CN115161381A - 基于单胃动物仿生消化系统快速评定淀粉酶效果的方法 - Google Patents

基于单胃动物仿生消化系统快速评定淀粉酶效果的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于单胃动物仿生消化系统快速评定淀粉酶效果的方法，通过单胃动物仿生消化系统模拟消化过程，以还原糖释放量反映淀粉酶的效果，以解决畜禽生产中淀粉酶快速评定的问题。本发明根据动物体实际情况，从内源酶、外源酶及适宜的组合水平三个方面展开，其评定的步骤主要包括：1)样品准备；2)胃模拟消化；3)待测淀粉酶的添加；4)小肠模拟消化；5)消化残渣的收集与处理；6)葡萄糖标准曲线制作；7)比色法测定还原糖含量；8)结果计算。本发明通过体外模拟消化，以底物还原糖释放量的多寡判定淀粉酶的作用大小，选择质优的淀粉酶，提供一种体外快速、稳定、重复性好的淀粉酶评定方法。

Description

基于单胃动物仿生消化系统快速评定淀粉酶效果的方法
技术领域
本发明为一种基于单胃动物仿生消化系统快速评定淀粉酶效果的方法，涉及一种以玉米淀粉为底物通过还原糖释放量为标准在体外快速、稳定的评定淀粉酶的方法及应用。
背景技术
能量与动物的营养和健康密切相关，也是饲料原料营养价值评定研究中的备受关注的营养素。淀粉是大多数植物细胞重要的储能物质，也是动物机体主要的能量来源，淀粉的利用率决定了能量的利用率。大量研究表明，幼龄动物肠道内淀粉酶分泌不足且活性较低，造成淀粉颗粒不能被完全消化，而进入后肠段被微生物利用，因此幼龄动物能量利用率较低，限制其早期生长发育。有研究表明，饲粮中添加适量的外源淀粉酶，能有效的补足内源淀粉酶的缺乏，促进内源淀粉酶的分泌，提高表观代谢能和养分消化率，进而提高动物的生产性能，减少资源的浪费，降低生产成本。
淀粉酶是能够催化淀粉使其水解为葡萄糖、麦芽糖、低聚糖类的一类酶的总称，主要包括内切酶、外切酶、脱支酶和转移酶等几类，按照水解淀粉的方式可分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶、脱支酶及异淀粉酶。淀粉酶能将大分子的淀粉水解为可溶性的糊精、麦芽糖和低聚糖。目前，国内外饲用淀粉酶的生产以微生物发酵法为主。由于淀粉酶的菌种来源、生产工艺存在较大的差异，外源淀粉酶的效果不仅与其本身的酶学特性有关，还与目标动物的生理状态、饲粮的组成密切相关。目前，对于不同来源淀粉酶的比较仅限于酶活性的比较，其结果能否准确反映淀粉酶的效果有待进一步研究。传统的动物试验评价需要耗费大量的人力、物力、财力，同时测试条件不可控、无法标准化，不能在短时间内完成。如何准确、快速、稳定的评价饲用酶制剂的效果亟待解决。国内外研究者在外源酶制剂有效性、快速、可标准化的体外评定方法中进行了大量的探索，由于各实验室的试验材料、方法以及实验条件变异性较大，导致外源酶制剂评定的方法稳定性差、标准化程度低。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明提供一种基于单胃动物仿生消化系统快速评定淀粉酶效果的方法。该方法体外以还原糖释放量为标准快速、稳定评价淀粉酶效果的方法，通过底物释放还原糖的多寡来判断淀粉酶作用的大小，进而选择质优的淀粉酶，为外源淀粉酶的评定工作提供稳定、高效的解决方法。
为了实现以上发明目的，本发明的具体技术方案为：
一种基于单胃动物仿生消化系统快速评定淀粉酶效果的方法，该方法根据畜禽体内内源酶与外源酶的关系，首先确定适宜的内源淀粉酶添加水平，再补充外源淀粉酶，根据不同水平外源淀粉酶还原释放量的多寡，确定适宜的“内源淀粉酶+外源淀粉酶”作为淀粉酶快速评定的方法。通过单胃动物仿生消化系统模拟饲粮在畜禽体内消化过程，用3,5-二硝基水杨酸比色法测定消化液中还原糖的含量，并计算每克干物质还原糖的总量，以还原糖释放量的多寡作为淀粉酶体外快速评定的标准。
