CN115109759A - 羰基还原酶LsCR突变体、工程菌及在不对称还原羰基化合物制备手性醇中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种羰基还原酶LsCR突变体、工程菌及在不对称还原羰基化合物制备手性醇中的应用，所述羰基还原酶LsCR突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第101、117、147、145位进行单突变或多突变获得的。本发明LsCRM3突变体比活性与野生型LsCR相比提高了4.6倍，底物转化率大于99％，产物e.e.值始终保持在99.5％以上，时空产率达到809g/L/d，S/C为40g/g；突变体LsCRM4比活性与野生型LsCR相比增加了9倍，底物转化率大于99％，产物e.e.值始终保持在99.5％以上，时空产率达到1004g/L/d，S/C为600g/g。稳定性均有提高，具有工业应用的前景。

Description

羰基还原酶LsCR突变体、工程菌及在不对称还原羰基化合物 制备手性醇中的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种源自酸菜促生乳杆菌(Levilactobacillussuantsaii)的羰基还原酶LsCR的突变体、基因、载体、工程菌，及在替格瑞洛中间体(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇和其他芳香族醇手性生物催化合成方面的应用。
(二)背景技术
替格瑞洛是英国阿斯利康公司研发的一种新型选择性小分子抗凝剂，属于环戊基三唑嘧啶类口服抗血小板药物。作为二磷酸腺苷受体拮抗剂，替格瑞洛作用于P2Y12ADP受体以抑制ADP介导的血小板活化和聚集。(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇((S)-CFPL)是合成替格瑞洛的关键药物中间体。其合成通常通过2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮(CFPO)的化学不对称还原来实现。然而化学不对称还原工艺通常反应条件苛刻，后处理工艺复杂，难以满足绿色化学的要求，因此需要进一步改进合成工艺。
羰基还原酶(carbonyl reductase,CRs)属于NAD(P)H依赖性氧化还原酶的超家族，可以不对称地还原醛和酮并生成醇。天然存在的羰基还原酶往往存在活性低、稳定性低等缺点，难以满足工业生产需求。酶活性的改造获得具有工业属性的酶制剂是酶工业化应用的关键。
现有鲁棒性2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮(CFPO)不对称还原酶缺乏、天然LsCR活性不高、稳定性差等问题，本发明通过蛋白质工程改造，成功获得了活性提升的羰基还原酶突变体，同时对于不同种类的芳香族酮的活性也有明显提升。此外，本发明优化了催化合成(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇((S)-CFPL)工艺参数，有效提高了(S)-CFPL的时空产率。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种羰基还原酶LsCR突变体、工程菌及在不对称还原羰基化合物制备手性醇中的应用，通过蛋白质工程改造，成功获得了活性提升的羰基还原酶有益突变体。进一步通过组合突变获得具有高活性、高稳定性、更广的非天然底物的超级突变体。其中突变体LsCR-N101D/A117G/F147L(LsCRM3)及LsCR-N101D/A117G/F147L/E145A(LsCRM4)的活性及稳定性与LsCR相比均有大幅度的提升，同时对于不同种类的芳香族酮的活性也有明显提升。此外，本发明优化反应工艺参数，构建了LsCRM3和LsCRM4催化合成(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇((S)-CFPL)工艺。解决鲁棒性2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮(CFPO)不对称还原酶缺乏、天然LsCR活性不高、稳定性差等问题。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种源自酸菜促生乳杆菌(Levilactobacillus suantsaii)的羰基还原酶LsCR突变体，所述羰基还原酶LsCR突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第101、117、147、145位进行单突变或多突变获得的。
进一步，优选所述羰基还原酶LsCR突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第101位天冬酰胺突变为天冬氨酸(N101D)；(2)117位的丙氨酸突变为甘氨酸(A117G)；(3)147位的苯丙氨酸突变为亮氨酸(F147L)；(4)145位谷氨酸优选突变为丙氨酸(E145A)；(5)第101位天冬酰胺突变为天冬氨酸，117位的丙氨酸突变为甘氨酸，147位的苯丙氨酸突变为亮氨酸(N101D/A117G/F147L，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)；(6)第101位天冬酰胺突变为天冬氨酸，117位的丙氨酸突变为甘氨酸，147位的苯丙氨酸突变为亮氨酸，145位谷氨酸优选突变为丙氨酸(N101D/A117G/F147L/E145A，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)。
本发明还涉及所述羰基还原酶LsCR突变体编码基因，重组载体及重组基因工程菌，其中重组载体以pet28a(+)为基础载体，重组基因工程菌以E.coliBL21(DE3)为宿主菌。
本发明还提供一种所述羰基还原酶LsCR突变体在不对称还原羰基化合物制备手性醇中的应用，具体所述应用的方法为：将含羰基还原酶LsCR突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的纯酶液为催化剂，以羰基化合物为底物，以异丙醇为辅底物，以pH4-9的缓冲液(优选pH6-7、100mM的PBS缓冲液)为反应介质构成反应体系，在20-50℃、400～800rpm(优选30-45℃、800rpm)条件下进行反应，反应结束，反应液使用乙酸乙酯萃取，获得手性醇化合物。
进一步，所述反应体系中，底物终浓度1～600g/L(优选200-400g/L)；异丙醇体积浓度为10-80％(v/v)(优选40％(v/v))；催化剂用量以湿菌体重量计为10-30g/L，以湿菌体干重计为1～30g DCW/L(优选10g DCW/L)；所述催化剂为纯酶液时，用以蛋白含量计为10-100mg/L(优选60-80mg/L)。
