CN115175899A - 使用cdk12/13抑制剂治疗癌症 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于治疗三阴性乳腺癌、卵巢癌和去势抵抗性前列腺癌的组合物和方法。所述组合物包含CDK12/13抑制剂。

Description

使用CDK12/13抑制剂治疗癌症

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年12月31日提交的美国临时专利申请第62/956,114号的权益，该临时申请的全部内容通过引用并入本文。

发明内容

本文提供了用于治疗癌症的组合物和方法。适用于本文所公开的方法的癌症类型包括但不限于三阴性乳腺癌、卵巢癌和去势抵抗性前列腺癌。用于本文所公开的治疗癌症的方法的组合物包含本文所述的杂环CDK12/13抑制剂。

一个实施方案提供了一种治疗有需要的个体中的三阴性乳腺癌的方法，包括向个体施用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中式(I)的化合物具有以下结构：

其中，

R为氢或C1-C3烷基；

R³选自氢、卤素、-CN和任选取代的C1-C3烷基；

R⁴选自卤素、-CN、任选取代的烷基、任选取代的氟烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基；且

R⁵为氢或任选取代的烷氧基。

一个实施方案提供了一种治疗有需要的个体中的卵巢癌的方法，包括向个体施用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中式(I)的化合物具有以下结构：

其中，

R为氢或C1-C3烷基；

R³选自氢、卤素、-CN和任选取代的C1-C3烷基；

R⁴选自卤素、-CN、任选取代的烷基、任选取代的氟烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基；且

R⁵为氢或任选取代的烷氧基。

一个实施方案提供了一种治疗有需要的个体中的去势抵抗性前列腺癌的方法，包括向个体施用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中式(I)的化合物具有以下结构：

其中，

R为氢或C1-C3烷基；

R³选自氢、卤素、-CN和任选取代的C1-C3烷基；

R⁴选自卤素、-CN、任选取代的烷基、任选取代的氟烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基；且

R⁵为氢或任选取代的烷氧基。

附图说明

图1显示了用化合物4治疗的三阴性乳腺癌小鼠异种移植模型中随时间变化的肿瘤体积。

图2显示了用化合物4治疗的卵巢癌小鼠异种移植模型中随时间变化的肿瘤体积。

图3A和图3B描述了体外分析RNA II磷酸化的抑制期间THZ531和化合物1的剂量-反应曲线。

图4描述了用化合物4和化合物5治疗的鼠三阴性乳腺癌异种移植模型中RNA II磷酸化水平的变化。

图5描述了化合物1和化合物4在人和食蟹猴外周血单核细胞(PBMC)中的剂量-反应曲线。

图6描述了在三阴性乳腺癌细胞系中分析化合物1时BRCA1表达水平的变化。

图7描述了用化合物4治疗的鼠三阴性乳腺癌异种移植模型中BRCA1表达水平的变化。

援引并入

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用方式并入本文，以用于本文确定的特定目的。

具体实施方式

特定术语

如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该/所述(the)”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一个/种试剂”包括多个/种这样的试剂，提及“该/所述细胞”包括提及本领域技术人员已知的一个或多个细胞(或提及多个细胞)及其等价物等。当范围在本文中用于物理性质，例如分子量，或化学性质，例如化学式时，旨在包括其中范围以及特定实施方案的所有组合和子组合。当提及数字或数值范围时，术语“约”是指所指的数字或数值范围是实验变异性(或统计实验误差)内的近似值，因此在一些情况下，数字或数值范围将在规定的数字或数值范围的1％至15％变化。术语“包含(comprising)”(以及相关术语，例如“包含(comprise)”或“包含(comprises)”或“具有(having)”或“包括(including)”)并非旨在排除在其他某些实施方案中，例如，在本文描述的任何物质组合物、组合物、方法或过程等的实施方案“由所描述的特征组成”或“基本上由所描述的特征组成”。

如在说明书和所附权利要求中使用的，除非另有说明，否则以下术语具有如下所示的含义。

“氰基”是指-CN基团。

“烷基”是指仅由碳原子和氢原子组成的直链或支链烃链基团，不含不饱和度，具有一至十五个碳原子(例如C₁-C₁₅烷基)。在某些实施方案中，烷基包含一至十三个碳原子(例如，C₁-C₁₃烷基)。在某些实施方案中，烷基包含一至八个碳原子(例如，C₁-C₈烷基)。在其他实施方案中，烷基包含一至五个碳原子(例如，C₁-C₅烷基)。在其他实施方案中，烷基包含一至四个碳原子(例如，C₁-C₄烷基)。在其他实施方案中，烷基包含一至三个碳原子(例如，C₁-C₃烷基)。在其他实施方案中，烷基包含一至两个碳原子(例如，C₁-C₂烷基)。在其他实施方案中，烷基包含一个碳原子(例如，C₁烷基)。在其他实施方案中，烷基包含五至十五个碳原子(例如，C₅-C₁₅烷基)。在其他实施方案中，烷基包含五至八个碳原子(例如，C₅-C₈烷基)。在其他实施方案中，烷基包含二至五个碳原子(例如，C₂-C₅烷基)。在其他实施方案中，烷基包含三至五个碳原子(例如，C₃-C₅烷基)。在其他实施方案中，烷基基团选自甲基、乙基、1-丙基(正丙基)、1-甲基乙基(异丙基)、1-丁基(正丁基)、1-甲基丙基(仲丁基)、2-甲基丙基(异丁基)、1,1二甲基乙基(叔丁基)、1-戊基(正戊基)。烷基通过单键连接分子的其余部分。除非说明书中另有特别说明，否则烷基任选地由一个或多个以下取代基取代：卤代、氰基、硝基、氧代、硫代、亚氨基、肟基、三甲基硅烷基、-OR^a、-SR^a、-OC(O)-R^a、-N(R^a)₂、-C(O)R^a、-C(O)OR^a、-C(O)N(R^a)₂、-N(R^a)C(O)OR^a、-OC(O)-N(R^a)₂、-N(R^a)C(O)R^a、-N(R^a)S(O)_tR^a(其中t为1或2)、-S(O)_tOR^a(其中t为1或2)、-S(O)_tR^a(其中t为1或2)和-S(O)_tN(R^a)₂(其中t为1或2)，其中每个R^a独立地为氢、烷基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、氟烷基、碳环基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、碳环基烷基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、芳基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、芳烷基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、杂环基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、杂环基烷基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、杂芳基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、或杂芳基烷基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)。

“烷氧基”是指式-O-烷基的通过氧原子键合的基团，其中烷基为上文定义的烷基链。

“烯基”是指仅由碳原子和氢原子组成的直链或支链烃链基团基团，含有至少一个碳-碳双键，并具有2至12个碳原子。在某些实施方案中，烯基包含二至八个碳原子。在其他实施方案中，烯基包含二至四个碳原子。烯基通过单键连接分子的其余部分，例如，乙烯基(ethenyl)(即乙烯基(vinyl))、丙-1-烯基(即烯丙基)、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基等。除非说明书中另有特别说明，否则烯基基团任选地由一个或多个以下取代基取代：卤代、氰基、硝基、氧代、硫代、亚氨基、肟基、三甲基硅烷基、-OR^a、-SR^a、-OC(O)-R^a、-N(R^a)₂、-C(O)R^a、-C(O)OR^a、-C(O)N(R^a)₂、-N(R^a)C(O)OR^a、-OC(O)-N(R^a)₂、-N(R^a)C(O)R^a、-N(R^a)S(O)_tR^a(其中t为1或2)、-S(O)_tOR^a(其中t为1或2)、-S(O)_tR^a(其中t为1或2)和-S(O)_tN(R^a)₂(其中t为1或2)，其中每个R^a独立地为氢、烷基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、氟烷基、碳环基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、碳环基烷基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、芳基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、芳烷基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、杂环基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、杂环基烷基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、杂芳基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、或杂芳基烷基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)。

“炔基”是指仅由碳原子和氢原子组成的直链或支链烃链基团基团，含有至少一个碳-碳三键，并具有二至十二个碳原子。在某些实施方案中，炔基包含二至八个碳原子。在其他实施方案中，炔基包含二至六个碳原子。在其他实施方案中，炔基包含二至四个碳原子。炔基通过单键连接分子的其余部分，例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。除非说明书中另有特别说明，否则炔基基团任选地由一个或多个以下取代基取代：卤代、氰基、硝基、氧代、硫代、亚氨基、肟基、三甲基硅烷基、-OR^a、-SR^a、-OC(O)-R^a、-N(R^a)₂、-C(O)R^a、-C(O)OR^a、-C(O)N(R^a)₂、-N(R^a)C(O)OR^a、-OC(O)-N(R^a)₂、-N(R^a)C(O)R^a、-N(R^a)S(O)_tR^a(其中t为1或2)、-S(O)_tOR^a(其中t为1或2)、-S(O)_tR^a(其中t为1或2)和-S(O)_tN(R^a)₂(其中t为1或2)，其中每个R^a独立地为氢、烷基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、氟烷基、碳环基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、碳环基烷基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、芳基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、芳烷基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、杂环基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、杂环基烷基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、杂芳基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)、或杂芳基烷基(任选地被卤素、羟基、甲氧基或三氟甲基取代)。

“卤代”或“卤素”是指溴、氯、氟或碘取代基。

“氟烷基”是指由一个或多个如上文所定义的氟基团取代的如上文所定义的烷基基团，例如，三氟甲基、二氟甲基、氟甲基、2,2,2-三氟乙基、1-氟甲基-2-氟乙基等。在一些实施方案中，氟烷基基团的烷基部分任选地如上文定义的烷基那样取代。

在一些实施方案中，本文公开的化合物含有一个或多个不对称中心，因此产生对映异构体、非对映异构体和其他立体异构形式，根据绝对立体化学定义为(R)或(S)。除非另有说明，否则本公开旨在涵盖本文公开的化合物的所有立体异构形式。当本文所述的化合物含有烯烃双键时，除非另有说明，否则本公开旨在包括E和Z几何异构体(例如，顺式或反式)。同样，所有可能的异构体，以及它们的外消旋和光学纯形式，以及所有互变异构形式也旨在包括在内。术语“几何异构体”是指烯烃双键的E或Z几何异构体(例如，顺式或反式)。术语“位置异构体”是指围绕中心环的结构异构体，例如围绕苯环的邻位异构体、间位异构体和对位异构体。

“互变异构体”是指质子可能从分子的一个原子转移到同一分子的另一个原子的分子。在某些实施方案中，本文所示化合物作为互变异构体存在。在可能发生互变异构化的情况中，将存在互变异构体的化学平衡。互变异构体的确切比例取决于几个因素，包括物理状态、温度、溶剂和pH。互变异构平衡的一些实例包括：

在一些实施方案中，本文所公开的化合物以不同的富集同位素形式(例如，富集²H、³H、¹¹C、¹³C和/或¹⁴C的含量)使用。在一个特定实施方案中，化合物在至少一个位置被氘化。此类氘化形式可以通过美国专利号5,846,514和6,334,997中描述的程序制备。如美国专利号5,846,514和6,334,997所述，氘化可以提高代谢稳定性和或功效，从而增加药物的作用持续时间。

