CN115161312A - 一种食用油脂dna提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种食用油脂DNA提取方法。该方法包括：称重油脂或者磷脂10g到第一离心管，加入15ml正己烷和2ml EFG缓冲液，进行涡旋振荡操作和离心操作，取分层后的底部液体1ml于第二离心管中；加入500μl氯仿至第二离心管中，颠倒混匀进行离心操作，取上清液到第三离心管中；向第三离心管中加入0.8倍体积的异丙醇和4μl糖原，混匀室温静置至少30min，进行离心操作，遗弃上清液，加入75％的乙醇500μl进行离心操作，遗弃上清液，65℃干燥5min，加入60μl TE缓冲液溶解沉淀，在65℃放置2min，在‑20℃备用DNA；本发明节约时间成本，提取出的DNA稳定性高，对环境的毒性危害相对较小、操作安全可靠，使用耗材较少，费用较低。

Description

一种食用油脂DNA提取方法

技术领域

本发明涉及食品检测技术领域，具体涉及一种食用油脂DNA提取方法。

背景技术

食用油的安全问题在近些年引起了广泛的关注，越来越多的科研人员开始对食用油的品种鉴定以及掺假检测进行了研究。传统方法中有理化检测，主要检测技术为质谱和光谱技术(Dmam L et al.,2008)，但这两种技术容易受到生产条件、季节、产地等条件的影响，同时检测限度较高(≥5％)(齐玲倩等,2016)，相比于传统方法，应用分子生物学技术对食用油的检测具有更高的检测灵敏度、可操作性强、高效等优点(张海亮等,2010)。食用油DNA提取是分子生物学检测中的关键点和难点(何景,2012)。

通过对植物油脂DNA提取后的大量比对，发现国外对橄榄油的研究较多(VietinaM et al.,2013)，由于橄榄油本身优良的特性，并不需要对其进行精炼加工即可食用，因此对其DNA破坏程度小，提取较为容易(Scollo F et al.,2016)。我国最主要的食用油为大豆油，其次为茶籽油、棉籽油等等(付晓华等,2014)。对于植物油中的DNA提取，国外多为商用试剂盒与正己烷乳化法(Scollo F et al.,2016；

Z et al.,2014；Raieta K etal.,2015)。国内多为CTAB改良法与商用试剂盒(姚菲等,2012；吴兴泉等,2012)。

从种子到食用油，需要进行多重工艺，如脱酸、脱色、除臭等，这些都造成对DNA的严重破坏，只能保存少量的DNA片段，并且其中含有杂质和PCR抑制剂，使DNA分离纯化难度加大(Costa J et al.,2012)。因此，油脂DNA的提取是否成功，成为了检测结果的关键所在。就目前研究情况来看，部分食用油脂还存在DNA提取不成功的问题，以及提取浓度较低的问题，影响后续检测。磷脂多为深加工产品，经过醇醚浸提、丙酮等萃取后，基因组的完整性也遭到了破坏，并且难溶解，这都制约了对其DNA的提取和检测(韩建勋等,2011)。

参考文献：

1、Dmam L,Smvan R.An overview of analytical methods for determiningthe geographical origin of food products.Food Chemistry 2008,107:897-911.

2、齐玲倩,刘秀,丁梦璇,刘远远,柯润辉,尹建军.植物油DNA提取和基因检测研究进展[J].食品研究与开发,2016,37(01):220-224.

3、张海亮,吴亚君,陈银基,等.食用油中DNA提取方法的研究进展.食品与发酵工业,2010,11:128-132.

4、何景，许文涛，黄昆仑.食用油DNA提取及检测技术的研究进展.食品工业科技,2012,12:382-387.

5、Vietina M,Agrimonti C,Marmiroli N.Detection of plant oil DNA usinghigh resolution melting(HRM)post PCR analysis:a tool for disclosure of oliveoil adulteration.Food Chemistry 2013,141:3820-3826.

6、Scollo F,Egea L A,Gentile A,et al.Absolute quantification of oliveoil DNA by droplet digital-PCR(dd PCR):Comparison of isolation andamplification methodologies.Food Chemistry 2016,213:388-394.

7、付晓华,张岩,张薇,等.棉籽油中DNA不同提取方法的比较研究.中国粮油学报,2014,29:42-46.

