CN117517229A - 基于单胃动物仿生消化系统快速评定复合非淀粉多糖酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于单胃动物仿生消化系统快速评定复合非淀粉多糖酶的方法，该方法以单胃动物仿生消化系统模拟动物体内消化过程为基础，结合分光光度法测还原糖含量，以还原糖释放增加量体现复合非淀粉多糖酶作用效果，以此快速评定多种复合非淀粉多糖酶。评定步骤主要包括：1)准备添加了复合非淀粉多糖酶的底物；2)胃模拟消化；3)小肠模拟消化；4)消化液和残渣的转移与处理；5)葡萄糖标准曲线绘制；6)分光光度法测消化液还原糖的含量；8)结果计算与分析。本发明利用体外模拟消化，以底物还原糖的释放增加量评定多种复合非淀粉多糖酶的作用效果，为评估复合非淀粉多糖酶提供一种贴近动物体内作用效果的体外快速、稳定的方法。
Description
技术领域
本发明为一种基于单胃动物仿生消化系统快速评定复合非淀粉多糖酶的方法，涉及在实验室条件下，通过全自动模拟猪体内消化过程，以添加复合非淀粉多糖酶的小麦-豆粕-葵花粕为底物，测还原糖的释放量来快速评估复合非淀粉多糖酶的效果。
背景技术
酶制剂作为饲料添加剂，具有提高饲料转化利用率、扩大原料应用范围，降低饲料成本和减少环境污染的作用。非淀粉多糖是饲料纤维的主要成分，在肠道中通过增加食糜粘性，阻碍内源酶对营养物质的消化，给肠道致病菌提供有益生存环境。而非淀粉多糖复合酶可以打破细胞壁，释放营养物质；消除抗营养因子，提高原料利用率；阻碍非淀粉多糖在后肠的发酵，抑制有害菌繁殖；降低排泄量，减少环境污染，因此被广泛应用于饲料中。但市面酶制剂种类较多，其作用效果和价格存在较大差异，且当前各饲料畜牧业都在行降本增效之策，因此，如何有效地评估酶制剂的作用效果是关键之一。虽然动物试验评估酶制剂是最为直接有效的方法，但试验周期较长，若缩短试验周期，可能动物的生长性能并不能很好地反应酶制剂的作用效果，且因生长阶段、日粮类型等因素的影响，其重复性较差。因此，如何建立一种简单快速有效的体外酶制剂评估方法替代耗费大量人力、物力和财力的动物试验评估方法是急需的。
目前对酶制剂的评估方法多为通过化学分析法评定酶制剂的活性、稳定性，动物试验和单胃动物仿生消化法评定酶制剂的作用效果。化学分析法可作为基础性评价，动物实验费时、费力、费财，而基于单胃动物仿生消化系统的评定方法有一些。专利申请CN202211701970.5公开了一种体外快速评定木聚糖酶的方法，专利申请CN202210696854.2公开了基于单胃动物仿生消化快速评定淀粉酶效果的方法。这两种方法均实现了基于模拟体内作用效果快速评定酶制剂。但这两种专利申请均在小肠阶段添加待评估酶制剂的提取液，与实际生产的使用方式存在一定的差距，且用提取液短时间提取酶制剂可能存在提取不完全的情况。实际生产中添加酶制剂的饲料均从口入然后过胃阶段，再进入小肠阶段进行作用。不同的产家，其生产工艺具有较大差异。而酶制剂的作用效果与其包被和释放效果有显著相关性，过胃消化可检验其包被效果是否耐酸、其缓释速度是否过快以致只能在胃消化阶段进行作用，是否通过胃阶段后到达小肠继续作用。因此，为了使评估酶制剂的作用环境，在胃阶段添加待评估酶制剂是必要的。底物添加非淀粉多糖酶，测还原糖释放增加量，可反映其破坏植物细胞壁，释放营养物质的能力。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种基于单胃动物仿生消化系统快速评定非淀粉多糖复合酶的方法。通过全自动模拟猪体内消化过程，以添加复合非淀粉多糖酶的小麦-豆粕-葵花粕为底物，测还原糖的释放量来快速评估复合非淀粉多糖酶的效果。
为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种基于单胃动物仿生消化系统快速评定非淀粉多糖复合酶的方法，通过单胃动物仿生消化系统模拟消化过程，包括以下3个方面：
I验证胃消化阶段和小肠消化阶段添加外源非淀粉多糖酶存在差异；
II复合非淀粉多糖酶的添加水平探索，确定最适评估添加水平；
