CN107158957A - 一种利用群体感应淬灭固定化菌株控制膜污染的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用群体感应淬灭固定化菌株控制膜污染的方法包括如下步骤：步骤S1，对从污水处理厂取样出来的活性污泥中的细菌，运用最小培养基法进行定向分离，分离出纯化单菌落；步骤S2，对所述分离出来的纯化单菌落进行群体淬灭功能的验证，获得具有群体感应淬灭功能的功能菌株；步骤S3，对所述功能菌株采用多孔天然材料进行包埋固定，形成固化包埋菌；步骤S4，将所述固化包埋菌投加至生物膜生长反应器中，并进行膜污染防治效果综合验证。实施本发明实施例，可以利用固定化群体感应淬灭细菌高效防止过滤膜表面生物膜导致的膜污染，且成本低。

Description

一种利用群体感应淬灭固定化菌株控制膜污染的方法

技术领域

本发明涉及环保技术领域，尤其涉及一种利用群体感应淬灭固定化菌株控制膜污染的方法。

背景技术

持续增长的污水排放使污水处理面临巨大压力。在污水处理过程中存在的费用高、能耗大、中水回用率低等问题亟待解决。

我国是世界上水资源极度缺乏的13个国家之一，且水污染问题日益凸显，而全国污水排放总量却依旧呈持续增长趋势。在环保部2016年最新发布的2015年中国环境状况公报显示，2015年全国967个地表水国控断面水质监测中，I~III类、IV~V类和劣V类水质断面分别占64.5%、26.7%和8.8%。在5118个地下水水质监测点中，优良级的监测点比例仅为9.1%，较差级和极差级的监测点比例高达61.3%。长江、黄河等七大流域和700个国控断面中Ⅴ类和劣Ⅴ类共占13.6%，主要污染指标为化学需氧量、五日生化需氧量和总磷。对其中地下水开发利用程度较大、污染较严重的北方平原地区17个省（区、市）的地下水的水质监测评价结果显示： 2103个测站数据评价结果显示：水质优良、良好、较差和极差的测站比例分别为0.6%、19.8%、48.4%和31.2%，无一例水质较好的测站。水污染问题仍是较为突出的问题。

膜处理工艺在污水处理的中水回用中有着广泛应用，与传统的活性污泥污水处理工艺相比，膜工艺法具有出水浊度地低、处理效率高、占地面积小、污泥产量低等诸多优势，使该工艺在污水处理方面的应用得以迅速增长。但膜污染成为限制其长久运行及大范围推广使用的主要问题，其中的生物污染起着重要的作用。微生物在膜表面定植生长，形成具有高度水合凝胶层的稳定生物膜（biofilm），并黏附更多的有机无机颗粒，造成膜孔堵塞，这被称为膜污染。膜污染是导致膜通量减小、膜压差增大，清洗次数频繁，加速膜老化的主要原因之一，极大地阻碍了膜污水处理法的应用。目前关于膜污染防治的方法主要有物理法（膜表面属性修饰及超声振动）、化学法（利用强酸、强碱、氧化剂等清洗）和生物法（酶干扰法及群体感应淬灭法）等方法。

其中，物理法和化学法换膜成本高、风险大，且易造成抗性菌株的产生及新的环境与健康危害。

生物法的出现为从根本上防止及控制生物淤积提供了一条可能的途径，由于其环境友好，安全性高及可持续性等优势在近年来迅速崛起，备受关注，其中的群体感应淬灭技术（Quorum Quenching, QQ）更因其在生物法中实施较为容易，可操作性强，且微生物较酶更稳定等优势成为近年来膜污染生物防治的热点。

群体感应（Quorum Sensing, QS）是细菌之间对周围环境变化做出响应机制并进行信号分子交流不断做出反应的调节机制，在该系统中，首先是酶催化作用合成信号分子，当信号分子扩散转移到细胞外并进行累积，当浓度达到一定阈值后，会激活目的基因的表达，从而合成一系列功能性蛋白等物质，使细菌适应外界环境的变化。作为信号分子的自诱导物（Auto Inducer，AI）小分子化学物质有酰基高丝氨酸内酯( N-acyl HomoserineLactone，AHL)、寡肽类( Auto Inducer Peptides，AIPs) 、自然小分子（Natural SmallMolecules，NSM）以及自诱导因子Ⅱ(Autoinducer-2，AI-2) 。 其中AHL类自诱导物是细胞间交流最具有代表性的信号分子之一，是生物膜形成过程中一种非常重要的信号分子。