进一步，羰基化合物为下列之一：对溴苯乙酮、对氯苯乙酮、对氟苯乙酮、邻氯苯乙酮、邻溴苯乙酮、邻氟苯乙酮、邻三氟甲基苯乙酮、2,6-二氯苯乙酮、2,3',4'-三氯苯乙酮、2-氯苯乙酮、2-羟基苯乙酮、苯乙酮、2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮。
当羰基化合物为2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮时，所述羰基还原酶LsCR突变体不对称还原2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮制备(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的条件优选为：以突变体LsCRM3为催化剂时，温度为30℃，pH为7；以突变体LsCRM4为催化剂时，温度为45℃，pH为6。
进一步，所述湿菌体按如下方法制备：将含羰基还原酶LsCR突变体基因的工程菌接种到含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h，获得种子液；将种子液以体积浓度1％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养2h，再向培养液中加入终浓度为0.15mM异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG)，28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得湿菌体。
本发明所述纯酶液按如下方法制备：(1)粗酶液：将湿菌体按50g湿菌体/L缓冲液重悬于pH 7.0、100mM PBS缓冲液中，菌悬液在冰水混合物上超声破碎15min，超声破碎条件：功率250W，破碎1s，暂停1s，取破碎混合液，获得粗酶液；(2)粗酶液在8000rpm、4℃下离心10min，弃沉淀，收集上清液。上清液经微滤(滤膜：0.22μm)后使用离子交换层析法进行蛋白纯化，具体方法为：将DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(1.6×20cm)安装于蛋白纯化仪上，使用缓冲液A(pH 7.5、20mM Tris-HCl缓冲液)平衡层析柱，待基线平稳后，上样，使用缓冲液A淋洗直至基线平衡，去除未结合蛋白；依次使用缓冲液A(pH 7.5、20mM Tris-HCl缓冲液)、缓冲液B(含有1M氯化钠的pH 7.5、20mM Tris-HCl缓冲液)进行线性梯度洗脱3-5个柱体积，洗脱速度为1mL/min，线升高时开始收集至降低至基线时停止，收集具有活性的目标洗脱峰的流出液，用pH 7.0、20mM磷酸钾缓冲液透析16-20h，收集截留液即为纯酶液。
本发明羰基还原酶LsCR及羰基还原酶LsCR突变体碱基序列全长均为759bp，从第一个碱基起至第759个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。
本发明所述羰基还原酶LsCR突变体的获取是采用蛋白质工程改造获得，最终获得了3个有益突变体N101D、A117G、F147L。通过进一步的迭代组合突变，我们获得了LsCRM3突变体，通过在底物
Figure BDA0003712987640000031
范围内的点进行丙氨酸扫描筛选获得了突变体LsCRM4，将获得的突变体质粒以热击的方式转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，对获得菌株进行接种、转接、诱导培养、菌体回收，利用重悬菌液催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原，并制备(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇。
本发明羰基还原酶突变体的接种、转接、诱导培养、菌体回收，培养基可为本领域任何可使菌体生长并产生本发明的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，水溶解，调节pH值至7.0。培养方法和培养条件没有特殊限制，培养方法和条件可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同，按本领域普通知识进行适当的选择。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供一种新的羰基还原酶LsCR突变体，底物转化率、稳定性均有明显提高。
1.对照组野生型LsCR催化300g/L2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮最高只能产生97g/L产物(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇，底物转化率较低，本发明所获得的LsCRM3突变体比活性与野生型LsCR相比提高了4.6倍，其中突变体LsCRM3的最大投料量可达到400g/L2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮，产物浓度随时间的推移而逐渐升高，11h内可反应完成，底物转化率大于99％，产物e.e.值始终保持在99.5％以上，时空产率达到809g/L/d，S/C为40g/g；突变体LsCRM4比活性与野生型LsCR相比增加了9倍，1g干菌体(DCW)/L的LsCRM4的最大底物投料量可达到600g/L，13h内可完成反应，底物转化率大于99％，产物e.e.值始终保持在99.5％以上，时空产率达到1004g/L/d，S/C为600g/g。
2.与野生型LsCR相比，本发明开发的新突变体稳定性均有提高，其中LsCRM4在40℃半衰期为117h，相比于母本野生型羰基还原酶LsCR提升了64倍。因此，突变体LsCRM4更具有工业应用的前景。
(四)附图说明
图1是以异丙醇为辅底物，羰基还原酶LsCR及其突变体催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮不对称还原制备(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的反应示意图。
图2为LsCR不对称还原2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮合成(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的产物检测气相色谱图。
图3为(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇气相色谱检测标准曲线。
图4为LsCR及其突变体的蛋白纯化胶图；M:蛋白Mark a:泳道1为LsCR纯蛋白，泳道2为LsCRM3纯蛋白。b:泳道1为空白质粒Pet28a，泳道2为LsCRM3粗酶液，泳道3为LsCR粗酶液。c:泳道1为LsCRM4粗酶液，泳道2为LsCRM4纯蛋白
图5是突变体LsCRM3以异丙醇为辅底物不对称还原2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮合成(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的反应时间进程曲线。