III不同复合非淀粉多糖酶的比较评估。
主要包括以下步骤：
1.前处理：底物的处理和试剂的配制；
2.系统预热和底物上机：将装有1000ml去离子水的缓冲液瓶按要求放入单胃动物仿生消化系统中的大肠缓冲液相应位置，连接好管道，打开程控系统，开启“猪饲料可消化碳水化合物总量的仿生消化测定”程序进行预热；在预热期间称取1)中处理好的底物0.8g于模拟消化管中，并设置未添加酶的底物空白对照组、无底物的酶空白对照。同时测底物干物质含量。
3.模拟胃阶段消化：每根模拟消化管中加入10ml模拟胃蛋白酶消化液，将消化管按要求安装至仿生消化系统中，连接好管路，开始胃阶段模拟消化。
4.模拟小肠消化：胃模拟消化结束后，通过自动加酶系统加入小肠缓冲液和模拟小肠液，I中通过小肠阶段添加待评估复合非淀粉多糖酶的处理组，需加入提取稀释待用的复合非淀粉多糖酶；
5.消化液的处理：模拟消化结束后将消化管内的液体通过漏斗无损转移至250ml容量瓶中，用去离子水清洗消化管壁3～5次直至无残留，然后用去离子水定容，摇匀静置备用，其中不加底物的酶空白对照组无需转移定容。过滤方法为：取30ml静置备用的消化液，用5ml一次性注射器吸取滤液通过0.22um滤膜过滤。
6.葡糖糖标准曲线制作：称取无水葡萄糖加去离子水配制10mg/ml的葡糖糖溶液，再按100倍稀释配制成0.1mg/ml～0.7mg/ml的葡糖糖标准溶液，分别移取2ml各梯度标准葡萄糖溶液至25ml刻度试管，往各刻度试管中加入2ml去离子混匀，再加入5mlDNS试剂震荡混匀，沸水浴5min进行显色反应，然后用自来水冷却至常温，再加入16ml去离子水震荡混匀，以标准空白样为对照进行调零，在540nm处测吸光度OD值。以吸光度OD值为X轴，葡萄糖浓度为Y轴绘制标准曲线；
7.测定消化液还原糖含量：取过滤备用的消化液5ml与15ml去离子水混匀进行4倍稀释，移取稀释液2ml至25ml刻度管，加2ml去离子水混匀，再加入5mlDNS试剂震荡混匀，沸水浴5min进行显色反应，然后用自来水冷却至常温，加16ml去离子水震荡混匀，在540nm处测吸光度OD值(OD值应控制在0.1～0.5之间)。将测定的OD值代入葡萄糖标准曲线中计算还原糖含量，再根据稀释倍数和定容体积计算底物还原糖释放量；
8.结果计算：
底物还原糖释放总量(mg/gDM)＝[(OD1*a+b)*X*250-(OD2*a+b)*X*17.6]/(m*DM)式中OD1为样品吸光度值，OD2为不加底物的酶空白对照吸光度值，a为标准曲线斜率，b为标准曲线截距，X为稀释倍数，m为称取的底物质量，DM为底物干物质含量；
如步骤1所述，其主要前处理准备如下：
(1)底物和待测酶制剂的处理：小麦-豆粕-葵花粕按比例混合后粉碎，过60目标准筛。I中胃阶段添加非淀粉多糖酶处理：按2000g/T的水平添加复合非淀粉多糖酶至小麦-豆粕-葵花粕底物中混合均匀待用；I中小肠阶段添加非淀粉多糖酶处理：底物不添加非淀粉多糖酶，称取0.8g复合非淀粉多糖酶，加入30ml提取液，磁力搅拌30min后用提取液定容至50ml，在4℃条件下保存2h，1000g离心5min取上清液，用提取液稀释，使小肠阶段加入到消化管中的浓度为2000g/T。
(2)胃缓冲液的制备：称取2.59g氯化钠，0.25g氯化钾，6.0g无水磷酸二氢钠，1.0g山梨酸钾配制成500mlPH2.8(39℃条件下标定)的胃缓冲溶液。
(3)模拟胃蛋白酶消化液的制备：称取92.17KU胃蛋白酶(SigmaP7000)溶解到125ml胃缓冲液中配制成模拟胃蛋白酶液。
(4)小肠缓冲液的制备：称取7.99g无水磷酸氢二钠，5.84g无水磷酸二氢钠，60万U青霉素，2.53g山梨酸钾配制成250mlPH6.85(39℃条件下标定)的小肠缓冲液。
(5)模拟小肠消化液的制备：称取41.407KU淀粉酶(SigmaA3306)，12.922KU胰蛋白酶(Amresco0785)，1.623KU糜蛋白酶(Amresco0164)溶解到17.6mlPH＝7.00的磷酸缓冲液中配制成模拟小肠消化液。