除非另有说明，否则本文描述的结构旨在包括仅在一个或多个同位素富集原子的存在方面具有差异的化合物。例如，除了氢被氘或氚取代、或碳被¹³C-或¹⁴C-富集的碳取代之外具有本公开结构的化合物在本公开的范围内。

本公开的化合物任选地在构成此类化合物的一个或多个原子处含有非天然比例的原子同位素。例如，化合物可以用同位素标记，诸如例如氘(²H)、氚(³H)、碘-125(¹²⁵I)或碳14(¹⁴C)。用²H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹⁵C、¹²N、¹³N、¹⁵N、¹⁶N、¹⁶O、¹⁷O、¹⁴F、¹⁵F、¹⁶F、¹⁷F、¹⁸F、³³S、³⁴S、³⁵S、³⁶S、³⁵Cl、³⁷Cl、⁷⁹Br、⁸¹Br和¹²⁵I的同位素取代都被考虑。在一些实施方案中，考虑用¹⁸F的同位素取代。本发明化合物的所有同位素变体，无论是否具有放射性，均包含在本发明的范围内。

在某些实施方案中，本文公开的化合物具有被²H原子取代的一些或所有¹H原子。含氘的化合物的合成方法是本领域已知的，并且仅通过非限制性示例包括以下合成方法。

使用各种方法合成氘取代的化合物，如在：Dean,Dennis C.；编著.RecentAdvances in the Synthesis and Applications of Radiolabeled Compounds for DrugDiscovery and Development.[Curr.,Pharm.Des.,2000；6(10)]2000,110pp；George W.；Varma,Rajender S.The Synthesis of Radiolabeled Compounds via OrganometallicIntermediates,Tetrahedron,1989,45(21),6601-21；以及Evans,E.Anthony.Synthesisof radiolabeled compounds,J.Radioanal.Chem.,1981,64(1-2),9-32中所描述的方法。

氘化起始材料容易获得，并且经受本文所述的合成方法来提供含氘化合物的合成。大量含氘试剂和结构单元可从化学供应商(如Aldrich Chemical Co.)商购。

适于在亲核取代反应中使用的氘转移试剂，例如碘甲烷-d₃(CD₃I)容易获得，并且可用于在亲核取代反应条件下将氘取代的碳原子转移到反应底物。以下反应方案仅举例示出了CD₃I的使用。

氘转移试剂，例如氘化锂铝(LiAlD₄)，用于在还原条件下将氘转移到反应底物。以下反应方案仅举例示出了LiAlD₄的使用。

使用氘气和钯催化剂来还原不饱和碳-碳键，并进行芳基碳-卤素键的还原取代，如以下反应方案中仅作为示例所示。

在一个实施方案中，本文公开的化合物含有一个氘原子。在另一个实施方案中，本文公开的化合物含有两个氘原子。在另一个实施方案中，本文公开的化合物含有三个氘原子。在另一个实施方案中，本文公开的化合物含有四个氘原子。在另一个实施方案中，本文公开的化合物含有五个氘原子。在另一个实施方案中，本文公开的化合物含有六个氘原子。在另一个实施方案中，本文公开的化合物含有多于六个氘原子。在另一个实施方案中，本文公开的化合物被氘原子完全取代并且不含有不可交换的¹H氢原子。在一个实施方案中，氘掺入水平通过合成方法确定，其中氘化合成结构单元用作起始材料。

“药学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐二者。本文所述的任何一种细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)抑制剂化合物的药学上可接受的盐旨在包含任何和所有药学上合适的盐形式。本文所述的化合物的优选药学上可接受的盐为药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐。

“药学上可接受的酸加成盐”是指保留游离碱的生物有效性和性质的那些盐，其在生物学上或其他方面不是不期望的，并且由无机酸形成，所述无机酸为例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢碘酸、氢氟酸、亚磷酸等。还包括由有机酸形成的盐，所述有机酸为例如脂肪族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、链烷二酸、芳族酸、脂肪族和芳族磺酸等，并且包括例如，乙酸、三氟乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。因此，示例性盐包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、一氢磷酸盐、二氢磷酸盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、异丁酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、甲烷磺酸盐等。还考虑了氨基酸的盐，如精氨酸盐、葡糖酸盐和半乳糖醛酸盐(参见例如，Berge S.M.等人，"Pharmaceutical Salts,"Journal of Pharmaceutical Science,66:1-19(1997))。在一些实施方案中，根据本领域技术人员熟悉的方法和技术，通过将游离碱形式与足量的期望的酸接触以产生盐来制备碱性化合物的酸加成盐。

“药学上可接受的碱加成盐”是指保留游离酸的生物有效性和性质的那些盐，这些盐在生物学上或其他方面不是不期望的。这些盐通过向游离酸中加入无机碱或有机碱来制备。在一些实施方案中，药学上可接受的碱加成盐由金属或胺(例如碱金属和碱土金属或有机胺)形成。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下各项的盐：伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺，包括天然存在的取代的胺、环胺和碱性离子交换树脂，例如，异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、N,N-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、哈胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙二胺、亚乙基二苯胺、N-甲基葡糖胺、氨基葡萄糖、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤类、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、多胺树脂等。参见前述Berge等人，出处同上。

“药学上可接受的溶剂化物”是指作为溶剂添加形式的物质的组合物。在一些实施方案中，溶剂化物含有化学计量或非化学计量量的溶剂，并且在使用药学上可接受的溶剂例如水、乙醇等的制备过程中形成。当溶剂为水时形成水合物，或当溶剂为醇时形成醇化物。本文所述化合物的溶剂化物可在本文所述方法期间方便地制备或形成。本文提供的化合物任选地以非溶剂化和溶剂化形式存在。

术语“对象”或“患者”包括哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于哺乳动物类的任何成员：人、非人灵长类动物(如黑猩猩)以及其他猿类和猴类；农场动物，如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物，如兔子、狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物，如大鼠、小鼠和豚鼠等。在一个方面中，哺乳动物是人。

如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”，或“缓和”或“改善”可互换使用。这些术语是指获得有益或期望结果(包括但不限于治疗益处和/或预防益处)的方法。“治疗益处”是指根除或改善所治疗的潜在病症。此外，随着根除或改善与基础病症相关的一种或多种生理症状来实现治疗益处，使得尽管患者仍患有潜在疾病，但是在患者身上仍观察到改善。为了预防益处，在一些实施方案中，将组合物施用于具有发展特定疾病风险的患者，或施用于报告疾病的一个或多个生理症状的患者，即使尚未对该疾病进行诊断。除非另有说明，否则如本文所用，术语“治疗”是指逆转、缓解、抑制该术语所适用的病症或病况或此类病症或病况的一个或多个症状的进展或对其进行预防。在一些实施方案中，术语“治疗”包括减缓或延迟该术语所适用的疾病或病症的进展。此外，在一些实施方案中，术语“治疗”适用于由该术语所适用的疾病或病症引起的一个或多个并发症。除非另有说明，否则如本文所用，术语“治疗(treatment)”是指上文直接定义的作为“治疗(treating)”的治疗行为。

除非另有规定，否则如本文所用，术语“肿瘤”或“癌症”是指赘生性细胞生长，并且包括癌前和癌性细胞和组织。肿瘤通常表现为病变或肿块。如本文所用，“治疗”肿瘤意指疾病的一个或多个症状，例如肿瘤本身、肿瘤的血管化或表征疾病的其他参数，获得减少、改善、抑制、处于缓解状态或保持在缓解状态。“治疗”肿瘤还意指可以通过治疗消除、减少或预防肿瘤的一个或多个标志。此类标志的非限制性实例包括基膜和近端细胞外基质的不受控制的降解、内皮细胞迁移、分裂和组织成新的功能性毛细血管以及此类功能性毛细血管的持续存在。

如本文所用，短语“治疗有效量”是指将引起研究人员、兽医、医生或其他人员正在寻求的组织、系统、动物或人的生物或医学反应的药物或药剂的量。

从下面的详细描述，本发明的其他方面、优点和特征将变得显而易见。

CDK12/CDK13

细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)家族的成员在增殖中发挥关键调节作用。在细胞核中，CDK12和/或CDK13可帮助形成RNA聚合酶(RNAP)II一般性转录因子复合物的激酶核，并可磷酸化RNAP II的C末端结构域(CTD)的丝氨酸2，这是基因转录起始的必要步骤。CDK12/13的两个功能，即CAK和CTD磷酸化，共同支持细胞增殖、细胞周期和转录的关键方面。已证实RNAP II CTD磷酸化的破坏优先影响半衰期短的蛋白质，包括抗凋亡BCL-2家族的蛋白质。癌细胞已证明能够通过上调BCL-2家族成员来规避前细胞死亡信号传导。因此，抑制人CDK12和/或CDK13激酶活性可能导致癌性细胞的抗增殖活性。

在一些情况下，待治疗或预防的癌症或增殖性疾病通常与CDK12和/或CDK13的异常活性有关。CDK12和/或CDK13的异常活性可能是CDK12和/或CDK13的活性升高和/或不适当(例如异常)。在某些实施方案中，CDK12和/或CDK13未过度表达，并且CDK12和/或CDK13的活性升高和/或不适当。在某些其他实施方案中，CDK12和/或CDK13过度表达，并且CDK12和/或CDK13的活性升高和/或不适当。

增殖性疾病也可能与抑制生物样品或对象中的细胞凋亡有关。本文所述或本领域已知的所有类型的生物样品均被视为在本发明的范围内。抑制CDK12和/或CDK13的活性预期通过诱导细胞凋亡而引起细胞毒性。

杂环CDK12/13抑制剂

在一些实施方案中，本文所述的杂环CDK12/13抑制剂由具有式(I)的结构的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物描述：

其中，

R为氢或C1-C3烷基；

R³选自氢、卤素、-CN和任选取代的C1-C3烷基；

R⁴选自卤素、-CN、任选取代的烷基、任选取代的氟烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基；且

R⁵为氢或任选取代的烷氧基。

在一些实施方案中，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物具有作为氢的R。在一些实施方案中，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐具有作为C1-C3烷基的R。

在一些实施方案中，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物具有作为氢的R³。

在一些实施方案中，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物具有作为-CN、任选取代的烷基、任选取代的氟烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基的R⁴。在一些实施方案中，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物具有作为-CN的R⁴。在一些实施方案中，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物具有作为任选取代的炔基的R⁴。在一些实施方案中，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物具有作为卤素的R⁴。

在一些实施方案中，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物具有作为氢的R⁵。

在具体的实施方案中，本文所述的杂环CDK12/13抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物先前已在PCT专利申请PCT/US2019/039959和相关专利申请中公开，其全部内容通过引用并入。在整个本公开中提及的是特定的杂环CDK12/13抑制剂，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。所述抑制剂的结构如下表1中所提供。

表1

在一些实施方案中，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物为(R)-N-(4-(3-((5-氯-4-甲氧基嘧啶-2-基)氨基)吡咯烷-1-羰基)苯基)丙烯酰胺(化合物1)或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

在一些实施方案中，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物为(R)-N-(4-(3-((5-氯-4-甲氧基嘧啶-2-基)氨基)吡咯烷-1-羰基)苯基)-N-甲基丙烯酰胺(化合物2)或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