群体感应淬灭（Quorum Quenching，QQ）是一种通过抑制细菌之间的QS系统，从而达到控制生物膜形成的过程，目前已发现的抑制交流主要有三种途径：

（1）抑制信号分子的生物合成。如三氯生（Triclosan）是一种有效的烯酰基ACP还原酶抑制剂，烯酰基ACP还原酶参与酰基ACP的合成，而后者是生成AHL的重要物质之一。通过加入三氯生来减少AHL的产量，从而抑制QS系统。

（2）通过合成一些AHL的结构类似物，与相应受体蛋白竞争性结合，减少真正AHL与受体蛋白结合的可能性，并因此破坏其QS行为。

（3）降解信号分子：通过添加AHL降解酶降解AHL的浓度，AHL内脂酶（AHL-lactonase）和酰基转移酶（AHL-acylase）是目前研究较多且被证实能有效降解一系列AHLs的两种降解酶，内脂酶通过水解AHL的内脂键来破坏信号分子及其作用，酰基转移酶则通过作用于连在酰基高丝氨酸内脂上的氨基，生成脂肪酸和不具有任何生物活性的高丝氨酸内脂。

上述三种方式均可对QS进行抑制，使AHL浓度一直在阈值以下，不会激活目的基因的转录表达，使膜生长收到抑制，膜污染得以控制。已有研究发现城市污水厂活性污泥、处理合成污水的活性污泥及处理微污染源水的生物膜中均存在群体感应所需信号分子自诱导物的存在。如果能抑制该过程中信号分子的产生，则QS机制和生物膜形成过程将极大可能被阻断抑制。

目前通过群体感应淬灭机理控制膜污染防治主要通过添加群体感应淬灭酶，如Yeon首次证明猪肾酰基转移酶I及AHL酰基转移酶通过淬灭AHL自诱导体可防止膜生物反应器中的膜污染，Oh等分离出能够产生QQ分解酶的红球菌属（Rhodococcus sp. BH4），将BH4制成微生物管束（Microbal Vessel）。能够延缓膜污染，Kim等将BH4菌株制成细菌包埋珠（Cell Entrapping Beads,CEBs），通过细菌包埋珠对膜表面的物理冲刷和群体感应淬灭生物作用，有效延缓了膜污染，并进一步研究证明了BH4菌株生产了AHL降解酶。但目前能够运用于膜污染防治的群体感应淬灭菌种类有限，其在不同污水处理环境中的适应能力也有待验证。更多污水处理本体工程中的高效群体淬灭菌的分离有待进一步分离。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种利用群体感应淬灭固定化菌株控制膜污染的方法，可以利用固定化群体感应淬灭细菌高效防止过滤膜表面生物膜导致的膜污染，且成本低。

为了解决上述技术问题，本发明的实施例提供了一种利用群体感应淬灭固定化菌株控制膜污染的方法，包括如下步骤：

步骤S1，对从污水处理厂取样出来的活性污泥中的细菌，运用最小培养基法进行定向分离，分离出纯化单菌落；

步骤S2，对所述分离出来的纯化单菌落进行群体淬灭功能的验证，获得具有群体感应淬灭功能的功能菌株；

步骤S3，对所述功能菌株采用多孔天然材料进行包埋固定，形成固化包埋菌，所述多孔天然材料为聚乙烯醇（Polyvinyl Alcohol，PVA）、环氧树脂、海藻酸钠及其混合剂中之一种；

步骤S4，将所述固化包埋菌投加至生物膜生长反应器中，并进行膜污染防治效果综合验证，所述生物膜生长反应器为膜生物反应器（Membrane Bio-Reactor, MBR）、超滤膜片恒温生长系统或微滤膜片生物膜生长系统中之一种。