图6是突变体LsCRM4以异丙醇为辅底物不对称还原2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮合成(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的反应时间进程曲线。
图7是突变体LsCRM3最适反应温度优化。
图8是突变体LsCRM3最适反应pH优化。
图9是突变体LsCRM3最适异丙醇浓度优化。
图10是突变体LsCRM4最适反应温度优化。
图11是突变体LsCRM4最适反应pH优化。
图12是突变体LsCRM4最适异丙醇浓度优化。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所用LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，水溶解，调节pH值至7.0。
实施例1：LsCR纯酶的制备及酶活测定
1、野生型羰基还原酶基因工程菌：
根据GenBank，将来自酸菜促生乳杆菌(Levilactobacillussuantsaii)羰基还原酶基因(GenBank NO.NZ_CP059603.1)人工合成羰基还原酶LsCR基因(核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，插入到载体pet28a(+)的NcoⅠ和Xco酶切位点之间，构建重组表达载体，并将此重组表达载体转入宿主菌E.coliBL21(DE3)，获得野生型羰基还原酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)/Pet28a(+)-lscr。
SEQ ID NO.1
1 atgagccatcgcctggatggtaaagttgccattgttacgggtggtaccctgggtattggt
61 ctggccattgcagataaatttgtggcagaaggtgccaaagtgatgattaccggtcgccat
121 gcagatgttggtgaaaaagcagcaaaaagcattggtggtccggatgttattcagtttttt
181 catcatgatgcaacagatgaacagggttgggttgatctgtttgatgcaacagaaaaagca
241 tttggtccggttacaaccgttgtgaataatgcaggtatggcagttaacaaaagcgtcgaa
301 aatacaaccaccgaagaatggcatcgtcagctggcagtgaatctggatgcagtgtttttt
361 ggtacacgtctgggcattcagcgtatgaaaaataaaaacctgggcgcaagcattattaat
421 atgagcagcattgaaggttttgttggtgatccgaatctgggtgcatataatgccactaaa
481 ggcgcagttcgtattatgtcaaaaagcgcagcactggattgtgcactgaaagattatgat
541 gttcgcgtgaatacagttcatccgggttatattaaaacacctctggttgatgatctgccg
601 ggtgcggaagaagccatgagccagcgtaccaaaaccccgatgggtcatattggtgaaccg
661 aatgatatcgcatatatttgtgtttatctggcaagcaatgaaagtaaatttgcaaccggt
721 agtgaatttgtagttgatggtggttataccgcacagtaa.
SEQ ID NO.2
M S H R L D G K V A I V T G G T L G I G L A I A D K F V A E G A K V MI T G R H A D V G E K A A K S I G G P D V I Q F F H H D A T D E Q G W V D L FD A T E K AF G P V TT V V N N A G M A V N K S V E N TTT E E W H R Q L A V N LD A V F F G T R L G I Q R M K N K N L G A S I IN M SS I E G F V G D P N L G AY N A T K G A V R I M S K S A A L D C A L K D Y D V R V N T V H P G Y I K T PL V D D L P G A E E A M S Q R T K T P M G H I G E P N D I A Y I C V Y L A S NE S K F A T G S E F V V D G G Y T A Q*
2、湿菌体
将步骤1构建的野生型羰基还原酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)/Pet28a(+)-lscr接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h，获得种子液；将种子液以体积浓度1.5％(v/v)的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养2h，再向培养液中加入终浓度为0.15mM IPTG，28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得湿菌体细胞。
3、纯酶液
将步骤2的湿菌体细胞按照50g湿菌体/L缓冲液的用量加入pH 7.0、100mM PBS缓冲液进行重悬，在冰水混合物上超声破碎15min，超声破碎条件：功率为250W，破碎1s、暂停1s，超声破碎混合液即为粗酶液。蛋白琼脂糖凝胶电泳检测见图4中b的泳道3。
粗酶液在8000rpm、4℃下离心10min，弃沉淀，收集上清液。上清液经微滤(滤膜：0.22μm)后使用离子交换层析法进行蛋白纯化，具体方法为：将DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(1.6×20cm)安装于蛋白纯化仪上，使用缓冲液A(pH 7.5、20mM Tris-HCl缓冲液)平衡层析柱，待基线平稳后，上样，使用缓冲液A淋洗直至基线平衡，去除未结合蛋白；依次使用缓冲液A(pH 7.5、20mM Tris-HCl缓冲液)、缓冲液B(含有1M氯化钠的pH 7.5、20mMTris-HCl缓冲液)进行线性梯度洗脱3-5个柱体积，洗脱速度为1mL/min，线升高时开始收集至降低至基线时停止，收集具有活性的目标洗脱峰的流出液，用pH 7.0、20mM磷酸钾缓冲液透析16-20h，收集截留液即为纯化酶液。蛋白琼脂糖凝胶电泳检测见图4中a的泳道1。
4、酶活测定
酶活单位(U)定义为：在最适条件下，每分钟每生成1微摩尔(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇所需的酶量定义为一个酶活单位U。比酶活定义为每毫克酶蛋白所具有的活力单位数，U/mg。