更进一步的，基于单胃动物仿生消化系统快速评定淀粉酶效果的方法，包括以下3个层次：
(1)基础(内源)淀粉酶添加水平的探索，确定适宜的基础淀粉酶；
(2)适宜外源淀粉酶的添加水平，确定最适的“内源酶+外源酶”水平；
(3)不同来源淀粉酶的比较，验证最适“内源酶+外源酶”的准确性。
主要包括以下步骤：首先将底物充分混匀后粉碎，称取0.5g底物置于特制的模拟消化器中，加入模拟胃液10mL，将模拟消化器固定于单胃动物仿生消化系统中，连接好管路，开始模拟胃消化，将酶溶解液与小肠缓冲液充分混合为待测酶液，在小肠消化前，将待测酶液与模拟小肠液加入到单胃动物仿生消化系统中，开始模拟小肠消化，模拟消化结束后，将消化液无损的转移至容量瓶中定容，用滤膜过滤，移取滤液5mL，加入去离子水10mL，稀释摇匀后移取2mL，再加入2mL去离子水和5mL DNS溶液，沸水浴5min，冷却后加去离子水16mL，摇匀。540nm处测定吸光值，从葡萄糖标准曲线查的还原糖的含量，计算底物干物质还原糖的含量。
依托单胃动物仿生消化系统快速评定淀粉酶效果的方法，具体实现步骤如下：
(1)样品准备：所述底物为玉米淀粉，将底物粉碎后过60目筛；
(2)胃模拟消化：分别称取0.5g步骤(1)所述底物置于特制消化模拟器中，空白管不加底物，加入模拟胃液，将模拟消化器安装到单胃动物仿生消化系统中，连接好管道，设置胃消化阶段参数进行模拟胃消化；
(3)待测酶制剂的添加：移取适量的酶溶解液与小肠缓冲液充分混合形成待测酶液；
(4)小肠模拟消化：胃消化结束时，将待测酶液和模拟小肠液加入到泵管中，通过蠕动泵自动加入，设置小肠消化阶段参数模拟小肠消化；
(5)消化残渣的处理：小肠消化结束后，将消化液无损的转移至容量瓶中，去离子水定容、摇匀后用滤膜过滤备用。
(6)葡萄糖标准曲线的绘制：分别移取0、0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg/mL、0.60mg/mL和0.70mg/mL的葡萄糖标准溶液各2mL，分别加入到刻度试管中，再加入2.0mL去离子水和5mL DNS试剂。震荡摇匀，沸水浴加热5min。冷却到室温后加去离子水16mL，震荡摇匀。以标准空白试样为对照调零，在540nm处测吸光度A值。以葡萄糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。
(7)还原糖含量的测定：移取滤液5mL于试管中，加入10mL去离子水，进行3倍稀释。移取2mL稀释液加入到25mL的刻度试管中，再加入去离子水2mL和5mL DNS试剂，振方摇匀，沸水浴5min。冷却到室温，加去离子水16mL，震荡摇匀。在540nm处测吸光度A值(吸光度A值应该在0.1～0.5之间)。根据测定的A值及稀释倍数，带入到葡萄糖标准曲线中，计算还原糖含量。
(8)结果计算：
还原糖总量(mg/g DM)＝[(k×Ad+b)×3×250-(k×Ac+b)×3×17.6]/(m×DM)
式中：k—标准曲线斜率；b—标准曲线截距；Ad—消化液的吸光度；Ac—消化酶空白管的吸光度；m—消化管中饲料的质量；DM—饲料样品的干物质含量。
作为优选，所述的内源淀粉酶为Sigma A3306，外源淀粉酶为待测淀粉酶。
作为优选，所述的淀粉酶为非耐高温的单一淀粉酶，固态粉末状，酶活为5000U/g～10000U/g。
作为优选，在模拟小肠消化前添加小肠缓冲液，该小肠缓冲液中溶解了待测淀粉酶；小肠缓冲液的制备方法为：称取无水磷酸氢二钠7.99g，无水磷酸二氢钠5.84g，60万U青霉素，山梨酸钾2.53g，溶解到220mL去离子水中，用1mol/L的磷酸或1mol/L的氢氧化钠在39℃调pH至6.85，冷却后转移至250mL容量瓶中定容。
作为优选，内源淀粉酶水平为974.28U(608.93U/mL)，外源酶添加水平为100U。