其中，所述步骤S1具体包括：

采集污水处理厂原位活性污泥，分装于离心管中并低温转移到实验室并在4℃冷藏保存，24小时内进行功能菌的分离实验：

在所述活性污泥中选择超声分散均匀的活性污泥；

将所述超声分散均匀的活性污泥置于含有N-乙酰高丝氨酸环内脂C6-HSL作为唯一碳源的96孔板基本培养基中，其中，C6-HSL终浓度为2mM~10mM；

在恒温震荡培养3天后，取体积比约1%接种到新的C6-HSL为唯一碳源的基本培养基中；

重复上述操作3次，在第三次转接培养结束时，吸取96孔板中菌液混合液涂布于LB琼脂培养板上，28-30℃倒扣培养；

在培养至24 小时、48小时时挑取形态清晰，长势良好的单菌落进行平板划线分离纯化，获得纯化单菌落。

其中，所述步骤S2具体包括：

将步骤S1中培养的活化后的纯化单菌，按1:100~1:10（V/V）的比例转接到含有10~100μM的C6-HSL的贫营养1/2 LB液体培养基中， 震荡培养至对数期后，取培养液高速离心，过0.22 μm滤膜后，制备获得无细胞上清液；

将无菌小纸片平铺在含有报告菌株紫色色杆菌CV026的LB平板上，在无菌小纸片上添加20~50 μL前述所制备的无细胞上清液，25~30℃培养过夜；

以不具有分解C6-HSL能力细菌或超纯水作为阴性对照，以具有分解C6-HSL能力细菌作为阳性对照，判断培养基的颜色变化，将紫色晕圈减少或消失的筛选出来作为具有群体感应淬灭功能的功能菌株。

其中，所述步骤S3具体包括利用海藻酸钠作为固定剂，通过低温交联制成多孔材料海藻酸钠细菌包埋珠，包括如下步骤：

将所述功能菌株恒温震荡培养至对数期后，高速离心后，弃掉上层上清液获得菌液；

将所述菌液采用超纯水配置成菌悬液，并加入到3%~5%（W/V）的已灭菌海藻酸钠中，形成海藻酸钠悬浊液；

将所述海藻酸钠悬浊液滴加到CaCl2溶液中，在2~4℃交联12 ~24小时后，形成固化包埋菌；

其中，所述菌悬液的浓度为：10~100 mg 功能菌株/ mL H2O；所述海藻酸钠悬浊液浓度为：2~20mg 功能菌株/mL悬浊液。

其中，所述步骤S4具体包括如下步骤中的至少一个：

对微滤膜片进行膜通量验证；

在生物膜生长周期内，对微滤膜片膜表面生物膜中的EPS的含量进行测定；

对反应后水样的水质可溶性化学需氧量（Chemical Oxygen Demand，COD）的含量进行定期监测；

对微滤膜片取样，进行扫描电子显微镜Scanning Electron MicroscopeSEM扫描观察或/及进行共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM）观察。

其中，所述对微滤膜片进行膜通量验证的步骤具体包括：

在功能菌株在生物膜生长反应器中经历了一个生物膜生长周期后，取出微滤膜片进行膜通量测试，同时选取在生物膜生长反应器中未添加功能菌株的微孔滤膜片作为对照组进行膜通量测试，比较两组反应器中微孔滤膜片的膜通量差别；

其中，其中，对于片状微滤/超滤膜片，采用超滤杯进行膜通量测试，在所述超滤杯中氮气压力处于10 kpa~70 kpa之间；对于中空纤维和平板膜组件，采用蠕动泵进行测试，真空压力处于10 kpa~70 kpa之间。

其中，所述对微滤膜片膜表面生物膜中的EPS的含量进行测定的步骤具体包括：

在生物膜生长周期内，采用热提取法对微滤膜片膜表面生物膜中的EPS进行提取，其中，EPS总量用多糖与蛋白质之和表征，采用苯酚-硫酸法来测定多糖，以及采用考马斯亮蓝法来测定蛋白质。