在一些实施方案中，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物为(R)-N-(4-(3-((5-氯嘧啶-2-基)氨基)吡咯烷-1-羰基)苯基)丙烯酰胺(化合物3)或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

在一些实施方案中，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物为(R)-N-(4-(3-((5-氰基嘧啶-2-基)氨基)吡咯烷-1-羰基)苯基)丙烯酰胺(化合物4)或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

在一些实施方案中，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物为(R)-N-(4-(3-((5-乙炔基嘧啶-2-基)氨基)吡咯烷-1-羰基)苯基)丙烯酰胺(化合物5)或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

癌症及治疗方法

在某些方面，本文公开了一种治疗有需要的个体中的癌症的方法，包括向个体施用有效量的本文所述的杂环CDK12/13抑制剂。在某些方面，本文公开了用于治疗癌症的杂环CDK12/13抑制剂。在某些方面，本文公开了用于制备用于治疗癌症的药物的杂环CDK12/13抑制剂。

在某些实施方案中，癌症是激素依赖性癌症，例如乳腺癌、前列腺癌或卵巢癌。在某些实施方案中，癌症是乳腺癌、前列腺癌或卵巢癌的激素抵抗型。在某些实施方案中，癌症是乳腺癌。在某些实施方案中，癌症是三阴性乳腺癌(TNBC)。在某些实施方案中，癌症是卵巢癌。在某些实施方案中，癌症是前列腺癌。在某些实施方案中，癌症是去势抵抗性前列腺癌。

癌症可能由肿瘤抑制基因、DNA损伤修复(DDR)基因或与细胞增殖和存活相关的基因的突变引起。肿瘤抑制基因和DDR基因修复受损的DNA并破坏DNA受损的细胞。这些基因的一些实例是BRCA1和BRCA2，以及抗凋亡蛋白如BCL-2和XIAP。BRCA1和BRCA2的突变与激素依赖性癌症高度相关。与增殖相关的基因的过度表达也可能导致癌症。在某些实施方案中，癌症与对BRCA1或BRCA2或DDR基因以及抗凋亡蛋白(例如，BCL-2和/或XIAP)的依赖性相关。在某些实施方案中，癌症与细胞增殖基因的过度表达相关。在某些实施方案中，癌症与MYC(编码调节细胞增殖、分化和存活的转录因子的基因)的过度表达相关。

在一些实施方案中，本文所公开的化合物可用于治疗癌症，所述癌症选自癌，包括乳腺、肝、肺、骨、结肠、肾、膀胱的癌，包括骨肉瘤、高级别浆液性卵巢癌、前列腺癌、未分化甲状腺癌(ATC)、三阴性乳腺癌(TNBC)和具有以下突变的肿瘤：BRCA1/BRCA2或DDR基因突变癌、包含ETS融合的前列腺癌和尤文肉瘤、具有ARID1A突变的癌症和具有SWI/SNF复合突变的癌症、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、宫颈癌、皮肤癌，包括鳞状细胞癌。此外，癌症可选自淋巴系造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴母细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、骨髓瘤、套细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤；髓系造血肿瘤，包括急性和慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征和早幼粒细胞白血病；间叶源性肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；中枢和周围神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；和其他肿瘤，包括精原细胞瘤、黑素瘤、骨肉瘤、畸胎瘤、角化棘皮瘤、着色性干皮病、甲状腺滤泡癌和卡波西氏肉瘤。此外，其中可能涉及CDK12的疾病，包括强直性肌营养不良1型(DM1)、强直性肌营养不良2型、脆性X相关震颤/共济失调综合征、肌萎缩侧索硬化(ALS)和额颞叶痴呆、亨廷顿病样2型、亨廷顿舞蹈症、几种类型的脊髓小脑性共济失调以及脊髓延髓肌肉萎缩症。

三阴性乳腺癌

三阴性乳腺癌(TNBC)是针对雌激素受体、孕激素受体和过量HER2蛋白的检测均呈阴性的癌症。TNBC对激素疗法或靶向HER2蛋白受体的药物无反应。治疗TNBC的靶向药物较少，认为其与其他形式的乳腺癌相比更具侵袭性，且预后更差。在某些方面，本文公开了一种治疗有需要的个体的乳腺癌的方法，包括向个体施用有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在某些方面，本文公开了一种治疗有需要的个体的三阴性乳腺癌的方法，包括向个体施用有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在某些方面，本文公开了一种用于治疗三阴性乳腺癌的式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在某些方面，本文公开了用于制备用于治疗三阴性乳腺癌的药物的式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

TNBC比其他形式的乳腺癌更容易转移。在一些实施方案中，三阴性乳腺癌是转移性三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，三阴性乳腺癌是非转移性三阴性乳腺癌。

乳腺癌可在乳腺内的多个部位开始。导管癌形成于乳管的内壁。乳腺派杰氏病始于乳腺导管，并扩散至乳头和乳晕。血管肉瘤始于血管或淋巴管内壁的细胞。叶状肿瘤在乳腺的结缔组织中发展。基底样癌，类似于乳腺导管内壁的基底细胞，往往是更具侵袭性并且是更高级别的癌症。在一些实施方案中，乳腺癌包括导管癌、乳腺派杰氏病、血管肉瘤、叶状瘤或基底样癌。许多TNBC是“基底样”癌。在一些实施方案中，三阴性乳腺癌包括基底样肿瘤。

具有遗传性BRCA1或BRCA2突变的人更有可能患有TNBC。在一些实施方案中，个体具有BRCA1突变。在一些实施方案中，个体具有BRCA2突变。

卵巢癌

在某些方面，本文公开了一种治疗有需要的个体的卵巢癌的方法，包括向个体施用有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在某些方面，本文公开了一种用于治疗卵巢癌的式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在某些方面，本文公开了用于制备用于治疗卵巢癌的药物的式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在某些实施方案中，卵巢癌包括转移性卵巢癌。在某些实施方案中，卵巢癌包括非转移性卵巢癌。在某些实施方案中，卵巢癌是高级别肿瘤。在某些实施方案中，卵巢癌是复发性卵巢癌。

卵巢癌由卵巢内的多种细胞类型形成。上皮细胞瘤由覆盖卵巢外表面的细胞发展而来。良性上皮细胞瘤包括但不限于浆液性腺瘤、黏液性腺瘤和布伦纳瘤。卵巢肿瘤的最常见的形式是癌性上皮癌。生殖细胞肿瘤由产生卵细胞的细胞发展而来，可以是良性的或者是癌性的。常见的生殖细胞肿瘤的一些实例包括成熟畸胎瘤、无性细胞瘤和内胚窦瘤。间质瘤由卵巢中产生卵巢激素的结缔组织发展而来。卵巢肉瘤在卵巢细胞的结缔组织中发展，并包括腺肉瘤、平滑肌肉瘤和纤维肉瘤。在某些实施方案中，癌症包括卵巢上皮癌、生殖细胞瘤、间质瘤或卵巢肉瘤。在某些实施方案中，卵巢肉瘤是腺肉瘤、平滑肌肉瘤或纤维肉瘤。在某些实施方案中，癌症包括上皮癌。

BRCA1和BRCA2突变增加个体患卵巢癌的风险。在某些实施方案中，个体具有BRCA1突变。在某些实施方案中，个体具有BRCA2突变。

在某些实施方案中，癌症是上皮性卵巢癌。在某些实施方案中，癌症是输卵管癌。在某些实施方案中，癌症是腹膜癌。

去势抵抗性前列腺癌

在某些方面，本文公开了一种治疗有需要的个体的前列腺癌的方法，包括向个体施用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在某些方面，本文公开了一种用于治疗前列腺癌的式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在某些方面，本文公开了用于制备用于治疗前列腺癌的药物的式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。许多早期前列腺癌需要正常水平的睾酮来生长，但去势抵抗性前列腺癌不需要。这限制了可用于治疗的治疗选项。在某些实施方案中，前列腺癌包括去势抵抗性前列腺癌。在某些实施方案中，去势抵抗性前列腺癌包括转移性前列腺癌。在某些实施方案中，去势抵抗性前列腺癌包括非转移性前列腺癌。

前列腺癌可发生在腺体的许多组织中，包括但不限于腺泡状腺癌、导管腺癌、移行细胞癌、鳞状细胞癌、小细胞前列腺癌、神经内分泌癌和肉瘤。大多数前列腺癌是腺癌。在这个亚群中，大多数腺癌是腺泡状腺癌，其形成于腺泡细胞中，这些腺泡细胞形成簇并内衬流体分泌细胞。导管腺癌形成于前列腺管和导管内壁的细胞中。移行细胞癌形成于前列腺周围的结构中，例如内衬尿道和膀胱的细胞中。鳞状细胞癌是罕见的侵袭性形式的前列腺癌，始于覆盖前列腺的扁平细胞。小细胞癌是侵袭性形式的前列腺癌，在神经内分泌系统的小圆形细胞中发展。神经内分泌癌形成于前列腺的神经和腺细胞。肉瘤是罕见形式的前列腺癌，且形成于前列腺的软组织，包括肌肉和神经。前列腺肉瘤可包括平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤。在某些实施方案中，去势抵抗性前列腺癌包括腺泡状腺癌、导管腺癌、移行细胞癌、鳞状细胞癌、小细胞前列腺癌、神经内分泌癌或肉瘤。

BRCA1和BRCA2基因增加个体患前列腺癌的风险。在某些实施方案中，个体具有BRCA1突变。在某些实施方案中，个体具有BRCA2突变。

一个实施方案提供了一种在细胞中诱导凋亡的方法，包括向细胞施用有效量的组合物，该组合物包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

一个实施方案提供了一种用于减少细胞中的细胞增殖的方法，包括向细胞施用有效量的组合物，该组合物包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

疗效生物标志物

监测治疗的有效性可能有用。例如，可以通过监测某些蛋白质的磷酸化状态或某些基因的表达水平来监测治疗的有效性。有关治疗有效性的信息可用于例如确定经治疗的个体的预后或告知继续治疗的决定。

CDK12磷酸化靶标

发现CDK12能磷酸化RPB1的C末端结构域，RPB1是RNA聚合酶II的最大亚基。这种磷酸化在转录、RNA加工和基因组稳定性中发挥重要作用。还发现CDK12能磷酸化MAPK3、SOS1、ARHGAP35、ANKS1A、JANK2、MAPK1、BCAR3、NUP214、TPR、AHNAK、DDX20、PARD2、SEPT7、ADAM17、CLASP2、XPC、POLA1、CTNNA1和ARFIP1。监测癌细胞或个体中CDK12靶标的磷酸化水平可以提供治疗方法疗效的反馈。预计CDK13利用了许多与CDK12相同的磷酸化底物。

