CN115124505A - 一种吲哚生物碱类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物化学技术领域，具体涉及一种具有显著抗烟草花叶病毒活性吲哚生物碱类化合物及其制备方法与应用。所述化合物分子式为：C₁₉H₂₀N₂O₅，其具有下述结构：

本发明化合物首次从基因编辑烟草中分离得到，通过核磁共振和质谱测定方法确定为吲哚生物碱类化合物，并表征了其具体结构。该吲哚生物碱类化合物具有很好的抗烟草花叶病毒活性：经对抗烟草花叶病毒的实验，其相对抑制率达到71.5％，显著高于对照品宁南霉素的相对抑制率(33.2％)。本发明化合物结构简单，活性高，在制备抗烟草花叶病毒药物中有良好的应用前景，可作为抗烟草花叶病毒药物的先导性化合物。

Description

一种吲哚生物碱类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于植物化学技术领域，具体涉及一种具有突出抗烟草花叶病活性的吲哚生物碱类化合物，该化合物从基因编辑烟草中分离得到。

背景技术

吲哚类化合物是在自然界中存在最广泛的杂环种类，许多含有吲哚结构的化合物已被证实具有显著的生物活性，如吲哚类生物碱是迄今发现最多的一类生物碱，约占已知生物碱的四分之一。上世纪60年代以来，人们不断从植物、微生物中分离得到许多新型的吲哚杂环生物碱，如吲哚-嘧啶类生物碱、吲哚-咪唑类生物碱、吲哚-噁唑类生物碱、吲哚-哌嗪类生物碱等，这些天然产物结构上多是吲哚和其他各类活性杂环骨架相结合，具有新颖的结构和一系列极强的生理活性，已引起了科学工作者的浓厚兴趣。

由于具有结构多样、生物活性丰富、成药率高等特点，吲哚类生物碱一直是天然药物化学研究的热点。迄今已报道单萜吲哚生物碱(MIAs)约3000个，其中应用于临床药物有数十个，如长春碱类、喜树碱类、奎宁碱类、士的宁碱类、玫瑰树碱类等。

烟草是目前研究最充分、次生代谢产物最丰富的植物之一。从烟草中鉴定出的化合物高达4000多种，其中二萜类化合物、倍半萜类化合物、黄酮类化合物、生物碱、香豆素等类型的化合物均具有显著的生物活性，是重要的药物和生物农药先导化合物来源。

近几年来，基因编辑技术广泛应用于作物品种改良。和其他手段相比，基因编辑优势明显，一个重要特点是定点饱和突变，可以实现DNA水平的精准修改，通过对小片段碱基的删除或插入、单碱基的精准替换、等位基因替换等基因编辑技术，可以改变基因表达的模式以及解析基因的功能。由于基因和植物的代谢密切相关，基因的改变会引起植物代谢网络发生变化，从而导致代谢成分的含量、种类发生变化，因此基因编辑植物成为了发现活性代谢成分的重要来源。也正因如此，充分研究基因编辑烟草中的活性成分，对从烟草中发现具有生物活性的次生代谢产物、促进烟草的综合开发利用具有十分重要的意义。本发明从基因编辑烟草中发现了一种新的吲哚生物碱化合物，值得关注的是该化合物具有显著的抗烟草花叶病毒活性。

发明内容

本发明从基因编辑烟草中分离得到了一种具有抗烟草花叶病毒活性的新吲哚生物碱类化合物，该化合物至今尚未见到相关报道。

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

本发明第一方面提供一种吲哚生物碱类化合物，所述化合物分子式为：C₁₉H₂₀N₂O₅，其具有下述结构：

该化合物为黄色胶状物，命名为：烟草吲哚-D，英文名为：Nicindole-D。

本发明第二方面提供第一方面所述的吲哚生物碱类化合物的制备方法，具体包括以下步骤：

A、浸膏提取：烟叶样品用90wt％～99wt％乙醇超声提取后，提取液加入到乙酸乙酯与3wt％的酒石酸混合液中，待混合溶液静置分层后，再用Na₂CO₃溶液将水层pH值调节至9.0，并用乙酸乙酯再次萃取，经过滤，减压浓缩成浸膏。