(6)DNS试剂制备：称取3,5-二硝基水杨酸3.15g，加水500mL，搅拌5s，水浴至45℃，然后缓慢加入200g/L氢氧化钠溶液100mL(此过程溶液温度不超过48℃)，同时搅拌直至溶液澄清透明。再逐步加入91.0g四水酒石酸钾钠、2.50g苯酚和2.50g无水亚硫酸钠，继续45℃水浴加热，同时补加去离子水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解，停止加热，冷却到室温，用去离子水定容至1000mL。用玻璃过滤器过滤后保存于棕色试剂瓶中，避光保存，7天后使用，有效期180天。
作为本发明种一种较好的实施方式，所述步骤中的单胃动物仿生消化系统及使用程序由湖南中本智能科技发展有限公司生产和提供，系统型号为SDS-Ⅲ，模拟运行程序为“猪饲料可消化碳水化合物总量的仿生消化测定程序”：整个运行过程温度控制在39℃，蠕动泵转速59rpm/min，模拟胃阶段消化4h，模拟小肠阶段消化16h。
与现有技术相比，本专利的有益效果体现在：
本发明通过单胃动物仿生消化系统可以快速模拟动物胃-小肠消化过程，尽可能使消化环境和条件贴近动物体内消化，相比在小肠阶段添加待评估酶制剂，通过在胃阶段添加待评估酶制剂，更真实地模拟了酶制剂在动物体内所经过的消化场所，更能有效体现其包被和缓释效果，测底物还原糖释放增加量反映复合非淀粉多糖酶破坏植物细胞壁释放营养物质的能力，以评估复合非淀粉多糖酶的作用效果，为筛选优质复合非淀粉多糖酶提供一种高效、稳定、重复性好的方法。
附图说明
图1为基于单胃动物仿生消化系统快速评定复合非淀粉多糖酶效果的操作步骤图。
图2为本专利实施例中制作并使用的葡萄糖标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，并不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所用实施例，都属于本发明的保护范围。
下述实施例中的仪器、试剂、材料等均可从商业途径获得。
参见图1，下述实施例中单胃动物仿生消化系统SDS-III，胃蛋白酶(SigmaP7000)、淀粉酶(SigmaA3306)、胰蛋白酶(Amresco0785)、糜蛋白酶(Amresco0164)从湖南中本智能科技发展有限公司统一购得。4种待评估复合非淀粉多糖酶购自3家公司，A复合酶和B复合酶购买于武汉新华扬生物股份有限公司，C复合酶购买于建明(中国)科技有限公司，D复合酶购买于潍坊康地恩生物科技有限公司。
下述实施例中万能粉碎机，60目标准筛，磁力搅拌器，分析天平(分度值0.0001g)，PH计(分度值0.01)，恒温干燥箱，恒温水浴锅，漩涡震荡仪，分光光度计，容量瓶，25ml刻度管，一次性注射器，0.22μm滤膜均为实验室配备。
下述实施例中试剂要求：盐酸，氯化钠，氯化钾，无水磷酸氢二钠，无水磷酸二氢钠，山梨酸钾，青霉素，磷酸，氢氧化钠，无水葡萄糖，3,5-二硝基水杨酸，四水酒石酸钾钠，苯酚，以上除特别注明者外，所有试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682-2008中三级水的规格。
溶液配制：
DNS试剂配制：称取3,5-二硝基水杨酸3.15g，加水500mL，搅拌5s，水浴至45℃，然后缓慢加入200g/L氢氧化钠溶液100mL(此过程中溶液温度不超过48℃)，同时搅拌直至溶液澄清透明。再逐步加入91.0g四水酒石酸钾钠、2.50g苯酚和2.50g无水亚硫酸钠，继续45℃水浴加热，同时补加去离子水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解，停止加热，冷却到室温，去离子水定容至1000mL。用玻璃过滤器过滤后保存于棕色试剂瓶中，避光保存，7天后使用，有效期180天。
葡萄糖标准溶液的配制：称取无水葡萄糖1.000g，加去离子水溶解并定容至100ml，配成10mg/ml的葡萄糖溶液。再分别吸取10mg/ml的葡萄糖溶液1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml、5.00ml、6.00ml和7.00ml至100ml容量瓶，再用去离子水定容摇匀，配制成浓度为0.10mg/ml～0.70mg/ml的葡萄糖标准溶液。
