CN115161228B - 群体感应猝灭菌及其培养方法、填埋场渗滤液导排系统生物结垢防治方法 - Google Patents

群体感应猝灭菌及其培养方法、填埋场渗滤液导排系统生物结垢防治方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种群体感应猝灭菌及其培养方法、填埋场渗滤液导排系统生物结垢防治方法，群体感应猝灭菌的培养方法包括以下过程：提取填埋场渗滤液中和/或填埋场渗滤液导排系统中的过滤构件上的细菌群，将细菌群分散于溶液中，得到接种液；配置基本培养基，基本培养基以C6‑HSL和/或C8‑HSL作为唯一碳源和氮源；将接种液置于基本培养基中进行培养，分离出具有分解C6‑HSL和/或C8‑HSL能力的备选细菌；对备选细菌进行纯化。本发明得到的群体感应猝灭菌具有较好的C6‑HSL和/或C8‑HSL降解能力，可以有效降解填埋场土工布上或渗滤液中的菌群的信号分子并产生群体淬灭效果，避免因微生物聚集而形成的生物结垢，进而缓解实际填埋场中因土工布结垢而产生的填埋场下部淤堵现象。

Description

群体感应猝灭菌及其培养方法、填埋场渗滤液导排系统生物 结垢防治方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种群体感应猝灭菌及其培养方法、填埋场渗滤液导排系统生物结垢防治方法。
背景技术
填埋场是全球生活垃圾(MSW)处置的主要方式之一。全球填埋场普遍面临渗滤液导排系统淤堵的问题，一旦发生淤堵，会使导排材料渗透性下降，填埋堆体稳定性降低，渗滤液渗漏风险加剧，进而引发填埋场环境安全事故，降低填埋场生命周期。因此，渗滤液导排系统的淤堵问题被实际工程应用和环境研究领域长期关注，已成为制约填埋场安全运行的重大挑战。
渗滤液导排系统形成淤堵的成因非常复杂，包括物理沉积、化学沉淀和生物结垢等。物理沉积和化学沉淀来源于渗滤液中颗粒物沉积和金属离子形成的碳酸盐沉淀等，生物结垢是指以微生物活动为核心的生物膜生长过程。由于生物结垢中存在细菌的运动、增殖和分泌等行为，因此生物结垢被认为是最具破坏性和最难控制的结垢形式。
目前可采用纳米二氧化硅改性管道、氧化石墨烯改性土工布改变材料性质，减少细菌吸附，从而缓解生物结垢。但生物结垢的形成是细菌群体的一种自发行为，这些方法不能从根本上防止生物膜的产生，对结垢的控制效果有限。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种群体感应猝灭菌及其培养方法、填埋场渗滤液导排系统生物结垢防治方法，采用群体感应猝灭菌降解填埋场或渗滤液导排系统中的细菌间交流的自发诱导物，切断细菌之间的交流和增殖，抑制细菌分泌行为，从而管控细菌形成生物结垢行为的基因表达，利用群体感应淬灭效应从根本上缓解生物结垢的形成。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种群体感应猝灭菌，其保藏编号为：GDMCC No：62438。
本发明还公开了上述群体感应猝灭菌的培养方法，包括以下过程：
提取填埋场渗滤液中和/或填埋场渗滤液导排系统中的过滤构件上的细菌群，将所述细菌群分散于溶液中，得到接种液；
配置基本培养基，所述基本培养基包括己酰基-L-高丝氨酸内酯信号分子和/ 或辛酰基-L-高丝氨酸内酯信号分子，所述基本培养基以所述己酰基-L-高丝氨酸内酯信号分子和/或所述辛酰基-L-高丝氨酸内酯信号分子作为唯一碳源和氮源；
将所述接种液置于所述基本培养基中进行培养，分离出具有分解所述己酰基-L-高丝氨酸内酯信号分子和/或所述辛酰基-L-高丝氨酸内酯信号分子能力的备选细菌；
对所述备选细菌进行纯化，得到所述群体感应猝灭菌。
本发明还公开了一种填埋场渗滤液导排系统生物结垢防治方法，包括以下过程：用上述的群体感应猝灭菌群体感应猝灭菌降解填埋场中的细菌群。