其中，所述对反应后水样的水质可溶性化学需氧量COD的含量进行定期监测的步骤具体为；

将反应后的水样通过0.45 μm滤膜过滤后，采用国际法对水质可溶性化学需氧量COD的含量定期进行监测。

其中，所述功能菌株为蜡样芽孢杆菌，其在GenBank数据库中基因序列号为KX430857。

实施本发明，具有如下有益效果：

首先，本发明实施例提出了一种新的控制膜污染的方法，通过采用最小培养基法分离纯化单菌落，并获得获得具有群体感应淬灭功能的功能菌株，通过包埋固定后投加到膜过滤系统中，从而解决现有膜过滤系统中由于生物膜的附着生长导致膜通量下降、膜污染严重、膜清洗次数频繁，膜过滤所需压力增大、成本增加等问题；与对照组相比，采用本方法的实验组膜通量明显高于对照组（大约高60%），且微滤膜表面胞外聚合物EPS含量明显低于对照组（减少约40%）；

其次，在本发明实施例中，在对菌株富集固定过程中所采用的材料聚乙烯醇（PVA）、环氧树脂、海藻酸钠等材料均属于多孔结构，有利于溶液中信号分子的交流，保证了包埋菌能够有效降解溶液中AHL类信号分子，多孔结构有利于营养物质和空气的流通，保证了细菌的存活率和性能；

而且，上述材料属于无毒高分子聚合物，在原有反应系统中不会引入额外污染物，使用本发明的方法不会像化学法添加清洗药品会对反应液内生态环境造成毒害作用，也不会对反应系统的出水水质产生影响，其中，化学需氧量COD降解率均在90%左右;

另外，在本发明实施例中，通过生物法从生物膜形成过程着手，对生物膜形成过程中所需信号分子进行降解，而不是对生物膜进行机械清洗或化学药品破坏，从根本上控制了膜污染，且成本低。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明提供的一种利用群体感应淬灭固定化菌株控制膜污染的方法的一个实施例的主流程示意图；

图2是一种自主设计搭建的超滤杯的结构示意图；

图3为图1的步骤S4一个实施例中实验组与对照组的COD的含量对比示意图；

图4a-图4c为图1的步骤S4一个实施例中反应后期实验组微滤膜片SEM图片示意图；

图5a-图5c为图1的步骤S4一个实施例中反应后期对照组微滤膜片SEM图片示意图；

图6a-图6b为图1的步骤S4一个实施例中实验组与对照组的微滤膜片的CLSM图片示意图。

具体实施方式

下面参考附图对本发明的优选实施例进行描述。

请参考图1所示，是本发明提供的一种利用群体感应淬灭固定化菌株控制膜污染的方法的一个实施例的主流程示意图。在该实施例中，该方法包括如下的步骤：

步骤S1，对从污水处理厂取样出来的活性污泥中的细菌，运用最小培养基法进行定向分离，分离出纯化单菌落；

具体地，该步骤S1进一步包括如下过程：

采集污水处理厂原位活性污泥，分装于离心管中并低温转移到实验室并冷藏保存，24小时内进行功能菌的分离实验，具体地，可以在实际运行的污水处理厂中取约3~10mL的活性污泥于离心管中，并迅速放入便携式冷冻盒中，迅速转移至实验室，进行菌株的分离及富集，如实验室暂不适合下一步操作，则可将采集样品放于4℃冰箱中低温保存，并在24小时内完成样本功能菌的分离，超过24小时则样本失效，需要重新采集：

在所述活性污泥中选择超声分散均匀的活性污泥；

将所述超声分散均匀的活性污泥置于含有N-乙酰高丝氨酸环内脂C6-HSL作为唯一碳源的96孔板基本培养基中，其中，C6-HSL终浓度为2mM~10mM；

在恒温震荡培养3天后，取体积比约1%接种到新的C6-HSL为唯一碳源的基本培养基中；

重复上述操作3次，在第三次转接培养结束时，吸取96孔板中菌液混合液涂布于LB琼脂培养板上，28-30℃倒扣培养；

在培养至24 小时、48小时时挑取形态清晰，长势良好的单菌落进行平板划线分离纯化，获得纯化单菌落，该纯化单菌落可以通过-80℃低温甘油冻存。

步骤S2，对所述分离出来的纯化单菌落进行群体淬灭功能的验证，获得具有群体感应淬灭功能的功能菌株；具体包括：

将步骤S1中培养的活化后的纯化单菌落，按1:100~1:10（V/V）的比例转接到含有10~100 μM的C6-HSL的贫营养1/2 LB液体培养基中， 震荡培养至对数期后，取培养液高速离心，过0.22 μm滤膜后，制备获得无细胞上清液；