酶活检测标准反应体系：25mM 2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮，5mM NADPH，适量酶液(酶蛋白含量为18.5μg)，以pH 7.0、100mM的PBS缓冲液为反应介质构成500μL反应体系，30℃、800rpm条件下反应3min，反应液使用等体积的乙酸乙酯进行萃取，收集萃取液用0.22μm滤膜进行微滤，滤液采用气相检测(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的峰面积(图2)，根据(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇标准曲线，获得滤液中(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇含量，计算酶活。(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇标准曲线是以(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇峰面积为纵坐标，以(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇浓度为横坐标绘制，见图3所示。
气相检测条件为：使用安捷伦(7890A)气相色谱仪进行检测，GC(BGB-174，30m×0.25mm，0.25μm)。进样器和检测器分别设置在250℃和250℃，将柱温箱温度设定在160℃并保持15min，分流比为30:1，进样量为2μl，其他条件为默认检测条件。
实施例2：LsCR位点101突变体的构建
1、突变体的构建
通过设计NDT密码子，对LsCR位点101进行饱和突变：提取实施例1野生型羰基还原酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)/Pet28a(+)-lscr的质粒Pet28a(+)-lscr，利用表1中的引物进行PCR扩增，将PCR产物酶消去除原模版及Clean up后，转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，将克隆子在37℃培养12h。然后挑出克隆并转接到10mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃，180rpm培养10h，培养液在8000rpm下离心10min，沉淀用0.9％(w/v)生理盐水洗涤两次，收集湿菌体。
表1、羰基还原酶定点饱和突变引物设计
Figure BDA0003712987640000061
注：表1中NDT代表简并密码子，AHN代表与NDT配对的简并密码子。
PCR反应体系(50μL)：1μL正向引物(100μM)，1μL反向引物(100μM)，25μL 2×Phanta缓冲液，1μL dNTP混合物(各10mM)，1μL质粒模板，1μL DNA聚合酶和20μL超纯水。
根据Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶手册设置的PCR程序如下：95℃预变性5min，然后30个循环(95℃变性15s，50-60℃退火15s，72℃延伸10s)，72℃终延伸10min，16℃保温。
2、突变体的筛选
突变体筛选反应体系：20g/L步骤1制备的各个湿菌体，20g/L 2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮，40％(v/v)异丙醇，反应介质为pH 7.0、100mM的PBS缓冲液构成10mL反应体系，在30℃、600rpm条件下反应5min后，取1mL反应液并加入1mL乙酸乙酯进行萃取，取萃取液采用实施例1气相色谱检测酶活，结果见表2所示。通过对12种突变体的活性检测，筛选确定最佳突变体为N101D。将筛选出的优势菌株E.coliBL21(DE3)/Pet28a(+)-lscr-N101D，保存于-80℃冰箱。
表2、突变体酶活
Figure BDA0003712987640000071
实施例3：LsCR位点117突变体的构建
同实施例2方法，通过设计NDT密码子，利用表3引物对LsCR位点117进行饱和突变。通过对12种突变体的活性检测，结果见表4，筛选确定最佳突变体为E.coliBL21(DE3)/Pet28a(+)-lscr-A117G。
表3、羰基还原酶定点饱和突变引物设计
Figure BDA0003712987640000072
注：表3中NDT代表简并密码子，AHN代表与NDT配对的简并密码子。
表4、突变体酶活
Figure BDA0003712987640000073
实施例4：LsCR位点147突变体的构建
同实施例2方法，通过设计NDT密码子，利用表5引物对LsCR位点147进行饱和突变。通过对12种突变体的活性检测，结果见表6，筛选确定最佳突变体为E.coliBL21(DE3)/Pet28a(+)-lscr-F147L。
表5羰基还原酶定点饱和突变引物设计
Figure BDA0003712987640000074
注：表5中NDT代表简并密码子，AHN代表与NDT配对的简并密码子。
表6、突变体酶活
Figure BDA0003712987640000081
实施例5：三突变体LsCRM3(N101D/A117G/F147L)构建
对所获得的3个单点突变体进行两两组合，构建多突变体，具体如下：
突变体LsCRR1：以实施例2构建的突变体LsCR-N101D质粒为模板，利用表7引物对A117G位点进行定点突变，获得突变体LsCR-N101D/F147L，记为突变体LsCRR1，转化E.coliBL21(DE3)，获得E.coli BL21(DE3)/Pet28a(+)-LsCRR1。
突变体LsCRR2：以实施例2构建的突变体LsCR-N101D质粒为模板，利用表7引物对F147L位点进行定点突变，获得突变体LsCR-N101D/A117G，记为突变体LsCRR2，转化E.coliBL21(DE3)，获得E.coli BL21(DE3)/Pet28a(+)-LsCRR2。
突变体LsCRR3：以实施例3构建的LsCR-A117G质粒为模板，利用表7引物对F147L位点进行定点突变，获得突变体LsCR-A117G/F147L，记为突变体LsCRR3，转化E.coliBL21(DE3)，获得E.coliBL21(DE3)/Pet28a(+)-LsCRR3。
突变体LsCRM3：以突变体LsCRR3质粒为模板，利用表7引物对N101D位点进行定点突变，获得三突变体LsCR-N101D/A117G/F147L，记为突变体LsCRM3，转化E.coli BL21(DE3)，获得E.coli BL21(DE3)/Pet28a(+)-LsCRM3。
通过实施例1方法进行活性检测，结果见表8，确定了最佳三突变体LsCRM3。
表7羰基还原酶定点突变引物设计
Figure BDA0003712987640000082
表8、突变体酶活
Figure BDA0003712987640000083