胃缓冲液的配制：称取2.59g氯化钠，0.25g氯化钾，6.0g无水磷酸二氢钠，1.0g山梨酸钾溶解到450ml去离子水中，搅拌溶解，再用盐酸将PH矫正至2.0(39℃下标定)，冷却后转移至500ml容量瓶用去离子水定容。
小肠缓冲液的配制：称取7.99g无水磷酸氢二钠，5.84g无水磷酸二氢钠，60万U青霉素，2.53g山梨酸钾溶解到220ml去离子水中，搅拌溶解，再用氢氧化钠将PH矫正至6.85(39℃下标定)，冷却后转移至250ml容量瓶并用去离子水定容。
胃模拟蛋白酶液的配制：称取92.17KU胃蛋白酶(SigmaP7000)溶解到125ml胃缓冲液中，在磁力搅拌器上缓慢搅拌直至溶解，配制过程中切勿在加热板上加热，或配制时过热，以免酶失活，临用前配制。
小肠模拟液的配制：称取41.407KU淀粉酶(SigmaA3306)，12.922KU胰蛋白酶(Amresco0785)，1.623KU糜蛋白酶(Amresco0164)溶解到17.6mlPH＝7.00的磷酸缓冲液中，在磁力搅拌器上缓慢搅拌直至溶解，配制过程中切勿在加热板上加热，或配制时过热，以免酶失活，临用前配制。
实施例1：验证胃消化阶段和小肠消化阶段添加外源非淀粉多糖酶存在差异
底物的预处理：小麦-豆粕-葵花粕按50:30:15比例混合后粉碎，过60目标准筛，记作底物1。称取0.40gA复合酶与200g粉碎后的底物1混合均匀(即按生产推荐量200g/T的10倍进行添加)，记作底物2。
准备阶段：将装有1000ml去离子水的缓冲液瓶放入单胃动物仿生消化系统的大肠缓冲液位置，连接系统与缓冲液瓶的管道。打开程控软件，找到“猪饲料可消化碳水化合物总量”程序，检查各消化参数的正确性(整个模拟过程温度39℃，蠕动泵转速120rpm/min，缓冲液流速为300mL/min，胃阶段消化时间为4h，小肠阶段消化时间为16h)，然后开始预热。在预热期间称取0.8g(精确到0.0001g)底物至立式模拟玻璃消化管中，对照组为3根消化管不加待评估酶加底物1，处理组为3根消化管加底物1、3根消化管加底物2，另设1根加内源酶不加底物的酶空白组，并同步测定各底物的干物质含量。
模拟胃消化阶段：往各模拟消化管中加入10ml胃模拟蛋白酶液后将10根模拟消化管安装到单胃动物仿生消化系统的立式专用模块架上，每组5根消化管之间串联连接好管路，再将立式模块架置于单胃动物仿生消化系统中，按照模拟消化管下端进水，上端出水的原则将立式模块和系统管道相连接，同时将消化液加液管与系统依次以快速接头相连，最后将搅拌电机与电源相连，开始模拟胃阶段消化。
A复合非淀粉多糖酶液的配制：在胃模拟消化时，称取0.8gA复合非淀粉多糖酶溶解于30ml小肠缓冲液中，磁力搅拌30min后用小肠缓冲液定容至50ml，在4℃条件下保存2h，1000g离心5min取上清液，取5ml上清液加入至45ml小肠缓冲液中进行10倍稀释，以保证小肠阶段加入到消化管中的浓度为2000g/T。
模拟小肠消化阶段：胃模拟消化结束后，底物2对应的消化管中通过SDS-III的4号蠕动泵自动注入5ml小肠缓冲液和1mlA复合非淀粉多糖酶液，对照组、酶空白对照组和底物1对应的消化管中通过SDS-III的4号蠕动泵自动注入6ml小肠缓冲液，所有10根消化管通过SDS-III的3号蠕动泵自动注入1.6ml小肠模拟液，开始模拟小肠阶段消化。
消化液残渣的处理：消化结束后，将玻璃消化管内的所有溶液和残渣干净无损地通过漏斗转移至250ml容量瓶(去离子水冲洗消化管3～5次)，然后用去离子水定容摇匀备用。从容量瓶中取30ml消化液，用5ml一次性注射器分次吸取，通过0.22μm滤膜过滤，滤液备用(酶空白组不需要转移至容量瓶，直接过滤即可)。