作为优选，所述的模拟胃液为胃蛋白酶溶液，活性为737.36U/mL；制备方法为：称取92.17KU胃蛋白酶溶解到125mL pH2.80的胃缓冲液中，缓慢搅拌直至溶解；所述的模拟小肠液为淀粉酶溶液、胰蛋白酶溶液和糜蛋白酶溶液的混合物，淀粉酶溶液中淀粉酶的活性为2435.68U/mL，胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的活性76.01U/mL，糜蛋白酶溶液中糜蛋白酶的活性9.55U/mL；模拟小肠液的制备方法为：分别称取胰蛋白酶13.377KU、糜蛋白酶1.680KU、淀粉酶Sigma A3306 42.828KU溶解到17.6mL pH＝7.00的磷酸盐缓冲液中，缓慢搅拌直至溶解。
作为优选，所述的胃消化阶段参数为：温度39℃，蠕动泵转速120rpm/min，缓冲液流速为300mL/min，消化时间为4小时；小肠消化阶段参数为：温度39℃，蠕动泵转速120rpm/min，缓冲液流速为300mL/min，消化时间为16小时。
与现有技术相加比，本发明的积极效果体现在：
本发明通过单胃动物仿生消化系统模拟消化过程，在体外模拟胃肠环境条件下测定底物释放还原糖的含量，通过底物释放还原糖的多寡判定淀粉酶的作用大小，提供一种体外快速、稳定、标准化的筛选淀粉酶的方法，对于选择质优的淀粉酶具有重要的指导意义。
附图说明
图1为本发明提供的基于单胃动物仿生消化系统快速评定淀粉酶效果的流程图
图2为葡萄糖标准曲线图
图3为不同水平内源淀粉酶与还原糖释放量的关系
图4为不同水平外源淀粉酶与还原糖释放量的关系(内源淀粉酶1948.55U)
图5为不同水平外源淀粉酶与还原糖释放量的关系(内源淀粉酶974.28U)。
具体实施方式
下面是结合具体实施例对本发明的技术方案进行进一步详细说明。
本发明技术方案中的试验材料及仿生消化过程：
1.试验材料：
内源淀粉酶：α-淀粉酶，购自sigma公司，产品目录号A3306；
外源淀粉酶：固态粉状，酶活为5000-10000U/g，分别购自5家公司。
玉米淀粉，白色粉状。
2.仪器与设备：
单胃动物仿生消化系统(湖南中本智能科技发展有限责任公司生产SDS-3)；万能粉碎机，试验筛；分析天平：分度值0.0001g；pH计：分度值0.01；恒温干燥箱；干燥器；磁力搅拌器；恒温水浴锅；分光光度计；漩涡震荡器。
3.试剂与溶液配制
3.1试剂
胃蛋白酶(Sigma P7000)；淀粉酶(Sigma A3306)；胰蛋白酶(Amresco 0785)；糜蛋白酶(Amresco 0164)；盐酸(HCl)；氯化钠(NaCl)；氯化钾(KCl)；无水磷酸氢二钠(NaH2PO4)；无水磷酸二氢钠(NaH2PO4)；山梨酸钾(C6H7KO2)；青霉素(160万U)；磷酸(H3PO4)；氢氧化钠(NaOH)；葡萄糖(C6H12O6)；3,5-二硝基水杨酸(C7H4N2O7)；四水酒石酸钾钠(C4H4KNaO6·4H2O)；苯酚(C6H5OH)；一次性注射器；0.22μm滤膜。除特别注明者外，所有试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T 6682-2008中三级水的规格。
3.2溶液配制
胃缓冲液：称取氯化钠2.59g，氯化钾0.25g，无水磷酸二氢钠6.0g，山梨酸钾1.0g，溶解到450mL去离子水中，用2mol/L的盐酸在39℃调pH至2.80，冷却后转移至500mL容量瓶中，去离子水定容。
小肠缓冲液：称取无水磷酸氢二钠7.99g，无水磷酸二氢钠5.84g，60万U青霉素，山梨酸钾2.53g，溶解到220mL去离子水中，用1mol/L的磷酸或1mol/L的氢氧化钠在39℃调pH至6.85，冷却后转移至250mL容量瓶中定容。
磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.00)：称取无水磷酸氢二钠0.545g，无水磷酸二氢钠0.739g，去离子水定容至100mL，转移到烧杯中用1mol/L的磷酸或1mol/L的氢氧化钠调节pH至7.00后备用。