B、硅胶柱层析：将步骤A得到的浸膏用200～300目硅胶干法装柱，进行硅胶柱层析；以体积配比分别为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，合并相同极性的部分，收集各部分洗脱液并浓缩；其中，所述硅胶与所述浸膏的质量比为2～5；收集其中用体积比为9:1的氯仿-甲醇溶液洗脱时得到的洗脱液，称为第一洗脱液；将上述第一洗脱液用硅胶层析柱继续分离，用体积配比依次为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的一系列氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集其中用体积比为9:1的氯仿-丙酮溶液洗脱时得到的洗脱液，称为第二洗脱液。

C、高效液相色谱分离：将B步骤最终得到的第二洗脱液通入高效液相色谱进行分离纯化，所述高效液相色谱法分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的ZorbaxPrepHTGF色谱柱，流速为12mL/min，流动相为65wt％的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为322nm，第三洗脱液每次进样200μL，收集每次进样后色谱峰保留时间为28.9min时所对应的洗脱液，称为第三洗脱液，将该第三洗脱液脱除溶剂后即得所述的吲哚生物碱类化合物。

优选地，所述步骤A中，乙醇的浓度优选为95wt％。

优选地，步骤B中，所述浸膏在经硅胶柱层析粗分前，用甲醇溶解后用重量比1.5～2.5倍的80～120目硅胶拌样。

优选地，所述步骤C中，高效液相色谱法分离纯化后，所得化合物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化。

本发明第三方面提供第一方面所述的吲哚生物碱类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。

以上述方法制备的吲哚生物碱类化合物的结构是通过以下方法测定出来的：

外观观测发现：本发明化合物为黄色胶状物；

紫外-可见吸收光谱显示其在286与322nm处有最大吸收，证明该化合物中存在芳香环结构；

红外光谱(溴化钾压片)显示该化合物中有羟基(3405cm^-1)、胺基(3316cm^-1)、羰基(1715、1682和1655cm^-1)、芳香环(1618、1567和1453cm^-1)特征官能团；高分辨质谱(HRESIMS)给出准分子离子峰379.1267[M+Na]⁺，可确定化合物的分子式为C₁₉H₂₀N₂O₅，不饱和度为11。结合¹H和¹³C与HSQC NMR数据，显示该化合物包括一个1,2,4,5-四取代的苯环(C-4～C-7、C-3a、C-7a和H-7)，一个3-羟基丙酮基(–COCH₂CH₂OH，C-9'～C-11'，H₂-10'和H₂-11')，一个6-(氨基甲基)-5-甲基吡啶-2-(1H)-酮结构片段，一个羰基(C-1)，一个亚甲基(C-3和H₂-3)以及一个甲氧基(δ_C56.1q；δ_H3.80s)。此外，化合物中存在3-羟基丙酮基可通过H₂-11'和C-10'/C-9'，H₂-10和C-11'/C-9'的HMBC相关得到确认。存在6-(氨基甲基)-5-甲基吡啶-2-(1H)-酮结构片段可通过NH-1'和C-2'/C-3'/C-5'/C-6'/C-7'、H-3'和C-2'/C-4'/C-5'、H-4'和C-2'/C-6'、H₂-7'和C-5'/C-6'、H₂-8'和C-4'/C-5'/C-6'的HMBC相关得到确认。

除去苯环、6-(氨基甲基)-5-甲基吡啶-2-(1H)-酮和两个羰基的不饱和度10，为了满足化合物的11个不饱和度，化合物中还应该有1个环。结合文献报道：可推测苯环、羰基(C-1)、亚甲基(C-3)和氮原子应该形成一个异吲哚环，该推测可通过H₂-3和C-1/C-4/C-3a/C-7a，H-4和C-3/C-3a/C-7a、H-7和C-1/C-3a、C-7a的HMBC相关得到确认。因此本发明化合物为异吲哚生物碱类骨架类型。

化合物的母体骨架确定后，剩余的取代基位置可进一步通过分析其HMBC相关确定。6-(氨基甲基)-5-甲基吡啶-2-(1H)-酮结构片段连接在N-2位可由H₂-7'和C-1/C-3、H₂-3和C-7'的HMBC相关确认；化合物中存在H-10'和C-5、H-4和C-9'的HMBC相关，可证实3-羟基丙酮基取代在C-5位。此外，甲氧基取代在C-6为可通过甲氧基氢(δ_H3.80s)和C-6的HMBC相关确认。至此，本发明化合物的结构得到确认，命名为烟草吲哚-D，英文名为：Nicindole-D。