葡萄糖标准曲线的制作：分别移取浓度为0.1mg/ml～0.7mg/ml的葡糖糖标准溶液2ml至25ml刻度试管(每个浓度2个平行)，加入2ml去离子水混匀，再加入5mlDNS试剂震荡混匀，沸水浴5min进行显色反应，然后用自来水冷却至常温，再加入16ml去离子水震荡混匀，以标准空白样为对照进行调零，用分光光度计在540nm测吸光度OD值。以吸光度OD值为X轴，葡萄糖浓度为Y轴绘制标准曲线。见图2。
消化液还原糖含量的测定：取过滤备用的消化液5ml与15ml去离子水混匀进行4倍稀释，移取稀释液2ml至25ml刻度管，加2ml去离子水震荡混匀，再加入5mlDNS试剂震荡混匀，沸水浴5min进行显色反应，然后用自来水冷却至常温，加16ml去离子水震荡混匀，在540nm测吸光度OD值。将测定的OD值代入葡萄糖标准曲线中计算还原糖含量，再根据稀释倍数和定容体积计算底物还原糖释放量。
结果计算：
底物还原糖释放总量(mg/gDM)＝[(OD1*a+b)*4*250-(OD2*a+b)*4*17.6]/(m*DM)
式中OD1为样品吸光度值，OD2为不加底物的酶空白对照吸光度值，a为标准曲线斜率，b为标准曲线截距，4为稀释倍数，m为称取的底物质量，DM为底物干物质含量；
每个处理3个重复，即称取3个平行样品进行测定，以平均值作为结果分析，结果保留两位有效数字，允许相对标准偏差≤2％。
试验结果：结果表示，胃阶段添加A复合非淀粉多糖酶，其还原糖的释放增加量显著高于小肠阶段添加。表明基于单胃动物仿生消化系统，通过在胃阶段添加(即添加至底物混匀)待评估酶优于在小肠阶段添加待评估酶，且与动物生产中添加酶制剂后其在动物体内的作用过程更一致。
表1不同消化阶段添加A复合非淀粉多糖酶，还原糖释放量的测定结果
实施例2：复合非淀粉多糖酶的添加水平探索，确定最适评估添加水平。
在实施例1的结果上，选择在胃阶段添加A和B复合非淀粉多糖复合酶，每种复合酶设置两个添加水平，即生产推荐量200g/T，和10倍生产推荐量2000g/T，以此确定最适评估添加水平。底物对照组和酶空白对照组设置、试剂配制和操作步骤同实施例1，每个添加水平设3个重复，每个重复1根管。
试验结果：结果表示，10倍添加量的还原糖释放增加量比1倍添加量的还原糖释放增加量更容易对比差异，尤其针对可消化碳水化合物含量较高的底物选择10倍添加量更好。
表2不同复合非淀粉多糖酶添加水平，还原糖释放量的测定结果
实施例3：不同复合非淀粉多糖酶的比较评估。
在实施例1和2的结果基础上，比较不同来源的4种复合非淀粉多糖酶的效果，每种复合酶设3个重复，每个重复1根管，底物对照组和酶空白对照组设置、试剂配制和操作步骤同实施例1。
试验结果：4种复合非淀粉多糖酶还原糖释放增加量为酶B＞酶A＞酶D＞酶C。
表3不同复合非淀粉多糖酶比较，还原糖释放量的测定结果
| 复合非淀粉多糖酶 | 还原糖释放量(DM),mg/g | 还原糖释放增加量(DM),mg/g |
| 对照 | 299.57±0.34 | / |
| A | 314.45±0.46 | 14.88 |
| B | 319.44±0.58 | 19.87 |
| C | 307.48±0.42 | 7.91 |
| D | 311.77±0.54 | 12.20 |
本发明中所述的复合非淀粉多糖酶来源于市场购买的4种酶，酶组成和活性详见表4。
表4复合非淀粉多糖酶组成及酶活
上述实施例仅为本专利的优选实施方式，但本专利的保护范围并不局限于此。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利原理的前提下，根据本专利的技术方案及其专利构思，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本专利的保护范围之内。
Claims (10)
1.基于单胃动物仿生消化系统快速评定复合非淀粉多糖酶的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)待评估酶制剂与底物的混合：将底物粉碎过标准筛，再将待评估酶制剂与底物混合均匀得混合底物备用；