将无菌小纸片平铺在含有报告菌株紫色色杆菌CV026的LB平板上，在无菌小纸片上添加20~50 μL前述所制备的无细胞上清液，25~30℃培养过夜，其中，在该步骤之前进一步包括：将报告菌株CV026 25~30℃恒温LB液体培养12~24 小时后，待已灭菌LB琼脂培养基不烫手也未凝固时，按1%~5%（V/V）的比例加入前培养的CV026液体培养基，倒板冷却；

以不具有分解C6-HSL能力细菌或超纯水作为阴性对照，以具有分解C6-HSL能力细菌（即前一步骤中获得的纯化单菌落）作为阳性对照，判断培养基的颜色变化，将紫色晕圈减少或消失的筛选出来作为具有群体感应淬灭功能的功能菌株；具体地，因为报告菌株CV026本身不会产生信号分子AHLs，也不产生紫色色素，但当存在外源信号分子，如C6- HSL，能诱导其产生紫色色素。若分离菌株未能分解C6-HSL，则残留的C6-HSL会诱导报告菌株CV026产生紫色色素，圆纸片周围出现紫色圆晕；若分离菌有QQ功能，能分级C6-HSL，则报告菌株不会被诱导产生紫色色素，圆纸片周围无紫色圆出现；

步骤S3，对所述功能菌株采用多孔天然材料进行包埋固定，形成固化包埋菌，所述多孔天然材料为聚乙烯醇PVA、环氧树脂、海藻酸钠及其混合剂中之一种；

在一个实施例中，所述步骤S3具体为利用海藻酸钠作为固定剂，通过低温交联制成多孔材料海藻酸钠细菌包埋珠，包括如下步骤：

将所述功能菌株恒温震荡培养至对数期后，高速离心后，弃掉上层上清液获得菌液；

将所述菌液采用超纯水配置成菌悬液，并加入到3%~5%（W/V）的已灭菌海藻酸钠中，形成海藻酸钠悬浊液；

将所述海藻酸钠悬浊液滴加到CaCl2溶液中，在2~4℃交联12 ~24小时后，形成固化包埋菌，取出所述固化包埋菌后，可以用无菌水冲洗三次，然后在4℃冰箱内保存；

其中，所述菌悬液的浓度为：10~100 mg 功能菌株/ mL H2O；所述海藻酸钠悬浊液浓度为：2~20mg 功能菌株/mL悬浊液。

可以理解的是，在步骤S3中不限于采用海藻酸钠进行固定。例如，在另一个实施例中，在所述步骤S3中具体地也可以利用聚乙烯醇作为固定剂，通过冷冻解冻法制成多孔材料聚乙烯醇细菌包埋珠，具体步骤在此不进行详述，可以参照《PVA固定高效苯酚降解菌的性能》（张红涛、刘永军、张云鹏，《化工进展》，2013年32（7），1712-1716页）中的描述。

步骤S4，将所述固化包埋菌投加至生物膜生长反应器中，并进行膜污染防治效果综合验证，所述生物膜生长反应器为膜生物反应器MBR、超滤膜片恒温生长系统或微滤膜片生物膜生长系统中之一种，具体地，按体积比≤1%加入所述固化包埋菌，同时活性污泥的体积比为1%~4%；

其中，所述步骤S4中的综合验证包括对对膜通量进行验证、对EPS含量验证、对可溶性化学需氧量SCOD的含量验证、扫描电子显微镜SEM扫描观察以及共聚焦激光扫描显微镜CLSM观察中的一个或多个，具体地，所述步骤S4具体包括下述中至少一个步骤：