实施本发明实施例，将具有如下有益效果：
本发明实施例通过分析填埋场渗滤液或填埋场渗滤液导排系统中的过滤构件上的细菌群，发现上述二者的细菌群中均含有较大量的己酰基-L-高丝氨酸内酯信号分子和辛酰基-L-高丝氨酸内酯信号分子，其为革兰氏阴性细菌之间交流的信号分子，该信号分子能够调控细菌产生自发诱导物，诱发细菌之间的交流和增殖，从而形成生物结垢，通过用己酰基-L-高丝氨酸内酯信号分子和辛酰基 -L-高丝氨酸内酯信号分子定向培养可降解上述两信号分子的群体感应猝灭菌，可从根本上缓解生物结垢的形成。
本发明得到的群体感应猝灭菌具有较好的己酰基-L-高丝氨酸内酯信号分子和/或辛酰基-L-高丝氨酸内酯信号分子降解能力，可以有效降解填埋场土工布上或渗滤液中的菌群的信号分子并产生群体淬灭效果，避免因微生物聚集而形成的生物结垢，进而缓解实际填埋场中因土工布结垢而产生的填埋场下部淤堵现象。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
其中：
图1是实施例1～3和空白例1的菌液中的细菌的生长曲线。
图2是群体感应猝灭实验中空白对照组样品图，其中，A为空白对照样品1 (CV026培养基)，B为空白对照样品2(CV026培养基+无菌小纸片)，C为空白对照样品3(CV026培养基+无菌水+无菌小纸片)。
图3是群体感应猝灭实验中实验组样品图，其中，A为加菌前样品(20 μMC6-HSL)，B、C、D分别为加菌后24h、48h和72h样品。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
填埋场渗滤液中具有丰富的微生物群落，目前还没有针对渗滤液中存在的群体感应淬灭菌。本发明针对填埋场分离纯化了一种可以用于降解填埋场中细菌群的群体感应淬灭菌，其保藏编号为：GDMCC No：62438；菌株编号为： Brevibacillus_agri_A1；保藏该群体感应淬灭菌样品的单位名称：广东省微生物菌种保藏中心；地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；保藏日期： 2022-4-27；以及该群体感应淬灭菌的分类命名：Brevibacillus_agri。
上述群体感应淬灭菌的培养方法包括以下步骤：
步骤1：提取填埋场渗滤液中和/或填埋场渗滤液导排系统中的过滤构件上的细菌群，将细菌群分散于溶液中，得到接种液。
具体的，在一具体实施例中，用PBS缓冲溶液分散填埋场渗滤液和/或填埋场渗滤液导排系统中的过滤构件，细菌群分散于PBS缓冲溶液中，得到混合液，从混合液中提取细菌群，PBS缓冲溶液具有稳定的pH值，且包含适合细菌生存的多种微量无机元素，可尽量提高细菌的存活率。
在填埋场渗滤液导排系统中，过滤构件是用于过滤的土工布，渗滤液在透过过滤构件时，其中的细菌易附着在过滤构件上形成生物结垢，因此，从土工布上也可以提取大量细菌。
具体的，可以将填埋场渗滤液分散于PBS缓冲溶液中，或者将土工布剪碎分散于PBS缓冲溶液中。
在一具体实施例中，使渗滤液或土工布的细菌群充分分散于PBS缓冲溶液中的方法为：剧烈晃动或旋转混合液，同时超声20s～40s，重复上述过程2～5 次。
在一具体实施例中，从混合液中提取细菌群的方法为：将混合液在5000 rpm～5500rpm转速下进行离心处理，去除混合液中的残渣和大颗粒，收集上清液，将上清液继续在5500rpm～6500rpm转速下进行离心处理，得到高纯度的颗粒状的细菌群。
优选的，将提取得到的高纯度的颗粒状的细菌群溶解于新的PBS缓冲溶液中，得到接种液。
在一具体实施例中，PBS缓冲溶液包括8g/L的NaCl、0.2g/L的KCl、1.44 g/L的Na2HPO4、和0.24g/L的KH2PO4，其pH值范围为7～8。