实施例6：四突变体LsCRM4(N101D/A117G/F147L/E145A)的构建
在实施例5中所获得的三突变体LsCRM3的基础上，通过对底物结合口袋附近的氨基酸残基S143、M206、L199、L153、V196、Y190、Y156、L195、E145进行丙氨酸扫描，利用表9引物构建9个突变体。通过对其活力检测，结果见表10所示，发现LsCRM3-E145A活力提升较高。
在此基础上通过对E145位点的饱和突变，活力检测结果见表11所示，进一步确定其最佳突变体为LsCRM3-E145A，获得四突变体LsCR-N101D/A117G/F147L/E145A，记为突变体LsCRM4，转化E.coliBL21(DE3)，获得E.coliBL21(DE3)/Pet28a(+)-LsCRM4。
表9羰基还原酶定点突变引物设计
Figure BDA0003712987640000091
表10、突变体酶活
Figure BDA0003712987640000092
表11、E145位点饱和突变，突变体酶活
Figure BDA0003712987640000093
实施例7：突变体的诱导表达
将实施例5获得的E.coliBL21(DE3)/Pet28a(+)-LsCRM3，实施例6获得的E.coliBL21(DE3)/Pet28a(+)-LsCRM4分别接种到含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h，以体积浓度1.5％(v/v)的接种量接种到新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养2h，再向培养液中加入终浓度为0.15mMIPTG，28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，沉淀用0.9％(w/v)生理盐水洗涤两次，获得LsCRM3湿菌体细胞和LsCRM4湿菌体细胞。以上获得的细胞含有相应的蛋白，可用于蛋白纯酶液的制备，也可用于催化合成(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇。
实施例8：突变体的酶蛋白纯化
将实施例7获得的E.coliBL21(DE3)/Pet28a(+)-LsCRM3和E.coliBL21(DE3)/Pet28a(+)-LsCRM4湿菌体，分别按照50g湿菌体/L缓冲液的用量加入pH 7.0、100mM PBS缓冲液进行重悬，在冰水混合物上超声破碎15min，超声破碎条件：功率为250W，破碎1s、暂停1s，破碎混合液即为粗酶液。粗酶液分别在8000rpm、4℃下离心10min，弃沉淀，收集上清液，上清液同实施例1方法进行蛋白纯化，分别获得突变体LsCRM3纯酶液和突变体LsCRM4纯酶液。蛋白琼脂糖凝胶电泳检测见图4。
实施例9：LsCRM3最适催化温度
在10mL的pH 7.0、100mM PBS缓冲液中，加入20g/L的实施例7方法制备的LsCRM3湿菌体细胞，30g/L的底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮，40％(v/v)的异丙醇，在20-45℃(20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃)、800rpm反应5min，根据实施例1方法检测不同温度下的酶活，优化LsCRM3的催化温度，结果见图7。结果表明，温度优化范围为20-45℃，通过优化确定其最适催化温度为30℃。
实施例10：LsCRM3最适催化pH值
在10mL的不同pH(pH4.0，5.0，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，9.0)、100mM PBS缓冲液中(pH4.0-6.0醋酸盐缓冲液；pH6.0-8.0磷酸盐缓冲液；pH8.0-9.0Tris-HCL缓冲液)，加入20g/L的实施例7方法制备的LsCRM3湿菌体细胞，30g/L的底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮，40％(v/v)的异丙醇，在30℃、800rpm反应5min，根据实施例1方法检测不同pH下的酶活，优化LsCRM3的催化反应pH值，结果见图8。pH优化范围为4.0-9.0，通过优化确定其最适催化pH值为7.0。
实施例11：LsCRM3辅底物异丙醇浓度优化
在10mL的pH 7.0、100mM PBS缓冲液中，加入20g/L的实施例7方法制备的LsCRM3湿菌体细胞，30g/L的底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮，不同体积比(10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％(v/v))的异丙醇，在30℃、800rpm反应5min，根据实施例1方法测定不同异丙醇浓度下的酶活，优化LsCRM3的辅底物异丙醇浓度，结果见图9。辅底物异丙醇的考察浓度范围为10％-70％(v/v)，通过优化确定其最适反应异丙醇浓度为40％(v/v)。
实施例12：LsCRM4最适催化温度
在10mL的pH 7.0、100mM PBS缓冲液中，加入10g/L的实施例7方法制备的LsCRM4湿菌体细胞，30g/L的底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮，40％(v/v)的异丙醇，在20-50℃(20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃)、800rpm反应5min，根据实施例1方法检测不同温度下的酶活，结果见图10，优化LsCRM4的催化温度。温度优化范围为20-50℃，通过优化确定其最适催化温度为45℃。
实施例13：LsCRM4最适催化pH值
在10mL的不同pH(pH 4.0，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，8.0)、100mM PBS缓冲液中(pH4.0-6.0醋酸盐缓冲液；pH6.0-8.0磷酸盐缓冲液；pH8.0-9.0Tris-HCL缓冲液)，加入10g/L的实施例7方法制备的LsCRM4湿菌体细胞，30g/L的底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮，40％(v/v)的异丙醇，在45℃、800rpm条件下反应5min，根据实施例1方法检测不同pH下的酶活，优化LsCRM4的催化反应pH值，结果见图11。pH优化范围为4.0-9.0，通过优化确定其最适催化pH值为6.0。
实施例14：LsCRM4辅底物异丙醇浓度优化
在10mL的pH 6.0、100mM PBS缓冲液中，加入10g/L的实施例7方法制备的LsCRM4湿细胞，30g/L的底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮，不同体积比(20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％)的异丙醇，在45℃，800rpm反应5min，根据实施例1方法检测不同异丙醇浓度下的酶活，优化LsCRM4的辅底物异丙醇浓度，结果见图12。辅底物异丙醇的考察浓度范围为20％-80％(v/v)，通过优化确定其最适反应异丙醇浓度为40％(v/v)。