在一些实施方案中，本文公开了方法，包括：监测肿瘤(包括但不限于循环肿瘤细胞)和正常组织中的磷酸化的CDK12磷酸化靶标的水平和总CDK12磷酸化靶标的水平；确定两个值的比；以及观察在施用该化合物后，磷酸化的CDK12磷酸化靶标的水平相对于CDK12磷酸化靶标的总水平的下降。在一些实施方案中，本文公开了方法，包括：监测肿瘤中磷酸化的CDK12磷酸化靶标的水平和总CDK12磷酸化靶标的水平；确定两个值的比；以及观察在施用该化合物后，磷酸化的CDK12磷酸化靶标的水平相对于CDK12磷酸化靶标的总水平的下降，其中在施用该化合物后，磷酸化的CDK12磷酸化靶标的水平相对于RNA聚合酶的总水平的下降与治疗的疗效相关。在一些实施方案中，CDK12/13磷酸化靶标选自MAPK3、SOS1、ARHGAP35、ANKS1A、JANK2、MAPK1、BCAR3、NUP214、TPR、AHNAK、DDX20、PARD2、SEPT7、ADAM17、CLASP2、XPC、POLA1、CTNNA1和ARFIP1。在一些实施方案中，CDK12/13磷酸化靶标是RNA聚合酶II。预计CDK13利用了许多与CDK12相同的磷酸化靶标。

在一些实施方案中，本文公开了方法，包括：监测肿瘤中磷酸化的RNA聚合酶II的水平和总RNA聚合酶II的水平；确定两个值的比；以及观察在施用该化合物后，磷酸化的RNA聚合酶II的水平相对于RNA聚合酶II的总水平的下降。在一些实施方案中，本文公开了方法，包括：监测肿瘤中磷酸化的RNA聚合酶II的水平和总RNA聚合酶II的水平；确定两个值的比；以及观察在施用该化合物后，磷酸化的RNA聚合酶II相对于RNA聚合酶II的总水平的下降，其中在施用该化合物后，磷酸化的RNA聚合酶II的水平相对于RNA聚合酶的总水平的下降与治疗的疗效相关。

DNA损伤反应基因

DNA损伤反应(DDR)基因通过调节细胞检查点和DNA修复过程来维持基因组保真度。DDR通过促进细胞周期停滞和DNA修复来检测DNA损伤并触发决定细胞命运的复杂反应，或在其中DNA损伤持续存在且不可调和的情况下触发细胞死亡。许多化疗药物的抗癌活性依赖于DNA双链断裂的诱导，且在DDR蛋白中具有突变的肿瘤对DNA损伤化疗特别敏感。DDR基因的一些实例包括但不限于BRCA1、BRCA2、ATM、ATR、H2AX、RAD51、BCLXL、BCL2MCL1、MYC、B2M、PARP1、PARP2、CHEK1和CHEK2。

CDK12参与调节DDR基因，并且抑制CDK12可导致DDR基因和蛋白质的下调。除了诱导死亡外，监测DDR基因的表达水平还可提供监测施用给个体的CDK12抑制剂的疗效的方法。预计CDK13抑制剂在DDR基因反应方面的表现方式将与CDK12抑制剂类似。

在一些实施方案中，本文公开了方法，包括监测肿瘤和正常组织中DNA损伤反应基因的表达水平；以及观察在施用该化合物后，DNA损伤反应基因表达水平的下降。在一些实施方案中，本文公开了方法，包括监测肿瘤和正常组织中DNA损伤反应基因的表达水平；以及观察施用该化合物后，DNA损伤反应基因表达水平的下降；其中施用该化合物后，DNA损伤反应基因表达水平的下降与治疗的疗效相关。在一些实施方案中，DNA损伤反应基因包含BRCA1、BRCA2、ATM、ATR、H2AX、RAD51、BCLXL、BCL2、MCL1、MYC、B2M、PARP1、PARP2、CHEK1或CHEK2。

在某些实施方案中，通过定量实时PCR(qRT-PCR或qPCR)监测DDR基因的表达水平。在某些实施方案中，通过微阵列分析或“下一代”测序(NGS)技术(包括但不限于RNAseq)监测DDR基因的表达水平。在某些实施方案中，通过不限于NGS技术(例如全基因组测序或外显子组测序)来监测作为肿瘤和正常组织中DDR基因表达变化的函数的DNA损伤水平。

药物组合物

在某些实施方案中，本文所述的杂环CDK12/13抑制剂作为纯化学品施用。在其他实施方案中，本文所述的杂环CDK12/13抑制剂与基于选择的施用途径和标准药物实践选择的药学上合适或可接受的载体(在本文中也称为药学上合适(或可接受)的赋形剂、生理学上合适(或可接受)的赋形剂)或生理学上合适(或可接受)的载体)组合。

本文提供了一种药物组合物，其包含至少一种如本文所述的杂环CDK12/13抑制剂，或其立体异构体、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，以及一种或多种药学上可接受的载体。如果载体与组合物的其他成分相容且对组合物的受体(即，对象或患者)无害，则一种或多种载体(或一种或多种赋形剂)是可接受的或合适的。

一个实施方案提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的赋形剂和式(I)的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

一个实施方案提供了一种制备药物组合物的方法，包括混合式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及药学上可接受的载体。

本文提供了方法，其中口服施用药物组合物。合适的口服剂型包括，例如，片剂、丸剂、囊剂或硬或软明胶、甲基纤维素或容易在消化道中溶解的另一种合适材料的胶囊。在一些实施方案中，使用合适的无毒固体载体，其包括例如药用级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。(参见例如，Remington:TheScience and Practice of Pharmacy(Gennaro,第21版，Mack Pub.Co.,Easton,PA(2005))。

本文提供了方法，其中通过注射施用药物组合物。在一些实施方案中，配制如式(I)所述的杂环CDK12/13抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以通过注射施用。在一些情况下，注射制剂为水性制剂。在一些情况下，注射制剂为非水性制剂。在一些情况下，注射制剂是油基制剂，例如芝麻油等。

如本文所述的包含至少一种杂环CDK12/13抑制剂的组合物的剂量依据对象或患者(例如，人)的病况而不同。在一些实施方案中，这些因素包括一般健康状况、年龄和其他因素。药物组合物以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。适当的剂量和合适的持续时间和施用频率将由诸如患者的病况、患者疾病的类型和严重程度、活性成分的特殊形式以及施用方法的因素确定。通常，适当的剂量和治疗方案提供足以提供治疗和/或预防益处(例如，改善的临床结果，例如更频繁的完全或部分缓解，或更长的无病和/或总生存期，或症状严重程度的减轻)的量的一种或多种组合物。最佳剂量通常使用实验模型和/或临床试验确定。最佳剂量取决于患者的体质量、体重或血容量。口服剂量通常在约1.0mg至约1000mg的范围内，每天一到四次或更多。

实施例

提供这些实施例仅用于说明目的，而不是限制本文提供的权利要求的范围。

实施例1：细胞周期蛋白依赖的激酶抑制活性的确定

化合物1-5(见表1)在ProQinase(ProQinase GmbH,Reaction Biology；Freiburg,Germany)使用其可商购的放射性激酶测定服务进行激酶活性测定。简言之，化合物以固体形式提供，并在测定当天溶解到1x10^-03M/100％DMSO储备溶液中。所有的蛋白激酶均由ProQinase提供，并在Sf9昆虫细胞或大肠杆菌(E.coli)中以重组GST融合蛋白或His标记蛋白(全长或酶活性片段)的形式表达。所有激酶均由人cDNA产生，并通过GSH亲和层析或固定化金属纯化。通过SDS-PAGE/考马斯染色检测蛋白激酶的纯度，通过质谱检查其身份。使用放射性蛋白激酶测定(

活性测定)测量蛋白激酶的激酶活性。所有的激酶测定均在来自Perkinlemer(Boston,MA,USA)的96孔FlashPlatesTM中进行，反应体积为50微升。反应混合物按以下顺序分四步移液：1)25微升的测定缓冲液(标准缓冲液/[γ-³³P]-ATP)；2)10微升的ATP溶液(在H₂O中)；3)5微升的试验化合物(在10％的DMSO中)；4)10微升的酶/底物混合物。蛋白激酶的测定含有70mM HEPES-NaOH pH 7.5、3mM MgCl₂、3mM MnCl₂、3μM的原钒酸钠、1.2mM的DTT、50μg/ml的PEG20000、ATP(可变浓度，对应于激酶的表观ATP-Km)。反应混合物在30℃下孵育60分钟。用50微升的2％(v/v)H₃PO₄停止反应，抽吸该板并用200微升的0.9％(w/v)NaCl洗涤两次。用微量培养板闪烁计数器(Microbeta,Wallac)确定³³Pi的掺入。

作为测定品质的参数，使用用于每个测定板(n＝8)的低和高对照的Z′-因子(Zhang等人，J.Biomol.Screen.2:67-73,1999)。ProQinase重复测定板的标准是Z′因子低于0.4。结果如下表2所示。

表2.CDK活性的抑制(放射性测定中的摩尔抑制)

实施例2：激酶选择性的确定

使用其可商购的放射性激酶测定服务和实施例1中描述的方法在ProQinase分析化合物4对一组其他激酶的选择性。表3提供了激酶抑制的总结。发现该化合物对非CDK12/13激酶的平均抑制百分比较低。

实施例3：化合物抑制卵巢癌细胞系的细胞增殖

OVCAR-3用作细胞系以建立体外和体内卵巢癌模型。该细胞系从ATCC(目录号HTB-161)获得，是一种来自卵巢进行性腺癌患者的恶性腹水的腺癌细胞系，体现了高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)的临床前模型。OVCAR-3被认为是研究卵巢癌耐药性的合适模型系统，且激素受体的存在应该有助于评估激素治疗。OVCAR-3对临床相关浓度的阿霉素(adriamycin)、美法仑(melphalan)和顺铂(cisplatin)具有耐药性。

测试化合物1-5在不同浓度(4μM至126.4pM；0.5对数连续稀释)下抑制OVCAR-3细胞增殖的能力。细胞在ATCC配制的RPMI-1640培养基(ATCC 30-2001)+10％FBS中生长。细胞在37℃下在5％CO₂存在的加湿室中培养。增殖测定在72小时时间段内进行。

如上所述培养和维持细胞，细胞始终在测定前一天被喂养。运行测定，2小时化合物暴露，然后冲洗，然后是72小时的增殖时间，或在没有化合物冲洗的情况下暴露于测试化合物72小时。DMSO在所有未接受测试化合物的孔中用作对照，并且DMSO孔用于板归一化。细胞的增殖和存活是基于细胞溶解后的总ATP的量进行量化的，如通过使用根据制造商的说明使用的标准测定试剂盒测定的。实验在每种细胞类型用于生长和维持所用的相同培养基中进行。将细胞(5x10⁴)铺板在96孔板中进行化合物暴露。

(PromegaCorporation,Madison,WI USA)被用于按照制造商的指示，使用

试剂盒提供的试剂来评估化合物的抗增殖作用。

细胞增殖测定的结果如表4所示，并显示暴露于化合物1-5的OVCAR-3细胞中细胞增殖和存活的剂量依赖性抑制。这些化合物对低IC₅₀值的OVCAR-3细胞显示增殖的抑制。在2小时后化合物被洗掉的细胞中，增殖抑制仍在继续。

表4.OVCAR3细胞的增殖抑制(以M为单位的IC₅₀)