步骤S40，在给定条件下运行反应体系，定期对微滤膜片进行膜通量验证，具体地，在功能菌株在生物膜生长反应器中经历了一个生物膜生长周期后，取出微滤膜片进行膜通量测试，同时选取在生物膜生长反应器中未添加功能菌株的微孔滤膜片作为对照组进行膜通量测试，比较两组反应器中微孔滤膜片的膜通量差别，其中，对于片状微滤/超滤膜片，采用自主设计搭建的超滤杯进行膜通量测试，在所述超滤杯中氮气压力处于10 kpa~70 kpa之间。对于中空纤维和平板膜组件，采用蠕动泵进行测试，真空压力处于10 kpa~70 kpa之间；如图2所示，示出了一种自主设计搭建的超滤杯的结构示意图；在一组实验中，与对照组相比，实验组膜通量高出60%左右；

步骤S41，在生物膜生长周期内，对微滤膜片膜表面生物膜中的EPS的含量进行测定；具体地，在生物膜生长周期内，采用热提取法对微滤膜片膜表面生物膜中的EPS进行提取，其中，EPS总量用多糖与蛋白质之和表征，采用苯酚-硫酸法来测定多糖，以及采用考马斯亮蓝法来测定蛋白质；

其中，在一个例子中，采用如下的热提取法来提取生物膜中的EPS：将反应后的微滤膜片剪碎于0.9% NaCl溶液中，超声1~10 分钟，以100~200转/分钟摇匀持续1~10 分钟，然后超声1~10分钟，60~90℃水浴20~50分钟，取出微滤膜碎片后，10000~15000转/分钟离心15~30 分钟，取上清液测定EPS含量；

步骤S42，对反应后水样的水质可溶性化学需氧量SCOD的含量进行定期监测，具体地，将反应后的水样通过0.45 μm滤膜过滤后，采用国际法对水质可溶性化学需氧量SCOD的含量定期进行监测，通过该监测可以探究额外添加QQ菌是否会对原反应体系出水COD水质指标带来负影响，COD含量依据标准方法《水和废水监测方法第四版）》进行测定；

步骤S43，对微滤膜片取样，进行扫描电子显微镜SEM扫描观察或/及进行共聚焦激光扫描显微镜CLSM观察。

具体地，取微滤膜片，按照生物样本预处理方式进行预处理后，置于SEM激光扫描电镜下观察，其中，在一个实施例中，该预处理操作具体为：样本膜片用去离子水轻轻冲洗表面附着的不属于生物膜部分的活性污泥等絮体，剪取有代表性的一部分，用2.5%（V/V）的戊二醛4℃固定2小时；酒精梯度干燥（酒精浓度30%, 50%, 70%, 80%,90%，95%,脱水干燥时间15分钟，酒精浓度100% 干燥时间20分钟), 超净台进一步干燥后，喷金箔观察。

其中，在一个实施例中，所述步骤S2中获得的功能菌株为蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus），其在GenBank数据库中基因序列号为KX430857，可以理解的是，采用本发明提供的方法，也可以获得其他具有群体感应淬灭功能的功能菌株。

可以理解的是，为了更便于了解步骤S4中的综合验证效果，在本发明的一个实施例中，采用实验组以及对比组进行相应的监测和验证。

其中，在生物膜生长反应器中添加含有功能菌株（如蜡样芽孢杆菌）的固化包埋菌的作为实验组（A组）；在生物膜生长反应器中添加空海藻酸钠包埋珠的作为对照1组（B组）；以及在生物膜生长反应器中未添加包埋珠的作为对照2组（C组）。

其中，图3示了出一个实施例中实验组与对照组的出水水质的COD的含量对比示意图；从中可以看出，实验组以及两个对照组的最终出水水质中，COD降解率均稳定在90%左右，故在生物膜生长反应器中添加含有功能菌株的固化包埋菌不会对出水水质形成明显影响，其是一种环境友好型的方法；

如图4a-图4c为图1的步骤S4一个实施例中反应后期实验组（A组）微滤膜片SEM图片示意图，其中，图4a为放大1000倍的图片，图4b为放大5000倍的图片，图4c为放大10000倍的图片；