实施例15：LsCR及其突变体LsCRM3不对称还原2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮合成(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇
先将LsCRM3及LsCR湿菌体分别用pH 7.0、100mM的PBS缓冲液重悬，反应体系中LsCRM3及LsCR的湿菌体添加量以干重计为10gDCW/L，底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮投料量为300g/L，加入40％(v/v)的异丙醇，以pH 7.0、100mM的PBS缓冲液为反应介质构成反应体系30mL，在30℃、pH7.0、800rpm条件下反应8-16h，每隔1h取样，采用实施例1的方法检测(S)-CFPL的浓度，计算时空产率。同样条件下，将底物加入浓度改为400g/L、500g/L，结果见图5所示。
时空产率公式：
Figure BDA0003712987640000111
m为生成的产物质量(g)；t为反应时间(d)；v为反应液体积(L)。
LsCR最高能生成98g/L的(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇，无法进行完全转化。
LsCRM3能催化生成283g/L的产物，底物完全反应，同等条件下，当底物浓度为400g/L时，在11h内能够完全反应，并生成371g/L的产物，时空产率为809g/L/d。
实施例16：突变体LsCRM4不对称还原2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮合成(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇
先将LsCRM4湿菌体用pH 6.0、100mM的PBS缓冲液重悬，反应体系中LsCRM4湿菌体的添加量以干重计为1gDCW/L，底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮投料量分别为300、400、500、600g/L，加入40％(v/v)的异丙醇，以pH 6.0、100mM的PBS缓冲液为反应介质构成30mL反应体系，在45℃、pH 6.0、800rpm条件下反应，13h内完全反应，每隔1h取样，同实施例15方法检测，结果见表12，时空产率高达1004g/L/d，S/C高达600g/g。
表12、不同底物浓度的时空产率
Figure BDA0003712987640000121
实施例17：母本羰基还原酶及突变体催化底物谱
根据实施例1及实施例8所获得的纯酶液进行底物谱酶活检测，酶活定义：在最适条件下，每分钟每消耗1μmol NADPH所需的酶量定义为1个酶活单位。
LsCR/LsCRM3酶活检测：以pH6.5、100mM的PBS缓冲液为反应介质，加入终浓度为1mM的NADPH，终浓度为10mM的表13的底物，加入适量纯酶液(酶量以蛋白含量计)，构成200μL反应体系。在30℃，pH6.5，800rpm的条件下反应，取样在酶标仪中检测340nm处吸光值，根据NADPH浓度与吸光值的标准曲线计算酶活，结果见表13。标准曲线方程为：y＝2.56X-0.072。
LsCRM4酶活检测：以pH6.0、100mM的PBS缓冲液为反应介质，加入终浓度为1mM的NADPH，加入终浓度为10mM的表13的底物，加入适量酶液(LsCRM4，酶量以蛋白含量计)，构成200μL反应体系。在45℃，pH6.0，800rpm的条件下反应，取样在酶标仪中检测340nm处吸光值，根据NADPH浓度与吸光值的标准曲线计算酶活，结果见表13。
表13羰基还原酶LsCR及其突变体催化系列羰基化合物酶活测定
Figure BDA0003712987640000122
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 羰基还原酶LsCR突变体、工程菌及在不对称还原羰基化合物制备手性醇中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 759
<212> DNA
<213> 酸菜促生乳杆菌(Levilactobacillus suantsaii)
<400> 1
atgagccatc gcctggatgg taaagttgcc attgttacgg gtggtaccct gggtattggt 60
ctggccattg cagataaatt tgtggcagaa ggtgccaaag tgatgattac cggtcgccat 120
gcagatgttg gtgaaaaagc agcaaaaagc attggtggtc cggatgttat tcagtttttt 180
catcatgatg caacagatga acagggttgg gttgatctgt ttgatgcaac agaaaaagca 240
tttggtccgg ttacaaccgt tgtgaataat gcaggtatgg cagttaacaa aagcgtcgaa 300
aatacaacca ccgaagaatg gcatcgtcag ctggcagtga atctggatgc agtgtttttt 360
ggtacacgtc tgggcattca gcgtatgaaa aataaaaacc tgggcgcaag cattattaat 420
atgagcagca ttgaaggttt tgttggtgat ccgaatctgg gtgcatataa tgccactaaa 480
ggcgcagttc gtattatgtc aaaaagcgca gcactggatt gtgcactgaa agattatgat 540
gttcgcgtga atacagttca tccgggttat attaaaacac ctctggttga tgatctgccg 600
ggtgcggaag aagccatgag ccagcgtacc aaaaccccga tgggtcatat tggtgaaccg 660
aatgatatcg catatatttg tgtttatctg gcaagcaatg aaagtaaatt tgcaaccggt 720
agtgaatttg tagttgatgg tggttatacc gcacagtaa 759
<210> 2
<211> 252
<212> PRT
<213> 酸菜促生乳杆菌(Levilactobacillus suantsaii)
<400> 2
Met Ser His Arg Leu Asp Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Ala Glu Gly Ala
20 25 30