实施例4：化合物抑制乳腺癌细胞系的细胞增殖

HCC70是用作三阴性乳腺癌(TNBC)模型的细胞系。该细胞系从ATCC获得，并于1992年从原发性导管癌(目录号CRL-2315；乳腺原发性导管癌)开始。在37℃下在空气中5％CO₂的环境中，在补充有10％热灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基中，将HCC-70肿瘤细胞系体外保持为单层培养物。

测试代表性化合物在不同浓度(4μM至126.4pM；0.5对数连续稀释)下抑制HCC70细胞增殖的能力。细胞在ATCC配制的RPMI-1640培养基(ATCC 30-2001)+10％FBS中生长。细胞在37℃下在5％CO₂存在的加湿室中培养。增殖测定在72小时时间段内进行。

如上所述培养和维持细胞，细胞始终在测定前一天被喂养。运行测定，2小时化合物暴露，然后冲洗，然后是72小时的增殖时间，或在没有化合物冲洗的情况下暴露于测试化合物72小时。DMSO在所有未接受测试化合物的孔中用作对照，并且DMSO孔用于平板归一化。细胞的增殖和存活是基于细胞溶解后的总ATP的量进行量化的，如通过使用根据制造商的说明使用的标准测定试剂盒测定的。实验在每种细胞类型用于生长和维持所用的相同培养基中进行。将细胞(5x10⁴)铺板在96孔板中进行化合物暴露。

(PromegaCorporation,Madison,WI USA)被用于按照制造商的指示，使用

试剂盒提供的试剂来评估化合物的抗增殖作用。

细胞增殖测定的结果如表5所示，并显示暴露于化合物1-5的HCC70细胞中细胞增殖和存活的剂量依赖性抑制。这些化合物对低IC₅₀值的HCC70细胞显示增殖的抑制。在2小时后化合物被洗掉的细胞中，增殖抑制仍在继续。

表5.HCC70细胞的增殖抑制(以M为单位的IC₅₀)

化合物ID	1	2	3	4	5
						HCC70(无冲洗)	5.10E-09	1.13E-08	1.01E-08	3.23E-08	1.93E-08
HCC70(有冲洗)	1.41E-08	3.80E-08	1.10E-07	1.34E-07	8.21E-08

实施例5：三阴性乳腺癌的小鼠异种移植模型中抗增殖活性的确定

为了测试化合物在体内的疗效，在小鼠异种移植中进行研究。对于所有研究，动物护理和饲养的一般程序均按照标准、生命科学委员会、国家研究委员会、Pharmaron,Inc(中国北京)的标准操作程序(SOP)进行。将小鼠置于恒温恒湿的层流室中，每个笼中3-5只小鼠，每周更换一次垫草。将动物饲养在尺寸为300x180x150mm³的聚碳酸酯笼中，并饲养在环境受到监测、通风良好的房间内，该房间保持温度为(22±3℃)，相对湿度为40％-70％，进行全光谱照明的12小时:12小时的光:暗循环。给每只动物分配一个识别号；将采用以下识别方法。笼牌上贴有诸如研究编号、组、性别、剂量、动物编号、开始日期、研究负责人和电话号码的信息。动物通过耳朵编码进行识别。在整个研究时间期间，除方案规定的时间段外，动物可自由获得辐照灭菌的干颗粒食物。

将在0.1ml的RPMI-1640培养基和Matrigel混合物(1:1比例)中的HCC70肿瘤细胞(5x10⁶)皮下接种到每只小鼠的右胁腹用于肿瘤发育。当平均肿瘤大小达到约100-150mm³时开始治疗。将小鼠分配到各组，使得每个治疗组的平均肿瘤体积相同。不仅监测所有研究动物的肿瘤生长，还监测其行为，如活动性、食物和水消耗(仅通过笼侧检查)、体重(BW)、眼睛/毛发的缠结和任何其他异常影响。记录所有死亡和/或异常临床体征。

每周用卡尺进行两次肿瘤大小的测量并记录。使用以下公式估算肿瘤体积(mm³)：TV＝a×b2/2，其中“a”和“b”分别是肿瘤的长直径和短直径。TV用于计算肿瘤生长抑制和肿瘤生长延迟。

方案要求的测量和观察结果手动记录在excel电子表格中。进行所有统计学检验，且显著性水平设定为5％或P<0.05。按照设计的研究计算所有测量参数的组均值、标准偏差。本研究采用双因素重复测量方差分析(Two-way RM ANOVA)，然后进行均值图基(Tukey)事后比较(post hoc comparison)。

用HCC70细胞接种于CB-17SCID雌性小鼠作为三阴性乳腺癌的体内模型。细胞经过传代并以指数生长期生长，将其收获用于肿瘤接种，在使用时不超过细胞第5代。将携带HCC70肿瘤的小鼠随机分为4组(每组n＝8只小鼠)，肿瘤植入后15天，平均肿瘤体积为150mm³。每组动物每周两次(星期一、星期四)接受溶媒(3％DMSO、0.5％乙酸、96.5％(20％HP-β-CD的水溶液)或2.5、5.0和10.0mg/kg的化合物4，在14天的疗效研究过程中，静脉施用总共4剂。每次治疗给药后还立即施用0.1mL的盐水冲洗。在第15天静脉施用最后一剂，用于研究结束时PK血浆和PD肿瘤收集，如方案所示。在整个研究过程中，每周用卡尺测量肿瘤体积2次，并记录所有动物的体重。

在每周两次静脉施用20mg/kg和25mg/kg的化合物4治疗14天后，在HCC70异种移植模型中观察到抗肿瘤活性，如图1所描绘的那样。在这些剂量下，与溶媒对照相比，化合物4的治疗产生了显著的抗肿瘤活性，T/C分别为-37％和-39％(p<0.0001,p<0.0001)。治疗开始于肿瘤接种后第15天。使用事后双因素重复测量方差分析均值图基事后比较来计算显著性差异。使用以下等级体系表示显著性水平：*＝p≤0.05**＝p≤0.01***＝p≤0.001****＝p≤0.0001，NS＝不显著。

实施例6：卵巢乳腺癌的小鼠异种移植模型中抗增殖活性的确定

为了测试化合物在体内的疗效，在小鼠异种移植中进行研究。对于所有研究，动物护理和饲养的一般程序均按照标准、生命科学委员会、国家研究委员会、Pharmaron,Inc(中国北京)的标准操作程序(SOP)进行。将小鼠置于恒温恒湿的层流室中，每个笼中3-5只小鼠，每周更换一次垫草。将动物饲养在尺寸为300x180x150mm³的聚碳酸酯笼中，并置于饲养在环境受到监测、通风良好的房间内，该房间保持温度为(22±3℃)，相对湿度为40％-70％，进行全光谱照明的12:12光:暗循环。给每只动物分配一个识别号；将采用以下识别方法。笼牌上贴有诸如研究编号、组、性别、剂量、动物编号、开始日期、研究负责人和电话号码的信息。动物通过耳朵编码进行识别。在整个研究时间期间，除方案规定的时间段外，动物可自由获得辐照灭菌的干颗粒食物。

对于OVCAR-3研究，将携带OVCAR-3肿瘤的NOD SCID雌性小鼠随机分为5组(每组n＝9只小鼠)，肿瘤植入后17天，平均肿瘤体积为150mm³。每组每周两次(星期一、星期四)接受溶媒(3％DMSO、97.0％(20％HP-β-CD的水溶液)或5.0、10、20和25.0mg/kg的化合物4，在14天的疗效研究过程中，静脉施用总共4剂。每次治疗给药后还立即施用0.1mL的盐水冲洗。在第15天静脉施用最后一剂，用于研究结束时PK血浆和PD肿瘤收集，如方案所示。在整个研究过程中，每周用卡尺测量肿瘤体积2次，并记录所有动物的体重。

方案要求的测量和观察结果手动记录在excel电子表格中。进行所有统计学检验，且显著性水平设定为5％或P<0.05。按照设计的研究计算所有测量参数的组均值、标准偏差。本研究采用双因素重复测量方差分析，然后进行均值图基事后比较。

在每周两次静脉施用5.0、10、20、和25mg/kg的化合物4治疗14天后，在OVCAR-3异种移植模型中观察到抗肿瘤活性，如图2所描绘的那样。在5.0和10mg/kg剂量下，与溶媒对照相比，化合物4产生了显著的抗肿瘤活性，T/C分别为36％和13％(p<0.01,p<0.001)。在剂量20mg/kg和25mg/kg下产生显著的抗肿瘤活性，T/C分别为-7％和-9％(p<0.0001，p<0.0001)。

实施例7：化合物1在体外抑制RNA聚合酶II的磷酸化

CDK12和CDK13磷酸化RNA聚合酶II。在NCI-H82细胞中分析化合物1抑制RNA聚合酶II磷酸化的能力。将200,000个细胞铺板在96孔MSD板的每个孔中。用浓度为4μM至126.4pM(0.5对数连续稀释)的化合物1、THZ531(阳性对照)或E9治疗细胞2小时。THZ531和E9在Gao等人，Cell Chemical Biology 2017中作了进一步讨论。使用抗体分析磷酸化的RNA聚合酶II的量和RNA聚合酶II的总量。通过计算磷酸化的RNA聚合酶II与总RNA聚合酶II的比值，将这些值归一化。如图3A(THZ531)、图3B(化合物1)和表6所示，增加化合物1的浓度导致RNA聚合酶II的磷酸化抑制的剂量特异性增加。

表6：化合物1的体外IC₅₀值(nM)

实施例8：化合物4和化合物5抑制体内RNA聚合酶II的磷酸化

在三阴性乳腺癌的小鼠异种移植模型中，分析了化合物4和化合物5在S2单元抑制RNA聚合酶II的磷酸化的能力。将HCC70细胞接种于CB-17SCID小鼠作为三阴性乳腺癌的体内模型。将在0.1mL的RPMI-1640培养基和Matrigel混合物(1:1比例)中的HCC70肿瘤细胞(5x10⁶)皮下接种到每只小鼠的右胁腹用于肿瘤发育。当平均肿瘤大小达到约100-150mm³时开始治疗。用仅溶媒、20mg/kg的化合物4、25mg/kg的化合物4、10mg/kg的化合物5或25mg/kg的化合物5静脉内治疗小鼠2小时。在给药后0.5小时、6小时和24小时进行测量。分析磷酸化的RNA聚合酶II的量和RNA聚合酶II的总量。通过计算磷酸化的RNA聚合酶II与总RNA聚合酶II的比值(pS2/S2)，将这些值归一化。

如图4所描绘，与单独使用溶媒治疗相比，使用任何剂量的化合物4或化合物5治疗在所有时间点降低了pS2/S2。在所有时间点，用25mg/kg的化合物5治疗比用10mg/kg的化合物5治疗产生更大的pS2/S2比值的下降。

实施例9：人和食蟹猴外周血单核细胞的离体分析

离体分析化合物抑制外周血单核细胞(PBMC)磷酸化的能力。将化合物1和化合物4以4μM至126.4pM(0.5对数连续稀释)的浓度给药2小时。分析磷酸化的RNA聚合酶II的量和RNA聚合酶II的总量。通过计算磷酸化的RNA聚合酶II与总RNA聚合酶II的比值(pS2/S2)，将这些值归一化。