而图5a-图5c为图1的步骤S4一个实施例中反应后期对照组（C组）微滤膜片SEM图片示意图，其中，图5a为放大1000倍的图片，图5b为放大5000倍的图片，图5c为放大10000倍的图片；

从上述图片可以看出，在实验组（A组）的微滤膜片表面仍存在有较多的孔状结构，有利于膜过滤的顺利进行，而同时期对照组（C组）表面覆盖有较多的生物膜物质，造成了膜孔堵塞，膜污染严重，膜通量下降。

而图6a-图6b为图1的步骤S4一个实施例中实验组（A组）与对照组（C组）的微滤膜片的膜表面的的CLSM图片示意图。从上述图片可以看出，实验组（A组）的膜表面无绿色荧光物质显现，表明其表面的微生物含量很少或活性很低，由此产生的生物膜的量也较少，膜污染现象基本没有，而对照组（C组）图片绿色显荧光的面积显著多于实验组，表明在实验开始初期群体感应淬灭菌株已经显示出控制膜污染的性能，效果显著。

实施本发明的实施例，具有如下有益效果：

首先，本发明实施例提出了一种新的控制膜污染的方法，通过采用最小培养基法分离纯化单菌落，并获得获得具有群体感应淬灭功能的功能菌株，通过包埋固定后投加到膜过滤系统中，从而解决现有膜过滤系统中由于生物膜的附着生长导致膜通量下降、膜污染严重、膜清洗次数频繁，膜过滤所需压力增大、成本增加等问题；与对照组相比，采用本方法的实验组膜通量明显高于对照组（大约高60%），且微滤膜表面胞外聚合物EPS含量明显低于对照组（减少约40%）；

其次，在本发明实施例中，在对菌株富集固定过程中所采用的材料聚乙烯醇（PVA）、环氧树脂、海藻酸钠等材料均属于多孔结构，有利于溶液中信号分子的交流，保证了包埋菌能够有效降解溶液中AHL类信号分子，多孔结构有利于营养物质和空气的流通，保证了细菌的存活率和性能；

而且，上述材料属于无毒高分子聚合物，在原有反应系统中不会引入额外污染物，使用本发明的方法不会像化学法添加清洗药品会对反应液内生态环境造成毒害作用，也不会对反应系统的出水水质产生影响，其中，COD降解率均在90%左右;

另外，在本发明实施例中，通过生物法从生物膜形成过程着手，对生物膜形成过程中所需信号分子进行降解，而不是对生物膜进行机械清洗或化学药品破坏，从根本上控制了膜污染，且成本低。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (8)

1.一种利用群体感应淬灭固定化菌株控制膜污染的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1，对从污水处理厂取样出来的活性污泥中的细菌，运用最小培养基法进行定向分离，分离出纯化单菌落；

步骤S2，对所述分离出来的纯化单菌落进行群体淬灭功能的验证，获得具有群体感应淬灭功能的功能菌株；

步骤S3，对所述功能菌株采用多孔天然材料进行包埋固定，形成固化包埋菌，所述多孔天然材料为聚乙烯醇PVA、环氧树脂、海藻酸钠及其混合剂中之一种；

步骤S4，将所述固化包埋菌投加至生物膜生长反应器中，并进行膜污染防治效果综合验证，所述生物膜生长反应器为膜生物反应器MBR、超滤膜片恒温生长系统或微滤膜片生物膜生长系统中之一种。

2.如权利要求1所述的利用群体感应淬灭固定化菌株控制膜污染的方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括：

采集污水处理厂原位活性污泥，分装于离心管中并低温转移到实验室并在4℃冷藏保存，24小时内进行功能菌的分离实验：

在所述活性污泥中选择超声分散均匀的活性污泥；

将所述超声分散均匀的活性污泥置于含有N-乙酰高丝氨酸环内脂C6-HSL作为唯一碳源的96孔板基本培养基中，其中，C6-HSL终浓度为2mM~10mM；

在恒温震荡培养3天后，取体积比约1%接种到新的C6-HSL为唯一碳源的基本培养基中；

重复上述操作3次，在第三次转接培养结束时，吸取96孔板中菌液混合液涂布于LB琼脂培养板上，28-30℃倒扣培养；

在培养至24 小时、48小时时挑取形态清晰，长势良好的单菌落进行平板划线分离纯化，获得纯化单菌落。

3.如权利要求1所述的利用群体感应淬灭固定化菌株控制膜污染的方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括：