模拟胃液(胃蛋白酶活性737.36U/mL):称取92.17KU胃蛋白酶溶解到125mLpH2.80的胃缓冲液中，缓慢搅拌直至溶解。配制过程中切勿加热模拟胃液，临用前配制。
模拟小肠液(淀粉酶活性2435.68U/mL，胰蛋白酶活性76.01U/mL，糜蛋白酶活性9.55U/mL)：分别称(量)取胰蛋白酶13.377KU、糜蛋白酶1.680KU、淀粉酶(Sigma A3306)42.868KU溶解到17.6mL pH＝7.00的磷酸盐缓冲液中，缓慢搅拌直至溶解。配制过程中切勿加热模拟小肠液，临用前配制。
葡萄糖溶液(浓度c(C6H12O6)＝10mg/mL):称取无水葡萄糖1.000g，加去离子水溶解定容至100mL。
氢氧化钠溶液(浓度c(NaOH)＝200g/L)：称取氢氧化钠20.0g，去离子水溶解定容至100mL。
DNS试剂：称取3,5-二硝基水杨酸3.15g，加水500mL，搅拌5s，水浴至45℃，然后逐步加入100mL氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，指导溶液澄清透明(注意：加入氢氧化钠溶液过程中，溶液温度不要超过48℃)。在逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g，继续45℃加热，同时补加去离子水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解，停止加热，冷却到室温，去离子水定容至1000mL。用玻璃过滤器过滤后保存于棕色试剂瓶中，避光保存，室温下放置7天后使用，有效期6个月。
4.单胃动物仿生消化系统仿生消化过程如下：
4.1准备
称取0.5g(精确到0.0001g)玉米淀粉置于玻璃模拟消化管中，同步测定玉米淀粉的干物质含量。
将装有1000mL去离子水的缓冲液瓶放置于单胃动物仿生消化系统中大肠缓冲液的位置，连接系统管道。打开控制软件，设定好各消化阶段的消化参数后，开始预热。
4.2模拟胃消化阶段
往模拟消化管中加入10mL模拟胃液。然后将10根模拟消化管安装到单胃动物仿生消化系统的立式模块架上；将立式模块架置于单胃动物仿生消化系统中，按照模拟消化管下端进水，上端出水的原则，连接好管路。每组5根消化模拟器间串联连接。消化液加液管与系统依次以快速接头相连，将搅拌电机与电源相连接。开始模拟胃阶段的消化，胃阶段模拟消化参数为：温度39℃，蠕动泵转速120rpm/min，缓冲液流速为300mL/min，消化时间为4小时。
4.3淀粉酶的混合与添加
在胃模拟结束前，取适量待测淀粉酶溶液与小肠液充分混匀后，取6mL置于单胃动物仿生消化系统的4号蠕动泵管中，然后将1.6mL模拟小肠液置于3号蠕动泵管中。
4.4模拟小肠消化阶段
胃模拟消化结束后，淀粉酶混合液和模拟小肠液自动泵入消化管中，开始模拟小肠段的消化过程。小肠段模拟消化的参数为：温度39℃，蠕动泵转速120rpm/min，缓冲液流速为300mL/min，小肠消化时间为16小时。
4.5消化残渣的处理
小肠模拟消化结束后，将消化液无损的转移至250mL容量瓶中，用去离子水定容，摇匀备用。从容量瓶中取20mL消化液，用一次性注射器吸取，通过0.22μm滤膜过滤，滤液备用(空白组不需要转移至容量瓶中，直接进行滤膜过滤)。
4.6葡萄糖标准曲线的制作
移取去离子水4mL，加入DNS试剂5mL，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，加去离子水16mL，震荡摇匀，制成标准空白样。
分别移取10mg/mL葡萄糖溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL和7.00mL分别用去离子水定容100mL，配制成浓度为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg/mL、0.60mg/mL和0.70mg/mL葡萄糖标准溶液。