2)模拟猪胃消化：称取一定量的所述混合底物置于玻璃模拟消化管中，酶空白对照管不加底物只加待评估酶，对照组消化管加未添加待评估酶的底物，再加入模拟胃蛋白酶液，将模拟消化管安装至单胃动物仿生消化仪中，按要求连接好各管道，进行胃阶段模拟消化；
3)模拟小肠消化：胃阶段模拟消化结束后，按单胃动物仿生消化系统操作说明在泵管中加入小肠缓冲液和小肠消化液，通过仪器蠕动泵自动加入至模拟消化管中，进行小肠阶段模拟消化；
4)消化液的处理：在模拟消化结束后将消化液无损全部转移至容量瓶定容，摇匀过滤后备用；
5)绘制葡萄糖标准曲线；
6)利用比色法测消化液中还原糖含量；
7)结果计算。
2.如权利要求1所述的基于单胃动物仿生消化系统快速评定复合非淀粉多糖酶的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述的底物为小麦、豆粕、葵花粕的混合物，待评估酶制剂为复合非淀粉多糖酶，由木聚糖酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶、β-甘露聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、脂肪酶中2～8种酶组合而成的复合酶。
3.如权利要求2所述的基于单胃动物仿生消化系统快速评定复合非淀粉多糖酶的方法，其特征在于：底物中各组分的用量比为：小麦:豆粕:葵花粕＝50:30:15。
4.如权利要求2所述的基于单胃动物仿生消化系统快速评定复合非淀粉多糖酶的方法，其特征在于：待评估酶制剂的添加浓度为实际生产推荐量的10倍，即2000g/T。
5.如权利要求1所述的基于单胃动物仿生消化系统快速评定复合非淀粉多糖酶的方法，其特征在于：在步骤2)或3)中，所述胃模拟蛋白酶液、小肠缓冲液或模拟小肠消化液均按湖南中本智能科技发展有限公司提供的“单胃动物仿生消化系统操作手册”进行配制。
6.如权利要求1所述的基于单胃动物仿生消化系统快速评定复合非淀粉多糖酶的方法，其特征在于：在步骤4)中，所述消化液的无损转移定容具体操作为：模拟消化结束后将消化管内的液体通过漏斗无损转移至250ml容量瓶中，用去离子水清洗消化管壁3～5次，然后用去离子水定容，摇匀静置备用，其中不加底物的酶空白对照组无需转移定容。
7.如权利要求1所述的基于单胃动物仿生消化系统快速评定复合非淀粉多糖酶的方法，其特征在于：在步骤4)中，过滤方法为：取30ml静置备用的消化液，用5ml一次性注射器吸取滤液通过0.22um滤膜过滤。
8.如权利要求1所述的基于单胃动物仿生消化系统快速评定复合非淀粉多糖酶的方法，其特征在于：在步骤5)中，所述的制作标准曲线的具体操作如下：配制7个浓度梯度为0.1mg/ml～0.7mg/ml的葡糖糖标准溶液，分别移取2ml葡糖糖标准溶液溶液至25ml刻度管，再加入2ml去离子水和5mlDNS试剂混匀，沸水浴5min，冷却至常温后加16ml去离子水混匀，以标准空白样为对照进行调零，在540nm处测吸光度OD值。以吸光度OD值为X轴，葡萄糖浓度为Y轴绘制标准曲线。
9.如权利要求1所述的基于单胃动物仿生消化系统快速评定复合非淀粉多糖酶的方法，其特征在于：在步骤6)中，取过滤备用的消化液5ml与15ml去离子水混匀进行4倍稀释作为待测液，然后参照葡糖糖标准曲线的测定方法进行显色反应并测OD值，将测定的OD值代入葡萄糖标准曲线中计算还原糖含量，再根据稀释倍数和定容体积计算底物还原糖释放量。
10.如权利要求1所述的基于单胃动物仿生消化系统快速评定复合非淀粉多糖酶的方法，其特征在于：在步骤7)中，结果计算为：底物还原糖释放总量(mg/gDM)＝[(OD1*a+b)*X*250-(OD2*a+b)*X*17.6]/(m*DM)，式中OD1为样品吸光度值，OD2为不加底物的酶空白对照吸光度值，a为标准曲线斜率，b为标准曲线截距，X为稀释倍数，m为称取的底物质量，DM为底物干物质含量。
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Legal Events
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