表1化合物的¹HNMR和¹³CNMR数据(CDCl₃)

化合物紫外、红外光谱和质谱数据：C₁₉H₂₀N₂O₅为黄色胶状物，紫外光谱(甲醇介质)λ_maxnm(logε)210(4.11)、286(3.52)、322(3.28)；红外光谱(KBr压片)ν_max3405、3316、2969、1715、1682、1655、1618、1567、1453、1362、1162、1070、892、835cm^-1；正离子模式ESIMSm/z379[M+Na]⁺，正离子模式HRESIMS m/z 379.1267[M+Na]⁺(计算值C₁₉H₂₀N₂NaO₅,379.1270)。

本发明的有益效果如下：

1、本发明首次从烟草中首次分离出一种新的化合物，通过核磁共振和质谱测定方法确定了为吲哚生物碱类化合物，并表征了其具体结构，该化合物为首次发现的在N-2位连接了6-(氨基甲基)-5-甲基吡啶-2-(1H)-酮结构片段的新骨架化合物。该吲哚生物碱类化合物具有很好的抗烟草花叶病毒活性，经对抗烟草花叶病毒的实验，发现该吲哚生物碱类化合物的相对抑制率达到71.5％，其活性高于对照品宁南霉素的相对抑制率(33.2％)。以上结果揭示了本发明的化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中有良好的应用前景。本发明化合物结构简单活性好，可作为抗烟草花叶病毒药物的先导性化合物。

2、由于本发明的化合物原料易得；化合物的提取方法简单，容易分离得到，产业化制备容易实现。

3、本发明化合物容易实现人工合成，后续的产业化也可通过人工合成实现。

4、采用了常规柱层析和高效液相色谱结合的制备方法，化合物制备操作流程简单，所获得的本发明化合物纯度高，后续的工业化生产中化合物的品质、纯度有保障。

5、本发明化合物安全无毒，展现出良好的抗烟草花叶病毒活性，可为烟草花叶病的防治提供理想的新骨架类型药源分子。

附图说明

图1为所述吲哚生物碱类化合物的核磁共振碳谱。

图2为所述吲哚生物碱类化合物的核磁共振氢谱。

图3为所述吲哚生物碱类化合物的主要HMBC相关。

具体实施方式

下面对本发明通过实施例作进一步说明，但不仅限于本实施例。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中所需要的原料均为市售。

本发明所述吲哚生物碱类化合物C₁₉H₂₀N₂O₅的制备方法包括浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤，具体包括：

A、浸膏提取：取烟叶样品用90～99％乙醇超声提取后，提取液加入到乙酸乙酯与3％的酒石酸混合液中，待混合溶液静置分层后，再用Na₂CO₃溶液将水层pH值调节至9.0，并用乙酸乙酯再次萃取，经过滤，减压浓缩成浸膏。

B、硅胶柱层析：浸膏用200～300目硅胶干法装柱，进行硅胶柱层析；以体积配比分别为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，合并相同极性的部分，收集各部分洗脱液并浓缩；其中，所述硅胶与所述浸膏的质量比为2～5。氯仿-甲醇9:1洗脱液浓缩的部分，以体积配比分别为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-丙酮溶液进行洗脱，收集洗脱液的9:1部分浓缩，供高效液相色谱分离纯化。

C、高效液相色谱法分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF色谱柱，流速为12mL/min，流动相为65％的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为322nm，每次进样200μL，收集28.9min的色谱峰，多次累加后蒸干可得化合物粗品。

D、所述C步骤中高效液相色谱法分离纯化后，所得化合物粗品再次用纯甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化，得到所述吲哚生物碱类化合物。