将步骤S1中培养的活化后的纯化单菌，按1:100~1:10（V/V）的比例转接到含有10~100μM的C6-HSL的贫营养1/2 LB液体培养基中， 震荡培养至对数期后，取培养液高速离心，过0.22 μm滤膜后，制备获得无细胞上清液；

将无菌小纸片平铺在含有报告菌株紫色色杆菌CV026的LB平板上，在无菌小纸片上添加20~50 μL前述所制备的无细胞上清液，25~30℃培养过夜；

以不具有分解C6-HSL能力细菌或超纯水作为阴性对照，以具有分解C6-HSL能力细菌作为阳性对照，判断培养基的颜色变化，将紫色晕圈减少或消失的筛选出来作为具有群体感应淬灭功能的功能菌株。

4.如权利要求1所述的利用群体感应淬灭固定化菌株控制膜污染的方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括利用海藻酸钠作为固定剂，通过低温交联制成多孔材料海藻酸钠细菌包埋珠，包括如下步骤：

将所述功能菌株恒温震荡培养至对数期后，高速离心后，弃掉上层上清液获得菌液；

将所述菌液采用超纯水配置成菌悬液，并加入到3%~5%（W/V）的已灭菌海藻酸钠中，形成海藻酸钠悬浊液；

将所述海藻酸钠悬浊液滴加到CaCl2溶液中，在2~4℃交联12 ~24小时后，形成固化包埋菌；

其中，所述菌悬液的浓度为：10~100 mg 功能菌株/ mL H2O；所述海藻酸钠悬浊液浓度为：2~20mg 功能菌株/mL悬浊液。

5.如权利要求1所述的利用群体感应淬灭固定化菌株控制膜污染的方法，其特征在于，所述步骤S4具体包括如下步骤中的至少一个：

对微滤膜片进行膜通量验证；

在生物膜生长周期内，对微滤膜片膜表面生物膜中的EPS的含量进行测定；

对反应后水样的水质可溶性化学需氧量COD的含量进行定期监测；

对微滤膜片取样，进行扫描电子显微镜SEM扫描观察或/及进行共聚焦激光扫描显微镜CLSM观察。

6.如权利要求5所述的利用群体感应淬灭固定化菌株控制膜污染的方法，其特征在于，所述对微滤膜片进行膜通量验证的步骤具体包括：

在功能菌株在生物膜生长反应器中经历了一个生物膜生长周期后，取出微滤膜片进行膜通量测试，同时选取在生物膜生长反应器中未添加功能菌株的微孔滤膜片作为对照组进行膜通量测试，比较两组反应器中微孔滤膜片的膜通量差别；

其中，对于片状微滤/超滤膜片，采用超滤杯进行膜通量测试，在所述超滤杯中氮气压力处于10 kpa~70 kpa之间；对于中空纤维和平板膜组件，采用蠕动泵进行测试，真空压力处于10 kpa~70 kpa之间。

7.如权利要求6所述的利用群体感应淬灭固定化菌株控制膜污染的方法，其特征在于，所述对微滤膜片膜表面生物膜中的EPS的含量进行测定的步骤具体包括：

在生物膜生长周期内，采用热提取法对微滤膜片膜表面生物膜中的EPS进行提取，其中，EPS总量用多糖与蛋白质之和表征，采用苯酚-硫酸法来测定多糖，以及采用考马斯亮蓝法来测定蛋白质。

8.如权利要求6所述的利用群体感应淬灭固定化菌株控制膜污染的方法，其特征在于，所述对反应后水样的水质可溶性化学需氧量COD的含量进行定期监测的步骤具体为；

将反应后的水样通过0.45μm滤膜过滤后，采用国标法对水质可溶性化学需氧量COD的含量定期进行监测。