分别移取上述系列的葡萄糖标准溶液各2mL(做2个平行)，分别加入到刻度试管中，再加入2.0mL去离子水和5mL DNS试剂。震荡摇匀，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，加去离子水16mL，震荡摇匀。以标准空白试样为对照调零，在540nm处测吸光度A值。以葡萄糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。
4.7消化液还原糖含量的测定
移取过滤后的滤液5mL于试管中，加入10mL去离子水，进行3倍稀释。
移取2mL稀释后的滤液加入到25mL的刻度试管中，再加入去离子水2mL，震荡摇匀，加入5mL DNS试剂，电磁震荡3～5秒，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，加去离子水16mL，震荡摇匀。在540nm处测吸光度A值(吸光度A值应该在0.1～0.5之间)。
根据测定的A值及稀释倍数，带入到葡萄糖标准曲线公式中，计算还原糖含量。
4.8结果计算
还原糖总量(mg/g DM)＝[(k×Ad+b)×3×250-(k×Ac+b)×3×17.6]/(m×DM)
式中：k—标准曲线斜率；b—标准曲线截距；Ad—消化液的吸光度；Ac—消化酶空白管的吸光度；m—消化管中饲料的质量；DM—饲料样品的干物质含量。
4.9重复性
每个试样称取4个平行样品进行测定，以平均值作为分析结果；结果保留两位小数；允许相对标准偏差≤2％。
下面是对本发明过程中的技术方案进行清楚、完整的描述，主要围绕3个方面展开：1.内源淀粉酶适宜水平的探索；2.适宜外源淀粉酶添加水平的探索；3.不同来源淀粉酶还原糖释放量的比较。所述的实施例仅仅是本发明部分实施例，而不是全部实施例。
实施例1：
不同水平内源淀粉酶与玉米淀粉还原糖释放量的关系
1.内源淀粉酶
内源淀粉酶：α-淀粉酶，购自sigma公司，产品目录号A3306。
2.试验设计
采用单因素试验设计，以玉米淀粉为试验底物，内源淀粉酶添加水平分别为974.28U、1948.55U、2922.82U、3897.09U和4871.36U，每个添加水平设4个重复和1个空白管，每个重复1个消化管。在单胃动物仿生消化系统中模拟消化过程，消化液测定还原糖含量。
3.试验结果
试验结果如图3所示，随着内源淀粉酶添加水平的升高，还原糖释放量呈线性升高，当内源淀粉酶添加水平超过3897.09U时，趋于平稳，符合酶与底物的关系。根据酶与底物的关系，内源淀粉酶为974.28U～2922.82U时，还原糖释放量呈线性增加，均可作为内源淀粉酶适宜的添加水平。
实施例2
不同淀粉酶添加水平与玉米淀粉还原糖释放量的关系
1.试样制备
1.1.外源淀粉酶
外源淀粉酶：某厂家标签值为5000U/g的淀粉酶，固态粉末状，酶活实测值为5216U/g。
1.2.待测淀粉酶的溶解
按照100U/mL的酶活需要量，称取适量淀粉酶产品，用少量小肠缓冲液充分溶解，将上清液倾倒入100mL容量瓶中，若有残渣，再加少量小肠缓冲液充分研磨，最终全部转移至容量瓶中，用小肠缓冲液定容至刻度线，摇匀。用4层纱布过滤，滤液备用。
1.3.淀粉酶酶活性的测定
按照GB/T 24401-2009中的方法测定淀粉酶活性。
2.试验设计
由两个小试验组成，试验一：在内源淀粉酶为1948.55U的基础上添加500U、1100U、1500U、2000U外源淀粉酶；试验二：在内源淀粉酶为974.28U的基础上添加50U、100U、200U和400U外源淀粉酶；每个水平设4个重复和1个空白管，每个重复1根消化管。在单胃动物仿生消化系统中模拟消化过程，消化液测定还原糖含量。
3.试验结果
3.1.试验一