Lys Val Met Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala
35 40 45
Lys Ser Ile Gly Gly Pro Asp Val Ile Gln Phe Phe His His Asp Ala
50 55 60
Thr Asp Glu Gln Gly Trp Val Asp Leu Phe Asp Ala Thr Glu Lys Ala
65 70 75 80
Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Met Ala Val Asn
85 90 95
Lys Ser Val Glu Asn Thr Thr Thr Glu Glu Trp His Arg Gln Leu Ala
100 105 110
Val Asn Leu Asp Ala Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg
115 120 125
Met Lys Asn Lys Asn Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile
130 135 140
Glu Gly Phe Val Gly Asp Pro Asn Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Thr Lys
145 150 155 160
Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu
165 170 175
Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys
180 185 190
Thr Pro Leu Val Asp Asp Leu Pro Gly Ala Glu Glu Ala Met Ser Gln
195 200 205
Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala
210 215 220
Tyr Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asn Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly
225 230 235 240
Ser Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250
<210> 3
<211> 759
<212> DNA
<213> 酸菜促生乳杆菌(Levilactobacillus suantsaii)
<400> 3
atgagccatc gcctggatgg taaagttgcc attgttacgg gtggtaccct gggtattggt 60
ctggccattg cagataaatt tgtggcagaa ggtgccaaag tgatgattac cggtcgccat 120
gcagatgttg gtgaaaaagc agcaaaaagc attggtggtc cggatgttat tcagtttttt 180
catcatgatg caacagatga acagggttgg gttgatctgt ttgatgcaac agaaaaagca 240
tttggtccgg ttacaaccgt tgtgaataat gcaggtatgg cagttaacaa aagcgtcgaa 300
gatacaacca ccgaagaatg gcatcgtcag ctggcagtga atctggatgg cgtgtttttt 360
ggtacacgtc tgggcattca gcgtatgaaa aataaaaacc tgggcgcaag cattattaat 420
atgagcagca ttgaaggtct ggttggtgat ccgaatctgg gtgcatataa tgccactaaa 480
ggcgcagttc gtattatgtc aaaaagcgca gcactggatt gtgcactgaa agattatgat 540
gttcgcgtga atacagttca tccgggttat attaaaacac ctctggttga tgatctgccg 600
ggtgcggaag aagccatgag ccagcgtacc aaaaccccga tgggtcatat tggtgaaccg 660
aatgatatcg catatatttg tgtttatctg gcaagcaatg aaagtaaatt tgcaaccggt 720
agtgaatttg tagttgatgg tggttatacc gcacagtaa 759
<210> 4
<211> 252
<212> PRT
<213> 酸菜促生乳杆菌(Levilactobacillus suantsaii)
<400> 4
Met Ser His Arg Leu Asp Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Ala Glu Gly Ala
20 25 30
Lys Val Met Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala
35 40 45
Lys Ser Ile Gly Gly Pro Asp Val Ile Gln Phe Phe His His Asp Ala
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Lys Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp His Arg Gln Leu Ala
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Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg
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Met Lys Asn Lys Asn Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile
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145 150 155 160
Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu
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Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys
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<210> 5
<211> 759
<212> DNA
<213> 酸菜促生乳杆菌(Levilactobacillus suantsaii)