8、

Z，

I，Zdjelar G，et al.Detection of geneticallymodified soybean in crude soybean oil.Food Chemistry 2014,145:1072-1075.

9、Raieta K,Muccillo L,Colantuoni V.A novel reliable method of DNAextraction from olive oil suitable for molecular traceability.Food Chemistry2015,172:596-602.

10、姚菲,周慧,吴苏喜.茶籽油DNA提取方法的比较.粮油食品科技,2012,20:17-20.

11、吴兴泉,张海燕,侯东东,等.植物油脂的DNA分析技术研究.中国粮油学会油脂分会第二十一届学术年会暨中国食用油产业发展论坛,2012,227-229.

12、Costa J,Mafra I,Mbpp O.Advances in vegetable oil authentication byDNA-based markers.Trends in Food Science&Technology 2012,26:43-55.

13、韩建勋,吴亚君,王斌,杨海荣,陈颖.大豆卵磷脂DNA的提取方法及应用[J].食品与发酵工业,2011,37(09):185-190.。

发明内容

本发明的目的在于提供一种食用油脂DNA提取方法，以解决现有技术存在的DNA提取不成功以及提取浓度较低的问题。

本发明提供一种食用油脂DNA提取方法，包括如下步骤：

步骤一、称重油脂或者磷脂10g到第一离心管中；

步骤二、向所述第一离心管中加入15ml正己烷和2ml EFG缓冲液；

步骤三、对所述第一离心管进行涡旋振荡操作，充分混匀第一离心管中的油脂、正己烷以及EFG缓冲液，对所述第一离心管进行离心操作；

步骤四、取所述第一离心管中分层后的底部液体1ml于第二离心管中；

步骤五、加入500μl氯仿至所述第二离心管中，颠倒混匀所述底部液体和所述氯仿，对所述第二离心管进行离心操作；

步骤六、取所述第二离心管中的上清液到第三离心管中，向所述第三离心管中加入0.8倍体积的异丙醇和4μl糖原；

步骤七、将所述第三离心管中的上清液、异丙醇和糖原混匀，室温静置至少30min后，对所述第三离心管进行第一次离心操作，遗弃所述第三离心管中的上清液，向所述第三离心管中加入75％的乙醇500μl后对所述第三离心管进行第二次离心操作；

步骤八、遗弃所述第三离心管中的上清液，对所述第三离心管进行65℃干燥5min，向所述第三离心管中加入60μl TE缓冲液溶解沉淀，在65℃放置2min，在-20℃备用DNA。

进一步地，所述步骤一中，所述第一离心管为50ml离心管。

进一步地，所述步骤二中，如果所述油脂为较难融化类油脂，向所述第一离心管中加入15ml正己烷和2ml EFG缓冲液后，将所述第一离心管置于60℃水浴锅中，至油脂融化。

进一步地，所述步骤三中，对所述第一离心管进行7500rpm离心20min。

进一步地，所述步骤四中，所述第二离心管为2ml离心管。

进一步地，所述步骤四中，如果第一离心管中液体未分层，则再向所述第一离心管中加入2ml EFG离心20min，以此重复，直至第一离心管中液体出现分层。

进一步地，所述步骤五中，对所述第二离心管进行14000rpm离心10min。

进一步地，所述步骤六中，所述第三离心管为2ml离心管。

进一步地，所述步骤七中，对所述第三离心管进行14000rpm离心20min的第一次离心操作。

进一步地，所述步骤七中，对所述第三离心管进行14000rpm离心10min的第二次离心操作。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的一种食用油脂DNA提取方法，比传统方法更为高效，相比于乳化法等方法大大节约时间成本，提取出的DNA稳定性高，通过一系列试验比对，发现此方法提取出的DNA在进行后续试验过程中结果更加稳定。对环境的毒性危害相对较小、操作安全可靠，此方法用到的有机试剂相对较少，对于实验人员以及环境危害相对较小。成本上更为节约。相比于采用吸附柱法、磁珠试剂盒等方法，本发明使用耗材较少，费用较低；相比于乳化法，本发明时间和人工成本更低。本发明为食用油脂与磷脂的DNA提取、核酸类生物性检测提供了更好的基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的食用油脂DNA提取方法的流程图；