试验结果如图4所示，在内源淀粉酶为1948.55U的基础上添加外源淀粉酶，还原糖的释放量先呈线性升高后趋于平缓，表明在0～500U的范围内适合作为外源淀粉酶的添加水平。
3.2.试验二
试验结果如图5所示，在淀粉酶为974.28U的基础上添加外源淀粉酶，还原糖的释放量呈线性升高。根据图2和图4还原糖释放量的比较，将外源淀粉酶的添加水平确定为100U。
实施例3
不同厂家淀粉酶还原糖释放量的测定
1.试验材料
选取4种不同来源的淀粉酶，淀粉酶一：5000U/g；淀粉酶二：5000U/g；淀粉酶三：10000U/g；淀粉酶四：10000U/g；
2.酶制剂的处理
按100U/mL的酶活需要量，称取适量淀粉酶产品，用少量小肠缓冲液充分溶解，将上清液倾倒入100mL容量瓶中，若有残渣，再加少量小肠缓冲液充分研磨，最终全部转移至容量瓶中，用小肠缓冲液定容至刻度线，摇匀。用4层纱布过滤，滤液备用。
3.试验设计
采用单因素试验设计，在内源淀粉酶为974.28U的基础上分别添加4种不同来源的淀粉酶各100U，每种淀粉酶设4个重复和1个空白管，每个重复1根消化管。在单胃动物仿生消化系统中模拟消化过程，消化液测定还原糖含量。根据还原糖含量的多寡确定淀粉酶的效果。
4.试验结果
表1 4种淀粉酶还原糖释放量测定结果
来源 待测淀粉酶活性(U/g) 待测液淀粉酶活性(U/mL) 还原糖释放量(mg/g)
淀粉酶一 5299±11 106±0.23 493.72±1.67
淀粉酶二 5248±4 105±0.07 519.67±4.51
淀粉酶三 11834±51 119±0.51 503.70±3.94
淀粉酶四 11375±71 114±0.71 506.23±4.22
试验结果如表1所示，4种淀粉酶还原糖释放量依次为：淀粉酶二>淀粉酶四>淀粉酶三>淀粉酶一。表明基于单位动物仿生消化系统，在内源淀粉酶为974.28U的基础上添加100U外源淀粉酶，通过还原糖释放量的多寡可以比较不同来源淀粉酶的效果。
以上所述实例仅是本专利的优选实施方式，但本专利的保护范围并不局限于此。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利原理的前提下，根据本专利的技术方案及其专利构思，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本专利的保护范围之内。

Claims (9)

1.基于单胃动物仿生消化系统快速评定淀粉酶效果的方法，其特征在于包括以下步骤：
1.1、内源淀粉酶水平的探究，以还原糖释放量确定适宜内源淀粉酶水平；
1.2、在(1.1)基础上添加不同水平的外源淀粉酶，以还原糖释放量确定最适“内源淀粉酶水平+外源淀粉酶水平”的组合；
1.3、根据(1.2)最适添加组合，用不同来源的淀粉酶进行验证，以还原糖释放量的多寡确定基于单胃动物仿生消化系统快速评定淀粉酶的可行性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于单胃动物仿生消化系统测定还原糖含量的方法包括以下步骤：
2.1样品准备；
2.2胃模拟消化；
2.3待测淀粉酶的添加，同时作空白对照；
2.4小肠模拟消化；
2.5消化残渣的收集与处理；
2.6葡萄糖标准曲线制作；
2.7比色法测定还原糖含量；
2.8结果计算。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于单胃动物仿生消化系统测定还原糖含量的方法以及淀粉酶添加的方法，包括以下步骤：
3.1样品准备：以玉米淀粉为底物，将底物粉碎后过0.3mm筛；
3.2胃模拟消化：分别称取0.5g步骤3.1所述底物置于消化模拟管中，空白管不加底物，加入模拟胃液，将模拟消化器安装到单胃动物仿生消化系统中，连接好管道，设置胃消化阶段参数模拟胃消化；
3.3待测酶制剂的添加：移取适量的酶溶解液，使其与小肠缓冲液充分混合形成待测酶液；
