敏感性抗菌肽的菌落；

7、将表达温度敏感性抗菌肽菌落接种0.5毫升LB液体培养基，28℃培养36小时；

8、将能够在28℃增殖的菌液加入已涂布大肠杆菌DH5α的平板点样孔中，37℃培养15小时；将存在抑菌圈的菌液稀释10倍后进一步进行抑菌圈的确认；

9、将确认的阳性菌株提取质粒，测序，分析抗菌肽编码核酸序列；

10、经过多轮筛选，最终从约30万个单菌落中得到7株可在28℃有效增殖，在37℃低效增殖的表达温度敏感性抗菌肽菌株，经过测序比对，与抗菌肽蛋白的氨基酸序列相比，突变蛋白的氨基酸序列存在4个点突变(K₄-H，V₁₀-L，Q₃₀-N，L₃₅-V)。将其命名为Cecropin-mut，其序列如序列表的序列4所示，由编码序列表的序列3所示的DNA序列编码。将表达Cecropin-mut的菌株记为WB600/pWB980/Cecropin。WB600/pWB980/Cecropin含有pWB980/Cecropin-mut，pWB980/Cecropin-mut为将枯草芽孢杆菌分泌表达载体pWB980的HindIII和NheI识别序列间的DNA片段替换为序列3所示的DNA片段得到的重组载体。

实施例2、温度敏感性抗菌肽的鉴定

1、将实施例1得到的表达Cecropin-mut的菌种(WB600/pWB980/Cecropin)在LB培养基中28℃培养72小时，4000g离心30分钟，收集上清，采用0.22微米滤径滤器过滤培养上清，用截留分子量为10kD超滤管对上清进行超滤浓缩，收集上部浓缩多肽溶液。

2、将收集的上清液过凝胶过滤层析柱(Sephadex G-25F，GElife)，用50mM磷酸盐缓冲液(PH7.4)以1毫升/分钟流速流经层析柱，收集目标多肽。采用紫外分光光度计对多肽进行浓度标定。

3、委托康龙化成有限公司化学合成野生型Cecropin多肽，多肽序列同序列2，其DNA编码序列为序列1。

4、分别将野生型Cecropin合成多肽和筛选获得的改良型Cecropin-mut进行梯度稀释，加入涂布大肠杆菌DH5α的平板点样孔中，同时将氨苄青霉素(华北制药)设为阳性对照，分别在28℃或37℃培养24小时，观察抑菌圈。将可形成抑菌圈的最低浓度定为最低抑菌浓度。结果显示，28℃条件下，野生型Cecropin合成多肽和氨苄青霉素均形成抑菌圈，而筛选获得的改良型多肽Cecropin-mut则仅表现出极微弱的抑菌效果；而37℃条件下，野生型Cecropin合成多肽和改良型多肽Cecropin-mut的最低抑菌浓度均为9微克/毫升，氨苄青霉素最低抑菌浓度为35微克/毫升。这些结果可以证明筛选获得改良型多肽Cecropin-mut存在温度敏感特性，在28℃其抗菌能力被抑制，在37℃可恢复期抗菌能力。而且，通过枯草芽孢杆菌表达获得的抗菌肽与化学合成获得的抗菌肽具有同等灭活效力，而且最低抑菌浓度比氨苄青霉素更低。

实施例3、功能型益生菌的制备

一、免疫方案

将实施例1的枯草芽孢杆菌WB600/pWB980/Cecropin用LB液体培养基28℃培养12-15小时，按照1:100比例接种发酵培养基(蔗糖20克/升，硫酸铵5克/升，麸皮50克/升，柠檬酸三钠2.5克/升，磷酸氢二钾0.3克/升，硫酸镁0.2克/升，硫酸铁0.02克/升，PH 7.2)，并按照1:2000比例加入消泡剂。通过氨水调节PH值，28摄氏度发酵35小时。收集菌体，采用喷雾干燥机对菌体进行干燥，获得干菌粉。对菌粉进行标定，确认每克菌粉活菌含量不低于10¹¹个。

实施例4、功能型益生菌提升仔猪存活率

辽宁省某种猪场，经常发生仔猪腹泻，导致仔猪存活率为78％。选取2541头30日龄断奶猪仔，平均体重5公斤，随机分成两组，试验组1015头，对照组1526头。在试验组断奶仔猪饲料中添加功能型益生菌，每吨饲料添加100克实施例3的干菌粉，连续使用1个月。1015只断奶仔猪(试验组)出现117例腹泻病例，最终存活977只，成活率96.3％，日增重0.51公斤。未使用实施例3的干菌粉的1526只断奶仔猪(对照组)有266例出现腹泻症状，最终存活1256只，存活率为82.3％，日增重0.45公斤。试验组与对照组饲喂食物仅在于实验组含有实施例3的干菌粉，对照组不含实施例3的干菌粉。