图2为4种不同类型的磷脂RT-q PCR扩增曲线图；

图3为4种不同大豆油脂RT-q PCR扩增曲线图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本发明参考多种油脂DNA提取方法，经过大量试验，最终确定优化后食用油脂DNA提取方案，请参阅图1，本发明实施例提供的一种食用油脂DNA提取方法，具体包括如下步骤：

步骤一、称重油脂或者磷脂10g到第一离心管中。

具体地，所述步骤一中，所述第一离心管为50ml离心管。

步骤二、向所述第一离心管中加入15ml正己烷和2ml EFG缓冲液。

浸出法是利用萃取的原理，油料中的油脂可溶解在正己烷中，经过对油料的接触(浸泡)，使油料中的油脂被萃取出来的一种DNA提取方法。EFG缓冲液使蛋白变性，可高效去除DNA中的蛋白质，使DNA游离出来。

具体地，EFG缓冲液采购于Eurofins GeneScan，此外，所述步骤二中，如果所述油脂为较难融化类油脂，向所述第一离心管中加入15ml正己烷和2ml EFG缓冲液后，将所述第一离心管置于60℃水浴锅中，至油脂融化。

步骤三、对所述第一离心管进行涡旋振荡操作，充分混匀第一离心管中的油脂、正己烷以及EFG缓冲液，对所述第一离心管进行离心操作。

具体地，所述步骤三中，对所述第一离心管进行7500rpm离心20min。

步骤四、取所述第一离心管中分层后的底部液体1ml于第二离心管中。

其中，进行有机萃取后，溶液分为三层，DNA存在于最下层中。

具体地，所述步骤四中，所述第二离心管为2ml离心管。进一步地，所述步骤四中，如果第一离心管中液体未分层，则再向所述第一离心管中加入2ml EFG离心20min，以此重复，直至第一离心管中液体出现分层。

步骤五、加入500μl氯仿至所述第二离心管中，颠倒混匀所述底部液体和所述氯仿，对所述第二离心管进行离心操作。

加入氯仿可加速有机相与液相的分层，去除DNA水溶液中残留的微量酚。

具体地，所述步骤五中，对所述第二离心管进行14000rpm离心10min。

步骤六、取所述第二离心管中的上清液到第三离心管中，向所述第三离心管中加入0.8倍体积的异丙醇和4μl糖原。

具体地，离心后下层为有机相，上层为所需DNA水溶液。异丙醇用来选择性沉淀DNA。用糖原(glycogen)作为辅助沉淀剂沉淀下来的核酸更适合于后续的PCR、RT-PCR以及内切酶等核酸酶反应。

具体地，所述步骤六中，所述第三离心管为2ml离心管。

步骤七、将所述第三离心管中的上清液、异丙醇和糖原混匀，室温静置至少30min后，对所述第三离心管进行第一次离心操作，遗弃所述第三离心管中的上清液，向所述第三离心管中加入75％的乙醇500μl后对所述第三离心管进行第二次离心操作。

具体地，遗弃所述第三离心管中的上清液，收集瓶底部DNA沉淀。相对于无水乙醇，75％的乙醇性价比更高。DNA溶液以DNA水合状态稳定存在，加入乙醇后，乙醇会夺去DNA周围水分子，使DNA失水聚合沉淀。

具体地，所述步骤七中，对所述第三离心管进行14000rpm离心20min的第一次离心操作。进一步地，所述步骤七中，对所述第三离心管进行14000rpm离心10min的第二次离心操作。

步骤八、遗弃所述第三离心管中的上清液，对所述第三离心管进行65℃干燥5min，向所述第三离心管中加入60μl TE缓冲液溶解沉淀，在65℃放置2min，在-20℃备用DNA。

将废液小心清理干净，瓶底部沉淀即为所需DNA。具体地，TE缓冲液溶的用量可以根据实际浓度结果进行相应调整。

需要说明的是，本发明需要对于所提取基质的样品量进行严格控制，过多或过少都会影响提取结果。相比于吸附柱方法中称取较少的油脂量，本发明中称取的重量更容易提取出相应DNA。此外，难溶性油脂在加热过程中要注意温度以及时间把控，防止DNA遭到破坏，本发明温度为试验后最适温度。在已有相关食用油脂与磷脂DNA提取方法中，未曾见有此描述。最后，在第一次加入EFG缓冲液离心后未出现分层时，再次加入EFG缓冲液的体积要注意把控，以防对后续提取造成影响，本发明中加入的体积为多次试验后结果。图2为4种不同类型的磷脂RT-q PCR扩增曲线图，图3为4种不同大豆油脂RT-q PCR扩增曲线图，可以看出，DNA提取结果良好，扩增曲线正常。