如图5所描绘，化合物浓度的增加导致抑制百分比增加。计算人(hPMBC)和食蟹猴(猴，moPBMC)的IC₅₀值。在hPBMC中，化合物1的IC₅₀值为19.32nM，化合物4的IC₅₀值为167.2nM。在moPBMC中，化合物1的IC₅₀值为21.62nM，化合物4的IC₅₀值为181.3nM。

实施例10：化合物1治疗的三阴性乳腺癌细胞中基因表达的体外分析

用DMSO或化合物1治疗96孔板格式中的HCC70(ATCC CRL-2315)细胞2小时。在化合物治疗进行2小时后，用PBS洗涤板一次，然后向细胞中加入新鲜培养基，并将细胞分别孵育4、10、22、46、70小时。在每个时间点(冲洗2小时后4、10、22、46、70小时)，按照制造商的说明如下进行RNA提取。使用Ambion Cell to CT试剂盒(目录号AM1728)进行RNA提取和qPCR。简言之，从培养箱中取出细胞，在PBS中洗涤一次，通过加入50μL来自试剂盒的裂解溶液而裂解，混合5次，并将5μL终止溶液加入到孔中。所有操作均使用不含RNA酶和DNA酶的实验室器具完成。

然后制备逆转录反应混合物。整个操作过程中，所有试剂均保存在冰水浴中。

使用标准Applied Biosystems MiniAmp PCR机器，按照以下程序从基于细胞的样品中生成cDNA模板：

1.将盖加热至110℃

2. 37℃1小时

3. 95℃5分钟

4. 4℃无穷大

在预冷的板式离心机中离心PCR板，并观察板盖的完整性。在qPCR分析之前，将逆转录产物储存在-20℃下。通过使用

基因表达主混合物进行多重qPCR。反应混合物如下所述制备。每次对每个样品进行三次重复。整个操作过程中，所有试剂均保存在冰水浴中。

实时qPCR系统的设置如下图所示，并且荧光增益设置为1×。

根据QuantStudio5软件进行数据分析。通过QuantStudio 5软件使用默认设置计算信号阈值。使用以下公式评估相对基因表达：

·ΔCt＝Ct(靶基因)的平均值–Ct(管家基因)的平均值

·mRNA水平＝2-ΔCt

·％溶媒＝100x[mRNA(治疗化合物)/mRNA(溶媒)]

使用具有表7中列出的Taqman(Applied Biosystems,ThermoFisher Scientific；Carlsbad,CA)探针的qPCR检测基因表达。使用ddCt方法，采用靶基因表达与“管家”对照基因ACTB或GAPDH的比将基因表达归一化。

表7：DDR基因集1

图6显示了一个DDR基因的归一化基因表达的示例。化合物1显示从治疗后2小时开始的BRCA1表达水平的降低。基因表达的降低在冲洗后继续，在治疗后10小时(冲洗后)观察到用化合物1治疗的细胞的基因表达的降低最强。

实施例11：化合物4治疗的小鼠的DDR基因表达的体内分析

本实验中采用三阴性乳腺癌异种移植模型。将HCC70细胞接种于CB-17SCID小鼠，作为三阴性乳腺癌的体内模型。将在0.1mL的RPMI-1640培养基和Matrigel混合物(1:1比例)中的HCC70肿瘤细胞(5x10⁶)皮下接种到每只小鼠的右胁腹用于肿瘤发育。当平均肿瘤大小达到约100-150mm³时开始治疗。使用单剂量的溶媒、20mg/kg的化合物4或25mg/kg的化合物4静脉内治疗小鼠。给药后0.5、6和24小时，收集肿瘤细胞并分析基因表达。表8列出了测试的基因。

表8：经分析的DDR基因

基因名称	TaqMan探针	基因名称	TaqMan探针
				BRCA1	Hs02387158_m1	MCL1	Hs01050896_m1
BRCA2	Hs00609073_m1	MYC	Hs00153408_m1
				ATM	Hs00175892_m1	PARP1	Hs00242302_m1
ATR	Hs00992123_m1	PARP2	Hs00193931_m1
				H2AX	Hs01573336_s1	CHEK1	Hs00967506_m1
RAD51	Hs00947967_m1	ACTB	Hs01060665_g1
				BCLXL	Hs00236329_m1	GAPDH	Hs02758991_g1
BCL2	Hs01048932_g1

在图7中，显示BRCA1的基因表达数据，BRCA1是测试的基因之一。在剂量施用后6和24小时，用任一剂量的化合物4治疗的小鼠的肿瘤细胞中BRCA1表达降低。

实施例12：转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)的临床试验设计研究描述

简述：这项研究的目的是找出一种新药，化合物4，其单独使用或与PARP抑制剂奥拉帕利联合使用时，对具有转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)的男性是否安全并具有有益效果。

病况或疾病 干预或治疗

mCRPC 单独的化合物4

mCRPC 化合物4+奥拉帕利

详细描述：

本Ib/II期临床试验将评估CDK12/13抑制剂化合物4单独或与奥拉帕利联合使用的安全性、耐受性、RP2D和初步抗肿瘤活性。

Ib期研究的主要目的是建立安全性、耐受性和RP2D。不良事件(AE)将根据国家癌症研究所(National Cancer Institute)不良事件通用术语标准(CTCAE)5.0版进行分级。在研究的Ib期部分期间，剂量限制性毒性(DLT)将被定义为在周期1期间发生的可归因于化合物4和/或奥拉帕利的AE，其与mCRPC、并发疾病或伴随药物无关，并符合基于CTACE的DLT标准综合列表(版本5.0)中的至少一个标准。剂量递增将持续，直到至少有2名接受剂量水平治疗的患者观察到DLT，从而得出已超过MTD的结论。

本研究II期部分的主要目的是基于RECIST v1.1或PSA下降≥50％来估计化合物4单独或与奥拉帕利联合的客观反应率(ORR)，如根据前列腺癌工作组3(PCWG3)所述的。II期的次要终点包括无进展生存率、疾病控制率、反应持续时间和进展时间。其他探索性终点包括反应和进展的遗传生物标志物评估。

研究设计

研究类型：干预性临床试验

估计的入选：100例患者

干预模型：单组分配

掩蔽：无(开放标签)

主要目的：治疗

分组和干预

分组 干预

实验：低剂量化合物4 化合物4

实验：高剂量化合物4 化合物4

实验：低剂量化合物4和奥拉帕利 化合物4+奥拉帕利

结果量度

主要结果量度：

1.CTCAE v.4.03定义的出现治疗紧急不良事件的患者百分比[例如，时间框架：基线至1年]。根据CTCAE v.4.03评分，出现治疗紧急不良事件和毒性的患者人数和百分比。

2.CTCAE 4.03定义的化合物4单独和与奥拉帕利联合的最大耐受剂量(MTD)[时间框架：基线至1年]。确定CTCAE v.4.03定义的剂量递增期间化合物4单独和与奥拉帕利联合的MTD。

3.基于RECIST v1.1或PSA下降≥50％的化合物4单独和与奥拉帕利联合的客观反应率(ORR)，如根据前列腺癌工作组3(PCWG3)所述的。

次要结果量度：

1.放射学无进展生存期[时间框架：放射学无进展生存期将在试验进入后6个月进行评估]rPFS将由RECIST v.1.1进展和/或骨扫描进展或根据前列腺癌工作组3(PCWG3)的描述进行定义。它将从试验进入之日起至首次发生放射学进展或任何原因导致的死亡期间进行测量

2.无进展生存期[时间框架：无进展生存期将在试验进入后6个月进行评估]PFS将从试验进入之日测量，直到RECIST v.1.1定义的放射学进展，如根据前列腺癌工作组3(PCWG3)或明确的临床进展或死亡所述的

3.到PSA进展的时间[时间框架：到PSA进展的时间将在试验进入后6个月进行评估]对于从第1周期第1天(基线)开始下降≥50％的患者，PSA进展日期被定义为增长≥25％，且记录高于最低点的绝对增长≥2ng.mL的日期。这必须通过第二连续值进行确认。对于PSA没有下降这一幅度或根本没有下降的患者，PSA进展日期定义为增长≥25％，且记录高于基线的绝对增长≥2ng/mL的日期。这也必须通过第二连续值进行确认。

4.PSA反应的持续时间[时间框架：PSA反应的持续时间将在试验进入后6个月进行评估]PSA反应的持续时间从PSA值首次下降第1周期第1天(基线)值的至少50％的时间开始计算(必须通过第二值进行确认)，直到PSA最低点增加25％的时间为止，前提是绝对增加为至少2ng/mL。该增加必须通过第二连续测量来确认。

5.到放射学进展的时间[时间框架：将在试验进入后6个月进行评估]测量从试验进入之日起至首次出现放射学进展的到放射学进展(由RECIST V.1.1进展和/或骨扫描进展定义的进展，或根据前列腺癌工作组3(PCWG3)描述的进展)的时间。在没有既往放射学进展证据的情况下，由前列腺癌或任何其他原因导致的死亡不算作事件。

6.总体生存期[时间框架：将在试验进入后6个月进行评估]OS将从试验进入之日到死亡之日(无论原因如何)进行测量。存活患者的生存时间将在已知患者存活或失去随访的最后日期进行审查

7.PSA客观反应[时间框架：将在试验进入后6个月进行评估]根据前列腺癌工作组3(PCWG3)的共识指南来定义PSA反应和PSA进展。

探索性结果量度：

确定对化合物4单独或联合奥拉帕利的反应和耐药性的临床相关生物标志物。为此，将使用循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤相关核酸(即ctDNA)和/或配对的正常/肿瘤组织标本进行探索性分析，以确定与化合物4单独或联合奥拉帕利的反应和耐药性相关的生物、遗传和转录组学特征。

合格标准

符合研究条件的年龄：18岁及以上(成人、老年人)

符合研究条件的性别：男性

接受健康志愿者：否

标准

入选标准：

·组织学证实的前列腺腺癌

·骨扫描或CT扫描证实的转移性疾病

·双侧睾丸切除术史或持续使用GnRH激动剂或拮抗剂

·由血清睾酮水平≤50ng/dL定义的进行性mCRPC和根据前列腺癌工作组3的骨骼疾病进展、淋巴结疾病、内脏疾病和/或PSA进展

·使用阿比特龙(abiraterone)或恩杂鲁胺(enzalutamide)的既往治疗

·使用多西紫杉醇(docetaxel)的既往治疗

实施例13：铂耐药高级别浆液性卵巢癌的临床试验设计

研究描述

简述：这项研究的目的是找出一种新药，化合物4，其单独使用或与PARP抑制剂奥拉帕利联合使用时，对铂耐药的高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)女性是否安全并具有有益的效果。

病况或疾病 干预或治疗

铂耐药的HGSOC 单独的化合物4

铂耐药的HGSOC 化合物4+奥拉帕利

详细描述：主要和次要目标是评估化合物4单独或化合物4与奥拉帕利联合在铂耐药、高级别浆液性卵巢癌患者的1/1b期试验中的安全性；确定卵巢癌参与者中6个月时保持无进展生存期(PFS)的参与者的反应率和百分比(％PFS)；以及确定单独使用化合物4或化合物4与奥拉帕利联合对疾病反应和进展的潜在生物学预测因子。