步骤2：配置基本培养基，基本培养基包括己酰基-L-高丝氨酸内酯信号分子(C6-HSL)和/或辛酰基-L-高丝氨酸内酯信号分子(C8-HSL)，基本培养基以己酰基-L-高丝氨酸内酯信号分子和/或辛酰基-L-高丝氨酸内酯信号分子作为唯一碳源和氮源，碳源和氮源是细菌生存的营养物质，存活下来的细菌为能够分解C6-HSL和/或C8-HSL的特定细菌。
不同细菌群的用于调控细菌间交互作用的信号分子会有所区别。经分析发现：过滤构件的生物结垢和渗滤液中用于调控细菌间交互作用的信号分子主要是C6-HSL和C8-HSL两种信号分子，则分解这两种信号分子，可以显著的抑制细菌增殖和生物结垢。
较优的，己酰基-L-高丝氨酸内酯信号分子和/或辛酰基-L-高丝氨酸内酯信号分子在基本培养基中的浓度为2mM～3mM，使得能够定向培养得到可以分解 C6-HSL和C8-HSL的群体感应猝灭菌。
优选的，基本培养基同时包括上述两种信号分子C6-HSL和C8-HSL，如此，筛选得到的细菌具有更好的降解能力。
基本培养基还包括利于细菌生长的微量无机元素等，基本培养基还包括 0.8g/L～1.2g/L的NaCl、0.4g/L～0.6g/L的KCl、0.3g/L～0.5g/L的MgCl2、 0.08g/L～0.12g/L的CaCl2、0.12g/L～0.18g/L的Na2SO4、1.6g/L～2.4g/L的KH2PO4和1.8g/L～2.7g/L的Na2HPO4。
具体的，在一具体实施例中，基本培养基还包括1g/L的NaCl、0.5g/L的 KCl、0.4g/L的MgCl2、0.1g/L的CaCl2、0.15g/L的Na2SO4、2g/L的KH2PO4和2.25g/L的Na2HPO4。
步骤3：将接种液置于基本培养基中进行培养，分离出具有分解己酰基-L- 高丝氨酸内酯信号分子和/或辛酰基-L-高丝氨酸内酯信号分子能力的备选细菌。
具体的，在一具体实施例中，包括以下过程：将接种液置于基本培养基中，在30℃～40℃下，以120rpm～180rpm的震荡速度，恒温震荡培养3天～7天后，按体积比取20％～30％样本转移到新的基本培养基中，重复执行前述培养过程2 次～4次，得到包含高浓度备选细菌的菌液。
步骤4：对备选细菌进行纯化，得到群体感应猝灭菌。该群体感应猝灭菌的保藏编号为：GDMCC No：62438，具体保藏信息参见上文。
具体的，纯化包括以下过程：
首先，将稀释后的菌液涂布于LB琼脂培养基上，于30℃～40℃温度下，进行倒扣培养24h～48h，挑选得到单菌落。
然后，将单菌落进行平板划线分离纯化，得到高纯的群体感应猝灭菌。
本发明还公开了一种填埋场渗滤液导排系统生物结垢防治方法，即用上述的群体感应猝灭菌降解填埋场中的细菌群，可以将群体感应猝灭菌封装固定于填埋场中的特定位置，例如土工布上，或者填埋场的结构层中等，或者可以将群体感应猝灭菌铺设于填埋场的结构层中。
以下为具体实施例。
实施例1
1)获取MSW填埋场中土工布上生物结垢物，取三分之一块剪碎的土工布和1mL的渗滤液加入分别含有5mL和10mL的0.01M PBS溶液(NaCl：8.0g/L， KCl：0.2g/L，Na2HPO4：1.44g/L，KH2PO4：0.24g/L)的试管中，剧烈旋转，用超声清洗仪超声30s，此过程重复3次；洗出来的部分在5200rpm条件下离心 5s，去除残渣和大颗粒，收集上清液，在6000rpm条件下离心4min。将细菌颗粒重新悬浮于PBS溶液，之后重复上述离心步骤三次。洗出来的细菌颗粒重新悬浮在5mL的PBS溶液中，获得悬浮液。