由以上实施例可知，本发明的食用油脂DNA提取方法具有如下优点：

(1)本发明中油脂及磷脂的DNA提取方法更为高效。相比于乳化法等方法大大节约时间成本。

(2)本发明提取出的DNA稳定性高。通过一系列试验比对，发现此方法提取出的DNA在进行后续试验过程中结果更加稳定。

(3)本发明对环境的毒性危害相对较小、操作安全可靠，此方法用到的有机试剂相对较少，对于实验人员以及环境危害相对较小。

(4)本发明在成本上更为节约。相比于采用吸附柱法、磁珠试剂盒等方法，本发明使用耗材较少，费用较低；相比于乳化法，本发明时间和人工成本更低。

因此，本发明为食用油脂与磷脂的DNA提取、核酸类生物性检测提供了更好的基础。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施方式例如能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种食用油脂DNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、称重油脂或者磷脂10g到第一离心管中；

步骤二、向所述第一离心管中加入15ml正己烷和2mlEFG缓冲液；

步骤三、对所述第一离心管进行涡旋振荡操作，充分混匀第一离心管中的油脂、正己烷以及EFG缓冲液，对所述第一离心管进行离心操作；

步骤四、取所述第一离心管中分层后的底部液体1ml于第二离心管中；

步骤五、加入500μl氯仿至所述第二离心管中，颠倒混匀所述底部液体和所述氯仿，对所述第二离心管进行离心操作；

步骤六、取所述第二离心管中的上清液到第三离心管中，向所述第三离心管中加入0.8倍体积的异丙醇和4μl糖原；

步骤七、将所述第三离心管中的上清液、异丙醇和糖原混匀，室温静置至少30min后，对所述第三离心管进行第一次离心操作，遗弃所述第三离心管中的上清液，向所述第三离心管中加入75％的乙醇500μl后对所述第三离心管进行第二次离心操作；

步骤八、遗弃所述第三离心管中的上清液，对所述第三离心管进行65℃干燥5min，向所述第三离心管中加入60μl TE缓冲液溶解沉淀，在65℃放置2min，在-20℃备用DNA。

2.根据权利要求1所述的一种食用油脂DNA提取方法，其特征在于，所述步骤一中，所述第一离心管为50ml离心管。

3.根据权利要求1所述的一种食用油脂DNA提取方法，其特征在于，所述步骤二中，如果所述油脂为较难融化类油脂，向所述第一离心管中加入15ml正己烷和2ml EFG缓冲液后，将所述第一离心管置于60℃水浴锅中，至油脂融化。

4.根据权利要求1所述的一种食用油脂DNA提取方法，其特征在于，所述步骤三中，对所述第一离心管进行7500rpm离心20min。

5.根据权利要求1所述的一种食用油脂DNA提取方法，其特征在于，所述步骤四中，所述第二离心管为2ml离心管。

6.根据权利要求5所述的一种食用油脂DNA提取方法，其特征在于，所述步骤四中，如果第一离心管中液体未分层，则再向所述第一离心管中加入2ml EFG离心20min，以此重复，直至第一离心管中液体出现分层。

7.根据权利要求1所述的一种食用油脂DNA提取方法，其特征在于，所述步骤五中，对所述第二离心管进行14000rpm离心10min。

8.根据权利要求1所述的一种食用油脂DNA提取方法，其特征在于，所述步骤六中，所述第三离心管为2ml离心管。

9.根据权利要求8所述的一种食用油脂DNA提取方法，其特征在于，所述步骤七中，对所述第三离心管进行14000rpm离心20min的第一次离心操作。

10.根据权利要求9所述的一种食用油脂DNA提取方法，其特征在于，所述步骤七中，对所述第三离心管进行14000rpm离心10min的第二次离心操作。

Images