本发明所用原料不受场地、种植条件等影响，下面以来源于云南中烟基因编辑烟草中分离鉴定的新吲哚生物碱对本发明做进一步说明：

实施例1

所用烟草为BBL基因敲除、烟碱含量得到显著降低的品系。烟草样品采用实验室盆栽、种植地点为昆明。取样3.5kg样品用95％的乙醇超声提取3次，每次提取30min，提取液合并，加入到乙酸乙酯与3％的酒石酸混合液(乙酸乙酯：酒石酸＝97:3，质量比)中，待混合溶液静置分层后，再用Na₂CO₃溶液将水层pH值调节至9.0，并用乙酸乙酯再次萃取，经过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏160g。浸膏用EtOAc萃取获得134.5g的浸膏，该浸膏用1.0kg的200目硅胶进行硅胶柱层析，用体积配比为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-甲醇梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到5个部分，其中体积配比为9:1的氯仿-甲醇洗脱部分浓缩，再次以体积配比分别为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-丙酮溶液进行洗脱后，选取体积配比为9:1洗脱的部分，再用安捷仑1100制备高效液相色谱分离，以65％的甲醇为流动相，ZorbaxPrepHTGF柱(21.2×250mm，5μm)制备柱为固定相，流速为12mL/min，紫外检测器检测波长为322nm，每次进样200μL，收集28.9min的色谱峰，多次累加后蒸干可得化合物粗品；所得产物粗品再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用SephadexLH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物纯品。

实施例2

所用烟草样品为BBL基因敲除、烟碱含量得到显著降低的品系。烟草样品采用温室种植、种植地点为昆明。取样3.2kg用95％的乙醇超声提取3次，每次提取30min，提取液合并，加入到乙酸乙酯与3％的酒石酸混合液(乙酸乙酯：酒石酸＝97:3，质量比)中，待混合溶液静置分层后，再用Na₂CO₃溶液将水层pH值调节至9.0，并用乙酸乙酯再次萃取，经过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏128.6g。该浸膏用1.0kg的200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-甲醇梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到5个部分，其中体积配比为9:1的氯仿-甲醇洗脱部分浓缩，再次以体积配比分别为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-丙酮溶液进行洗脱后，选取体积配比为9:1的部分，再用安捷仑1100制备高效液相色谱分离，以65％的甲醇为流动相，Zorbax PrepHT GF柱(21.2×250mm，5μm)制备柱为固定相，流速为12mL/min，紫外检测器检测波长为322nm，每次进样200μL，收集28.9min的色谱峰，多次累加后蒸干可得化合物粗品；所得产物粗品再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物纯品。

实施例3

取实施例1制备的化合物，为黄色胶状物。

测定方法为：用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构。

紫外-可见吸收光谱显示其在286与322nm处有最大吸收，证明该化合物中存在芳香环结构；

红外光谱(溴化钾压片)显示该化合物中有羟基(3405cm^-1)、胺基(3316cm^-1)、羰基(1715、1682和1655cm^-1)、芳香环(1618、1567和1453cm^-1)特征官能团；高分辨质谱(HRESIMS)给出准分子离子峰379.1267[M+Na]⁺，可确定化合物的分子式为C₁₉H₂₀N₂O₅，不饱和度为11。结合¹H和¹³C与HSQC NMR数据，显示该化合物包括一个1,2,4,5-四取代的苯环(C-4～C-7、C-3a、C-7a、H-4和H-7)，一个3-羟基丙酮基(–COCH₂CH₂OH，C-9'～C-11'，H₂-10'和H₂-11')，一个6-(氨基甲基)-5-甲基吡啶-2-(1H)-酮结构片段，一个羰基(C-1)，一个亚甲基(C-3和H₂-3)以及一个甲氧基(δ_C56.1q；δ_H3.80s)。此外，化合物中存在3-羟基丙酮基可通过H₂-11'和C-10'/C-9'，H₂-10和C-11'/C-9'的HMBC相关得到确认。存在6-(氨基甲基)-5-甲基吡啶-2-(1H)-酮结构片段可通过NH-1'和C-2'/C-3'/C-5'/C-6'/C-7'、H-3'和C-2'/C-4'/C-5'、H-4'和C-2'/C-6'、H₂-7'和C-5'/C-6'、H₂-8'和C-4'/C-5'/C-6'的HMBC相关得到确认。

除去苯环、6-(氨基甲基)-5-甲基吡啶-2-(1H)-酮和两个羰基的不饱和度10，为了满足化合物的11个不饱和度，化合物中还应该有1个环。结合文献报道：可推测苯环、羰基(C-1)、亚甲基(C-3)和氮原子应该形成一个异吲哚环，该推测可通过H₂-3和C-1/C-4/C-3a/C-7a，H-4和C-3/C-3a/C-7a、H-7和C-1、C-3a、C-7a的HMBC相关得到确认。因此本发明化合物为异吲哚生物碱类骨架类型。