研究设计

研究类型：干预性临床试验

估计的入选：60名患者

干预模型：单组分配

掩蔽：无(开放标签)

主要目的：治疗

分组和干预

分组 干预

实验：低剂量化合物4 化合物4

实验：高剂量化合物4 化合物4

实验：低剂量化合物4和奥拉帕利 化合物4和奥拉帕利结果量度

主要结果量度：

1.由CTCAE v.4.03定义的出现治疗紧急不良事件的患者百分比[时间框架：基线至1年]。根据CTCAE v.4.03评分，出现治疗紧急不良事件和毒性的患者人数和百分比。

2.由CTCAE 4.03定义的化合物4单独和与奥拉帕利联合的最大耐受剂量(MTD)[时间框架：基线至1年]。确定CTCAE v.4.03定义的剂量递增期间化合物4和奥拉帕利的MTD。

2.由RECIST v.1.1定义的无进展生存期(PFS)百分比[时间框架：基线至6个月]。确定使用单独的化合物4或化合物4+奥拉帕利治疗的铂耐药HGSOC患者(定义为最后铂方案后6个月内的进展)中在6个月时保持无进展的患者百分比(％PFS)，如RECIST v.1.1定义的。

次要结果量度：

1.由RECIST v.1.1定义的整体反应率(ORR)[时间框架：基线至6个月]。确定使用单独的化合物4或化合物4+奥拉帕利治疗的铂耐药(定义为最后铂方案后6个月内的进展)HGSOC癌症中的反应率，如RECIST v.1.1定义的。

2.由RECIST v.1.1定义的总体存活期(OS)[时间框架：基线至6个月]。确定使用单独的化合物4或化合物4+奥拉帕利治疗的铂耐药(定义为最后铂方案后6个月内的进展)HGSOC患者中的反应率，如RECIST v.1.1定义的。

探索性结果量度：

确定对化合物4单独或联合奥拉帕利的反应和耐药性的临床相关生物标志物。为此，将使用循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤相关核酸(即ctDNA)和/或配对的正常/肿瘤组织标本进行探索性分析，以确定与化合物4单独或与奥拉帕利联合的反应和耐药性相关的生物、遗传和转录组学特征。

合格标准

符合研究条件的年龄：18岁及以上(成人、老年人)

符合研究条件的性别：女性

接受健康志愿者：否

标准

入选标准：

·患者必须被诊断为晚期和组织学证实的高级别浆液性卵巢癌、原发性腹膜癌或输卵管癌

·患者必须患有铂耐药的卵巢癌，定义为在最后的铂方案后6个月内进展。

·患者必须有至少一处符合RECIST v1.1的可测量疾病的定义的病变。

·女性患者≥18岁龄

·东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)行为状态(PS)0

·记录的种系和体细胞BRCA1/2和DNA损伤基因(DDR)突变状态

·提供足够的归档和/或新活检的正常/肿瘤标本，用于验证性和探索性生物标志物分析

排除标准：

·目前正在参与并接受研究疗法，或已参与试验药剂的研究，并在第一剂治疗后4周内接受研究疗法或使用试验设备。

·患者不能患有原发性铂难治性癌症，即在接受铂期间或在接受基于铂的方案后一个月内有记录的癌症进展。

·无路线限制，但患者必须在铂耐药环境中接受过不大于1次的既往方案。

·在研究第1天前2周内接受既往化疗、靶向小分子疗法或放疗，或由于先前施用的药剂而尚未从不良事件恢复的患者(即，≤1级或在基线)。

·无既往靶向DNA损伤修复(DDR)抑制剂，也未将既往的吉西他滨作为单一药剂；激素疗法和抗血管生成疗法(作为单一药剂)以及PARP抑制剂作为维持疗法不算作单独的路线。

·患有正在进展或需要积极治疗的已知其他恶性肿瘤。此外，患者在开始治疗的3年内不能被诊断出患有另外的恶性肿瘤。例外情况包括完全切除的皮肤基底细胞癌或皮肤鳞状细胞癌、原位宫颈癌、完全切除的原位导管癌，以及IA期非侵袭性I级子宫内膜样子宫内膜癌(已经经过治愈性治疗的)。

·患有已知活动性中枢神经系统(CNS)转移和/或癌性脑膜炎。先前接受治疗的脑转移瘤参与者可以参加，前提是他们病情稳定(在第一次剂量试验治疗前至少四周内没有影像学进展的证据，并且任何神经系统症状都已恢复到基线)，没有新的或扩大的脑转移瘤证据，并且在试验治疗前至少7天没有使用类固醇。这一例外不包括临床活动性和显著的癌性脑膜炎，无论其临床稳定性如何，均被排除在外。

·有需要全身治疗的活动性感染

·治疗研究者认为，有可能干扰试验结果、干扰参与者在整个试验期间的参与或不符合参与者参与的最佳利益的任何病况、治疗或实验室异常的历史或当前证据。

实施例14：三阴性乳腺癌临床试验设计

研究描述

简述：本研究的目的是找出一种新的试验药物化合物4在由合格标准定义的转移性三(ER-、PR-、HER2-)阴性乳腺癌(TNBC)患者中单独使用或与PARP抑制剂奥拉帕利联合使用时是否安全并具有有益效果。

病况或疾病 干预或治疗

TNBC 单独的化合物4

TNBC 化合物4+奥拉帕利

详细描述：

本Ib/II期临床试验将评估新试验药物化合物4单独或与PARP抑制剂奥拉帕利联合治疗转移性三阴性乳腺癌(TNBC)患者的安全性、耐受性、RP2D和初步抗肿瘤活性。

Ib期研究的主要目的是建立安全性、耐受性和RP2D。不良事件(AE)将根据国家癌症研究所不良事件通用术语标准(CTCAE)5.0版进行分级。在研究的Ib期部分期间，剂量限制性毒性(DLT)将被定义为在周期1期间发生的可归因于化合物4和/或奥拉帕利的AE，其与TNBC、并发疾病或伴随药物无关，并符合基于CTACE的DLT标准综合列表(版本5.0)中的至少一个标准。剂量递增将持续，直到至少有2名接受剂量水平治疗的患者观察到DLT，从而得出已超过MTD的结论。

本研究II期部分的主要目的是基于RECIST v1.1标准评估化合物4单独或与奥拉帕利联合的客观反应率(ORR)。II期的次要终点包括无进展生存期、临床受益率/疾病控制率、反应持续时间和到进展的时间。其他探索性终点包括反应和进展的遗传生物标志物评估。

研究设计

研究类型：干预性临床试验

估计的入选：100名患者

干预模型：单组分配

掩蔽：无(开放标签)

主要目的：治疗

分组和干预

结果量度

主要结果量度：

1.由CTCAE v.4.03定义的出现治疗紧急不良事件的患者百分比[例如，时间框架：基线至1年]。根据CTCAE v.4.03评分，出现治疗紧急不良事件和毒性的患者人数和百分比；[时间框架：直至治疗后3个月]将确定接受至少一剂化合物4和/或奥拉帕利的具有TNBC的参与者的发病率。

2.由CTCAE 4.03定义的化合物4单独和与奥拉帕利联合的最大耐受剂量(MTD)[时间框架：基线至1年]。确定由CTCAE v.4.03定义的剂量递增期间化合物4和奥拉帕利的MTD。

3.将根据RECIST v.1.1.标准确定化合物4单独或与奥拉帕利联合的客观反应率(ORR)。

次要结果量度：

1.化合物4单独或与奥拉帕利联合使用的临床获益率(CBR)或疾病控制率(DCR)[时间框架：直至治疗后6个月]将根据RECIST v.1.1.标准确定。在当前方案中实现至少6个月的完全缓解(CR)、部分缓解(PR)或稳定疾病(SD)的参与者将被认定为从治疗中获益，并将计入CBR/DCR测量。

2.化合物4单独或与奥拉帕利联合使用的无进展生存期(PFS)[时间框架：直至治疗后1年]根据RECIST v.1.1.标准，PFS定义为从首次使用奥拉帕利治疗(即，第1周期第1天)到首次重现或复发(身体任何部位)或在12个月时最后一次随访时死亡的时间。

3.化合物4单独或与奥拉帕利联合使用的总生存期(OS)[时间框架：直至治疗后1年]根据RECIST v.1.1.标准，OS将被定义为从使用化合物4单独或与奥拉帕利联合的首次治疗(即第1天)到死亡之日或在12个月时最后一次随访的时间。

4.根据RECIST v.1.1.标准的化合物4单独或与奥拉帕利联合使用的反应持续时间(DOR)[时间框架：直至治疗后6个月]。整体反应的持续时间从满足CR或PR测量标准的时间(以最先记录的为准)开始测量，直到客观记录复发或进展性疾病的第一天，以自治疗开始以来记录的最小测量值作为进展性疾病的参考。总体CR的持续时间从首次满足CR的时间测量标准开始测量，直到客观记录进展性疾病的第一天。如果参与者死亡，无论原因如何，事先没有复发或进行性疾病的记录，则死亡日期将用于表示反应结束日期。

探索性结果量度：

确定对化合物4单独或联合奥拉帕利的反应和耐药性的临床相关生物标志物。为此，将使用循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤相关核酸(即ctDNA)和/或配对的正常/肿瘤组织标本进行探索性分析，以确定与化合物4单独或与奥拉帕利联合的反应和耐药性相关的生物、遗传和转录组学特征。

合格标准

符合研究条件的年龄：18岁及以上(成人、老年人)

符合研究条件的性别：男性和女性

接受健康志愿者：否

标准

入选标准：

·能够理解并愿意签署书面知情同意书。

·知情同意时，参与者年龄>＝18岁。

·转移性TNBC，定义如下：

1.根据美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology，ASCO)/美国病理学家协会(College of American Pathologists，CAP)激素受体检测指南，ER和PR阴性定义为通过免疫组织化学ER<10％且PR<10％

2.根据ASCO/CAP指南，HER2未扩增，定义为：

a.IHC评分0/1+

b.IHC 2+和原位杂交(ISH)未扩增，HER2与CEP17的比<2.0，如果报告，平均HER2基因拷贝数<4个信号/细胞；或

c.ISH未扩增，HER2与CEP17的比<2.0，如果报告，平均HER2基因拷贝数<4个信号/细胞

·参与者必须有至少一个如RECIST v1.1所定义的可进行活检的可测量的疾病部位。

·转移性乳腺癌的既往疗法

1.尚未接受转移性乳腺癌既往系统治疗的一线患者符合条件。

2.接受过<＝2次针对转移性乳腺癌的既往化疗方案的患者符合条件。

·参与者必须已完全从所有既往治疗的急性毒性作用中恢复到1级或更低(但允许的脱发和<＝2级神经病变除外)