3.4小肠模拟消化：胃消化结束时，将待测酶液和模拟小肠液加入到泵管中，通过蠕动泵自动加入，设置小肠消化阶段参数模拟小肠消化；
3.5消化残渣的处理：小肠消化结束后，将消化液无损的转移至容量瓶中，去离子水定容、摇匀后用滤膜过滤备用；
3.6葡萄糖标准曲线的绘制：分别移取0、0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg/mL、0.60mg/mL和0.70mg/mL的葡萄糖标准溶液各2mL，分别加入到刻度试管中，再加入2.0mL去离子水和5mL DNS试剂，震荡摇匀，沸水浴加热5min；然后用自来水冷却到室温，加去离子水16mL，震荡摇匀；以标准空白试样为对照调零，在540nm处测吸光度A值。以葡萄糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线；
3.7还原糖含量的测定：移取滤液5mL于试管中，加入10mL去离子水，进行3倍稀释；移取2mL稀释液加入到25mL的刻度试管中，再加入去离子水2mL和5mL DNS试剂，震荡摇匀，沸水浴5min；冷却到室温后加去离子水16mL，震荡摇匀；在540nm处测吸光度A值；根据测定的A值及稀释倍数，带入到葡萄糖标准曲线中，计算还原糖含量。
3.8结果计算：
还原糖总量(mg/g DM)＝[(k×Ad+b)×3×250-(k×Ac+b)×3×17.6]/(m×DM)
式中：k—标准曲线斜率；b—标准曲线截距；Ad—消化液的吸光度；Ac—消化酶空白管的吸光度；m—消化管中饲料的质量；DM—饲料样品的干物质含量。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的内源淀粉酶为Sigma A3306，外源淀粉酶为待测淀粉酶。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外源淀粉酶为非耐高温的单一淀粉酶，固态粉末状，酶活为5000U/g～10000U/g。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在模拟小肠消化前添加小肠缓冲液，该小肠缓冲液中溶解了待测淀粉酶；小肠缓冲液的制备方法为：称取无水磷酸氢二钠7.99g，无水磷酸二氢钠5.84g，60万U青霉素，山梨酸钾2.53g，溶解到220mL去离子水中，用1mol/L的磷酸或1mol/L的氢氧化钠在39℃调pH至6.85，冷却后转移至250mL容量瓶中定容。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，内源淀粉酶水平为608.93U/mL，外源淀粉酶添加水平为100U。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的模拟胃液为胃蛋白酶溶液，活性为737.36U/mL；制备方法为：称取92.17KU胃蛋白酶溶解到125mL pH 2.80的胃缓冲液中，缓慢搅拌直至溶解；所述的模拟小肠液为淀粉酶溶液、胰蛋白酶溶液和糜蛋白酶溶液的混合物，淀粉酶溶液中淀粉酶的活性为2435.68U/mL，胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的活性76.01U/mL，糜蛋白酶溶液中糜蛋白酶的活性9.55U/mL。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，模拟小肠液的制备方法为：分别称取胰蛋白酶13.377KU、糜蛋白酶1.680KU、淀粉酶Sigma A3306 42.828KU溶解到17.6mL pH＝7.00的磷酸盐缓冲液中，缓慢搅拌直至溶解。
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