化合物的母体骨架确定后，剩余的取代基位置可进一步通过分析其HMBC相关确定。6-(氨基甲基)-5-甲基吡啶-2-(1H)-酮结构片段连接在N-2位可由H₂-7'和C-1/C-3、H₂-3和C-7'的HMBC相关确认；化合物中存在H-10'和C-5、H-4和C-9'的HMBC相关，可证实3-羟基丙酮基取代在C-5位。此外，甲氧基取代在C-6为可通过甲氧基氢(δ_H3.80s)和C-6的HMBC相关确认。至此，本发明化合物的结构得到确认，鉴定为烟草吲哚-D，英文名为：Nicindole-D。

实施例4

取实施例2制备的化合物，为黄色胶状物。测定方法与实施例4相同，确认实施例2制备的化合物为所述的吲哚生物碱类化合物——烟草吲哚-D。

实施例5

取实施例1～2制备的任一吲哚生物碱类化合物进行抗烟草花叶病毒活性试验，试验情况如下：

采用半叶法，在药剂的质量浓度均为20μM时对本发明化合物进行抗烟草花叶病毒活性测定。在5～6株烟草植株上，选取适用于测试的叶片(叶形正常，无病无虫)，先将叶片均匀撒上细金刚砂，用毛笔将备用的烟草花叶病毒源(3.0×10^-3)均匀抹在撒有金刚砂的叶片上，待所有选中的叶片接毒结束后，立即放在盛有药液的培养皿中处理20min，取出，擦去叶片上水珠和约液，将两个半叶复原排放在铺有卫生纸保湿的搪瓷衙内加盖玻璃，控温(23±2)℃，放在温室自然光照射，2～3d即可见枯斑.每个处理都设另一半叶为对照，另外设有1组为商品宁南霉素的处理作为对比，按下公式计算相对抑制率。

XI％＝(CK-T)/CK×100％

X：相对抑制率(％)，CK：浸泡于清水中半片接毒叶的枯斑数(个)，T浸泡于药液中半片接毒叶的枯斑数(个)。

结果表明本化合物的相对抑制率为71.5％，高于对照宁南霉素的相对抑制率33.2％，说明化合物有很好的抗烟草花叶病毒活性。

Claims (6)

1.一种吲哚生物碱类化合物，其特征在于，所述化合物分子式为：

C₁₉H₂₀N₂O₅，其具有下述结构：

2.一种权利要求1所述的吲哚生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、浸膏提取：对烟叶样品用90wt％～99wt％乙醇超声提取后，提取液加入到乙酸乙酯与3wt％的酒石酸混合液中，乙酸乙酯与酒石酸的质量比为97:3，待混合溶液静置分层后，再用Na₂CO₃溶液将水层pH值调节至9.0，并用乙酸乙酯再次萃取，经过滤，减压浓缩成浸膏；

B、硅胶柱层析：将步骤A得到的浸膏用200～300目硅胶干法装柱，进行硅胶柱层析；以体积配比分别为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，合并相同极性的部分，收集各部分洗脱液并浓缩；其中，所述硅胶与所述浸膏的质量比为2～5；收集其中用体积比为9:1的氯仿-甲醇溶液洗脱时得到的洗脱液，称为第一洗脱液；将上述洗脱液用硅胶层析柱继续分离，用体积配比依次为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的一系列氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集其中用体积比为9:1的氯仿-丙酮溶液洗脱时得到的洗脱液，称为第二洗脱液；

C、高效液相色谱分离：将B步骤最终得到的第二洗脱液通入高效液相色谱进行分离纯化，所述高效液相色谱法分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF色谱柱，流速为12mL/min，流动相为65wt％的甲醇水溶液，紫外检测器检测波长为322nm，第二洗脱液每次进样200μL，收集每次进样后色谱峰保留时间为28.9min时所对应的洗脱液，称为第三洗脱液，将该第三洗脱液脱除溶剂后即得所述的吲哚生物碱类化合物。

3.根据权利要求2所述的吲哚生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤A中，乙醇的浓度优选为95wt％。

4.根据权利要求2所述的吲哚生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，步骤B中，所述浸膏在经硅胶柱层析粗分前，用甲醇溶解后用重量比1.5～2.5倍的80～120目硅胶拌样。

5.根据权利要求2所述的吲哚生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤C中，高效液相色谱法分离纯化后，所得化合物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化。

6.一种权利要求1所述的吲哚生物碱类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。

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