对数据进行非配对t检验分析，P＜0.05，对照组与试验组结果差异显著。结果如表1所示，实施例3的干菌粉使用提升仔猪存活率14％，而且有效减少了腹泻的发生，腹泻发生率降低12.5％，实施例3的干菌粉还可以提高猪仔的日增重。实施例3的可作为功能型益生菌用于提升仔猪存活率与体重，降低腹泻率。

表1：断奶仔猪各项技术指标

实施例5、功能型益生菌有效降低肉鸡料肉比

山东某肉鸡场，从养殖到出栏，在1万羽白羽肉鸡饲料中添加实施例3的干菌粉，每吨饲料添加100克，作为益生菌组。另有2万羽肉鸡未添加实施例3的干菌粉，作为对照组。试验前两组的7日龄仔鸡平均体重40克，两组随机分组。出栏前对两组肉鸡的体重、存活率、料肉比和欧洲效益指数进行分析，结果如表2所示。益生菌组平均体重增加4.2％，存活率增加1.7％，料肉比下降7.9％，总体欧洲效益指数得到明显提升，另外整个试验过程总体腹泻率明显低于对照组，粪便成型更好。对所有数据进行非配对t检验分析，P＜0.05，对照组与试验组结果差异显著。

表2：肉鸡各项技术指标

组别	出栏天数	体重(公斤)	料肉比	存活率(％)	欧洲效益指数	腹泻率(％)
							益生菌组	40	2.95	1.52	99.28	482	2.35
对照组	40	2.83	1.65	97.62	416	4.67

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110>大连华肽生物科技有限公司

<120>一种可分泌抗菌肽的功能型益生菌及其制备方法与应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

ggttggtgga aacgcgtttt caaaccggtg gaaaaactgg gtcagcgcgt tcgtgatgct 60

ggtattcagg gcctggaaat tgcacagcag ggcgccaatg ttctggcaac cgctcgcggt 120

ggcccgccgc agcagggcta a 141

<210> 2

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

Gly Trp Trp Lys Arg Val Phe Lys Pro Val Glu Lys Leu Gly Gln Arg

1 5 10 15

Val Arg Asp Ala Gly Ile Gln Gly Leu Glu Ile Ala Gln Gln Gly Ala

20 25 30

Asn Val Leu Ala Thr Ala Arg Gly Gly Pro Pro Gln Gln Gly

35 40 45

<210> 3

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

ggttggtggc atcgtgtttt taaaccgctg gaaaaactgg gccagcgcgt ccgtgatgct 60

ggtattcagg gtctggaaat cgcccagaat ggtgcaaacg ttgtggcgac cgctcgtggc 120

ggtccgccgc agcagggtta a 141

<210> 4

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

Gly Trp Trp His Arg Val Phe Lys Pro Leu Glu Lys Leu Gly Gln Arg

1 5 10 15

Val Arg Asp Ala Gly Ile Gln Gly Leu Glu Ile Ala Gln Asn Gly Ala

20 25 30

Asn Val Val Ala Thr Ala Arg Gly Gly Pro Pro Gln Gln Gly

35 40 45

Claims

1.蛋白质，为A1)或A2)：

A1)氨基酸序列是序列4的蛋白质；

A2)在A1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B5)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)或b13)或b14)：

b11)编码序列是序列表中序列4的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列4所示的DNA分子；

b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；

b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；

B3)所述重组载体为将编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子导入表达载体得到的能够表达权利要求1所述蛋白质的重组表达载体；

B4)所述重组微生物为将编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子导入出发微生物得到的能够表达权利要求1所述蛋白质的重组微生物。

4.根据权利要求2或3所述的生物材料，其特征在于：所述微生物为枯草芽孢杆菌。

5.制备重组微生物的方法，包括：将含有编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子的表达盒或含有所述表达盒的重组表达载体导入出发微生物中，得到重组微生物。

6.制备权利要求1所述蛋白质的方法，包括：培养利用权利要求5所述方法得到的重组微生物，得到权利要求1所述蛋白质。

7.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2-4中任一所述生物材料的下述任一应用：

X1)饲养动物；

X2)提高动物成活率；

X3)提高动物免疫力；

X4)降低动物腹泻；

X5)促进动物生长；

X6)降低动物料肉比；

X7)提高动物欧洲效益指数；

X8)制备饲养动物产品；

X9)制备提高动物成活率产品；

X10)制备提高动物免疫力产品；

X11)制备降低动物腹泻产品；

X12)制备促进动物生长产品；

X13)制备降低动物料肉比产品；

X14)提高动物欧洲效益指数产品。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述动物为哺乳动物或家禽或家畜。

9.一种动物饲养方法，包括：将权利要求1所述的蛋白质或权利要求2-4中任一所述生物材料作为饲料添加物添加至动物饲料中，得到混合饲料，利用所述混合饲料饲喂动物进行动物的饲养。

10.一种含有权利要求1所述的蛋白质或权利要求2-4中任一所述生物材料的动物饲料。