·参与者的预期寿命必须>＝16周。

·参与者必须具有东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)行为状态<＝1

·参与者必须同意接受治疗前筛查活检，以进行登记和后续生物标志物分析。

·参与者必须同意在4周单周期的奥拉帕利诱导治疗后接受一次强制性的研究中的肿瘤活检。在疾病进展时进行第二次研究中的活检是任选的，但不是强制性的。

·参与者必须没有使用抗PD-L1，包括德瓦鲁单抗(durvalumab)抗PD-1、抗-CTLA4或类似药物的既往免疫疗法。

·参与者必须具有在施用研究治疗前28天内测量的正常器官和骨髓功能，定义如下：

1.血红蛋白>＝10.0g/dL，过去28天内未输血

2.绝对中性粒细胞计数(ANC)>＝1.5x10⁹/L

3.血小板计数>＝100x10⁹/L

4.总胆红素<＝1.5x习知的正常上限(ULN)

5.天冬氨酸转氨酶(AST)(血清谷草转氨酶(SGOT))/丙氨酸转氨酶(ALT)(血清谷丙转氨酶(SGPT))<＝2.5x习知的正常上限，除非存在肝转移，在这种情况下，它们必须<＝5xULN

6.参与者必须具有使用Cockcroft-Gault方程或根据24小时尿检估计的肌酐清除率>＝51mL/min：估计肌酐清除率＝(140-年龄[年])x体重(kg)(x F)血清肌酐(mg/dL)x72；其中女性的F＝0.85，男性的F＝1。

·有生育潜力的女性参与者必须在服用第一剂研究药物前72小时内具有阴性尿液或血清妊娠试验。如果尿检呈阳性或不能确认为阴性，则需要进行血清妊娠试验。

·有生育潜力的女性参与者同意从第一剂研究疗法开始到最后一剂研究疗法后60天使用适当的避孕方法。具有生育潜力的参与者是那些未经证实绝经后的那些参与者。绝经后定义为：

1.停止外源性激素治疗后闭经1年或更久

2.小于50岁女性的促黄体激素(LH)和促卵泡激素(FSH)水平在绝经后范围

3.放射诱导的卵巢切除术，末次月经>1年前

4.化疗诱导的更年期，自末次月经起间隔大于1年

5.手术绝育(双侧卵巢切除术或子宫切除术)

·从第一剂研究疗法开始到最后一剂研究疗法后60天，男性参与者必须同意使用适当的避孕方法。

·参与者在第一剂免疫疗法前30天内必须不得接种活疫苗。活疫苗的实例包括但不限于以下：麻疹、腮腺炎、风疹、水痘、带状疱疹、黄热病、狂犬病、BCG和伤寒(口服)疫苗。用于注射的季节性流感疫苗通常是灭活病毒疫苗，并且允许使用；然而，鼻内流感疫苗(例如

)是减毒活疫苗，不允许使用。如果患者入选，则其在接受免疫疗法期间以及最后一剂免疫疗法后直至30天内，不应接种活疫苗

·提供足够的归档和/或新活检的正常/肿瘤标本，用于验证性和探索性生物标志物分析

·DNA损伤修复/反应基因(DDR)突变状态的可用性，包括但不限于ATM、ATR、BRCA1/2、CDK12等。

排除标准：

·目前正在参与并接受研究疗法，或已参与试验药剂的研究，并在第一剂治疗后4周内接受研究疗法或使用研究设备；处于先前试验研究随访期的个体可以参加，只要自最后一剂先前的设备试验药剂以来已经过4周即可。

·除以下外的其他恶性肿瘤，除非经过根治治疗，>＝5年无疾病证据：经过充分治疗的非黑素瘤皮肤癌、经过根治治疗的宫颈原位癌、原位导管癌(DCIS)、1期1级子宫内膜癌。具有局限性三阴性乳腺癌病史的参与者可能符合条件，前提是他们在登记前超过三年完成辅助化疗，并且参与者仍然没有复发或转移性疾病

·患有骨髓增生异常综合征/急性髓性白血病或具有暗示MDS/AML特征的参与者。

·在继续研究之前，参与者在过去28周内接受过既往化疗或任何其他靶向治疗，或在过去3周内接受过放射治疗(姑息原因除外)。

·患有已知活动性中枢神经系统(CNS)转移和/或癌性脑膜炎的参与者。

·先前接受治疗的脑转移瘤参与者可以参加，前提是他们病情稳定[在第一剂试验治疗前至少四周内没有影像学进展的证据(如果在先前成像时使用CT，则通过CT扫描确认，或者如果在先前成像时使用MRI，则通过MRI确认)并且任何神经系统症状都已恢复到基线]，没有新的或扩大的脑转移瘤证据，并且在试验治疗前至少7天没有使用类固醇。这一例外不包括癌性脑膜炎，无论其临床稳定性如何，均被排除在外。

·无法吞咽口服施用药物的参与者和胃肠道病症可能干扰研究药物吸收的参与者

·具有被定义为严重的器官功能障碍的内脏危象的参与者，如通过体征和症状、实验室研究和疾病的快速进展进行评估的那样。

·需要全身抗生素治疗的活动性感染。需要全身抗生素治疗感染的参与者必须在开始治疗之前完成疗法。

·由于严重的、不受控制的医学病症、非恶性系统性疾病或活动性、不受控制的感染而被认为医疗风险不佳的参与者。实例包括但不限于：不受控制的室性心律失常、近期(3个月内)心肌梗死、不受控制的严重癫痫症、不稳定的脊髓压迫症、上腔静脉综合征、高分辨率计算机断层扫描(HRCT)显示的广泛间质性双侧肺病或任何不能获得知情同意的精神疾病/社会情境。

·静息ECG显示研究者判断的不受控制的、潜在可逆的心脏病况(例如，不稳定的缺血、不受控制的症状性心律失常、充血性心力衰竭、QTcF延长>500ms、电解质紊乱等)，或患有先天性长QT综合征的参与者

·对研究药剂或其赋形剂有过敏反应史的参与者。

·参与者在试验的预计持续时间内(从筛查访视开始到最后一剂试验治疗后120天)怀孕或哺乳，或期待受孕或为人父

·参与研究的规划和/或实施

·研究人员判断，如果患者不可能遵守研究程序、限制和要求，则患者不应参与研究。

Claims (32)

1.一种治疗有需要的个体中的三阴性乳腺癌的方法，包括向所述个体施用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述式(I)的化合物具有以下结构：

其中，

R为氢或C1-C3烷基；

R³选自氢、卤素、-CN和任选取代的C1-C3烷基；

R⁴选自卤素、-CN、任选取代的烷基、任选取代的氟烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基；且

R⁵为氢或任选取代的烷氧基。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述三阴性乳腺癌是转移性三阴性乳腺癌。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述三阴性乳腺癌是非转移性三阴性乳腺癌。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述三阴性乳腺癌包含基底样肿瘤。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述个体具有BRCA1突变。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述个体具有BRCA2突变。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，还包括：

a)在施用所述化合物前后监测肿瘤或正常组织中CDK12/13底物的磷酸化状态；

b)确定两个值的比；和

c)在施用所述化合物后，观察磷酸化的CDK12/13底物水平相对于总水平的下降。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述CDK12/13底物为RNA聚合酶II。

9.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，还包括：

a)监测所述肿瘤中DNA损伤反应基因的表达水平；

b)在施用所述化合物后，观察所述DNA损伤反应基因的表达水平的下降；和

c)在施用所述化合物后，监测肿瘤组织、细胞或循环肿瘤细胞DNA中DNA损伤程度的增加。

10.一种治疗有需要的个体中的卵巢癌的方法，包括向所述个体施用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述式(I)的化合物具有以下结构：

其中，

R为氢或C1-C3烷基；

R³选自氢、卤素、-CN和任选取代的C1-C3烷基；

R⁴选自卤素、-CN、任选取代的烷基、任选取代的氟烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基；且

R⁵为氢或任选取代的烷氧基。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述癌症包括转移性卵巢癌。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述癌症包括非转移性卵巢癌。

13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述卵巢癌为高级别肿瘤。

14.根据权利要求9-13中任一项所述的方法，其中所述卵巢癌为复发性卵巢癌。

15.根据权利要求10-14中任一项所述的方法，其中所述癌症包括卵巢上皮癌、生殖细胞瘤、间质瘤或卵巢肉瘤。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述卵巢肉瘤为腺肉瘤、平滑肌肉瘤或纤维肉瘤。

17.根据权利要求10-16中任一项所述的方法，其中所述个体具有BRCA1突变。

18.根据权利要求10-17中任一项所述的方法，其中所述个体具有BRCA2突变。

19.根据权利要求10-18中任一项所述的方法，还包括：

a)在施用所述化合物前后监测肿瘤或正常组织中CDK12/13底物的磷酸化状态；

b)确定两个值的比；和

c)在施用所述化合物后，观察磷酸化的CDK12/13底物水平相对于总水平的下降。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述CDK12/13底物为RNA聚合酶II。

21.根据权利要求10-18中任一项所述的方法，还包括：

a)监测所述肿瘤中DNA损伤反应基因的表达水平；

b)在施用所述化合物后，观察所述DNA损伤反应基因的表达水平的下降；和

c)在施用所述化合物后，监测肿瘤组织、细胞或循环肿瘤细胞DNA中DNA损伤程度的增加。

22.一种治疗有需要的个体中的去势抵抗性前列腺癌的方法，包括向所述个体施用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述式(I)的化合物具有以下结构：

其中，

R为氢或C1-C3烷基；

R³选自氢、卤素、-CN和任选取代的C1-C3烷基；

R⁴选自卤素、-CN、任选取代的烷基、任选取代的氟烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基；且

R⁵为氢或任选取代的烷氧基。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述去势抵抗性前列腺癌包括转移性前列腺癌。

24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述去势抵抗性前列腺癌包括非转移性前列腺癌。

25.根据权利要求22-24中任一项所述的方法，其中所述去势抵抗性前列腺癌包括腺泡状腺癌、导管腺癌、移行细胞癌、鳞状细胞癌、小细胞前列腺癌、神经内分泌癌或肉瘤。

26.根据权利要求22-25中任一项所述的方法，其中所述个体具有BRCA1突变。

27.根据权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述个体具有BRCA2突变。

28.根据权利要求22-27中任一项所述的方法，还包括：

a)在施用所述化合物前后监测肿瘤或正常组织中CDK12/13底物的磷酸化状态；

b)确定两个值的比；和

c)在施用所述化合物后，观察磷酸化的CDK12/13底物水平相对于总水平的下降。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述CDK12/13底物为RNA聚合酶II。

30.根据权利要求22-27中任一项所述的方法，还包括：

a)监测所述肿瘤中DNA损伤反应基因的表达水平；

b)在施用所述化合物后，观察所述DNA损伤反应基因的表达水平的下降；和

c)在施用所述化合物后，监测肿瘤组织、细胞或循环肿瘤细胞DNA中DNA损伤程度的增加。

31.根据权利要求7-9、19-22或28-30中任一项所述的方法，其中在施用所述化合物后，磷酸化的RNA聚合酶II水平相对于RNA聚合酶II总水平的下降和/或所述DNA损伤反应基因的所述表达水平的下降与治疗的疗效相关。

32.根据权利要求7-9、19-22或28-31中任一项所述的方法，其中所述监测样品源自PBMC细胞。

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