2)取100μL悬浮液作为接种液，配置2.5mM信号分子(C6-HSL、C8-HSL) 作为唯一碳源和氮源的100μL中基本培养基中(NaCl：1g/L，KCl：0.5g/L， MgCl2 0.4g/L，CaCl2：0.1g/L，Na2SO4：0.15g/L，KH2PO4：2g/L，Na2HPO4： 2.25g/L)，并通过0.45μm滤膜，之后恒温震荡(150rpm,35℃)培养3天后取50μL接种到新的体积为100μL信号分子C6-HSL、C8-HSL为唯一碳源和氮源的基本培养基中，重复此操作3次。
3)在第3次纯化培养后，将稀释后的菌液涂布于LB琼脂培养基上于35℃下进行倒扣培养，培养24h和48h，挑取形态清晰、长势良好的单菌落进行平板划线分离纯化，得到本发明的群体感应猝灭菌，之后，将群体感应猝灭菌保存在-80℃冰箱。
实施例2
实施例2与实施例1的区别仅在于：采用单一的C6-HSL进行定向培养筛选，其余均与实施例1相同。
实施例3
实施例3与实施例1的区别仅在于：采用单一的C8-HSL进行定向培养筛选，其余均与实施例1相同。
空白例1
空白例1与实施例1的区别仅在于：未使用碳源和氮源。
图1给出了实施例1～3和空白例1的菌液中的细菌的生长曲线，从图1可以看到：1)实施例1～3的菌液中的细菌在培养3天后，仍有细菌存活，说明，本发明从填埋场渗滤液和/或土工布的生物结垢的细菌群中成功定向培养筛选出具有分解C6-HSL和/或C8-HSL能力的单菌种的群体感应猝灭菌；2)本发明制得的群体感应猝灭菌具有较好的C6-HSL和/或C8-HSL降解能力，可以有效降解填埋场土工布上或渗滤液中的菌群的信号分子并产生群体淬灭效果，避免因微生物聚集而形成的生物结垢，进而缓解实际填埋场中因土工布结垢而产生的填埋场下部淤堵现象。
采用微生物16sRNA分析实施例1～3得到的单菌种的群体感应猝灭菌，表明，该菌种纯度高达99.9％。
采用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)/806R(5’ -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物标记实施例1～3得到的群体感应猝灭菌，与细菌数据库进行比对，分析其种属，属于短芽孢杆菌属。
对本发明制备的群体感应猝灭菌进行群体感应猝灭实验，本发明使用报告菌株C.violaceum CV026进行显色反应，C.violaceum CV026为紫色杆菌 ATCC31532的mini-Tn5基因突变株，本身不会产生信号分子AHLs也不产生紫色色素，但当存在外源信号分子C6-HSL，能诱导其产生紫色色素，C6-HSL信号分子浓度越大，则产生的紫色圆圈面积越大。实验过程为：将本发明制备的群体感应猝灭菌Brevibacillus_agri负载在小纸片上，取CV026培养基，向CV026 培养基中加入外源信号分子C6-HSL，使C6-HSL初始浓度为20μM，将有菌小纸片置于培养基中，分别在加菌前以及加菌后24h、48h和72h取样，得到实验组样品。制作空白对照组样品，包括：空白对照样品1(CV026培养基)、空白对照样品2(CV026培养基+无菌小纸片)和空白对照样品3(CV026培养基+ 无菌水+无菌小纸片)，结果参见图2和图3。从图中可以看到，在C6浓度为 20μM的初始浓度中紫色圆圈最大，随着Brevibacillusagri的加入时间越长，紫色圆圈越来越小，说明该菌有较好的降解信号分子的能力，实验进行到72h后几乎看不到紫色产生，说明C6信号分子被完全降解。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (2)

1. 一种群体感应猝灭菌Brevibacillus agri，其保藏编号为：GDMCC No： 62438。
2.一种填埋场渗滤液导排系统生物结垢防治方法，其特征在于，包括以下过程：用如权利要求1所述的群体感应猝灭菌降解填埋场中的细菌群。
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