<400> 5
atgagccatc gcctggatgg taaagttgcc attgttacgg gtggtaccct gggtattggt 60
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gttcgcgtga atacagttca tccgggttat attaaaacac ctctggttga tgatctgccg 600
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aatgatatcg catatatttg tgtttatctg gcaagcaatg aaagtaaatt tgcaaccggt 720
agtgaatttg tagttgatgg tggttatacc gcacagtaa 759
<210> 6
<211> 252
<212> PRT
<213> 酸菜促生乳杆菌(Levilactobacillus suantsaii)
<400> 6
Met Ser His Arg Leu Asp Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Ala Glu Gly Ala
20 25 30
Lys Val Met Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala
35 40 45
Lys Ser Ile Gly Gly Pro Asp Val Ile Gln Phe Phe His His Asp Ala
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg
115 120 125
Met Lys Asn Lys Asn Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile
130 135 140
Ala Gly Leu Val Gly Asp Pro Asn Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Thr Lys
145 150 155 160
Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu
165 170 175
Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys
180 185 190
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195 200 205
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Tyr Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asn Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly
225 230 235 240
Ser Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250

Claims (10)

1.一种羰基还原酶LsCR突变体，其特征在于，所述羰基还原酶LsCR突变体是将SEQ IDNO.2所示氨基酸序列第101、117、147、145位进行单突变或多突变获得的。
2.如权利要求1所述羰基还原酶LsCR突变体，其特征在于，所述羰基还原酶LsCR突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第101位天冬酰胺突变为天冬氨酸；(2)117位的丙氨酸突变为甘氨酸；(3)147位的苯丙氨酸突变为亮氨酸；(4)145位谷氨酸优选突变为丙氨酸；(5)第101位天冬酰胺突变为天冬氨酸，117位的丙氨酸突变为甘氨酸，147位的苯丙氨酸突变为亮氨酸；(6)第101位天冬酰胺突变为天冬氨酸，117位的丙氨酸突变为甘氨酸，147位的苯丙氨酸突变为亮氨酸，145位谷氨酸优选突变为丙氨酸。
3.一种权利要求1所述羰基还原酶LsCR突变体的编码基因。
4.一种权利要求1所述羰基还原酶LsCR突变体编码基因构建的重组基因工程菌。
5.一种权利要求1所述羰基还原酶LsCR突变体在不对称还原羰基化合物制备手性醇中的应用，其特征在于，所述羰基化合物为下列之一：对溴苯乙酮、对氯苯乙酮、对氟苯乙酮、邻氯苯乙酮、邻溴苯乙酮、邻氟苯乙酮、邻三氟甲基苯乙酮、2,6-二氯苯乙酮、2,3',4'-三氯苯乙酮、2-氯苯乙酮、2-羟基苯乙酮、苯乙酮、2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：将含羰基还原酶LsCR突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的纯酶液为催化剂，以羰基化合物为底物，以异丙醇为辅底物，以pH4-9的缓冲液为反应介质构成反应体系，在20-50℃、400～800rpm条件下进行反应，反应结束，反应液使用乙酸乙酯萃取，获得手性醇化合物。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述反应体系中，底物终浓度1～600g/L，异丙醇体积浓度为10-80％，催化剂用量以湿菌体干重计为1～30g DCW/L。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述底物为2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮时，反应介质为pH6-7、100mM的PBS缓冲液，在30-45℃、800rpm下反应制备产物(1S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述湿菌体按如下方法制备：将含羰基还原酶LsCR突变体基因的工程菌接种到含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h，获得种子液；将种子液以体积浓度1％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养2h，再向培养液中加入终浓度为0.15mM异丙基硫代半乳糖苷，28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得湿菌体。
10.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述纯酶液按如下方法制备：(1)将湿菌体按50g湿菌体/L缓冲液重悬于pH 7.0、100mM PBS缓冲液中，菌悬液在冰水混合物上超声破碎15min，超声破碎条件：功率250W，破碎1s，暂停1s，取破碎混合液，获得粗酶液；(2)粗酶液在8000rpm、4℃下离心10min，弃沉淀，收集上清液；上清液经0.22μm滤膜微滤后，上样经缓冲液A平衡后的DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，使用缓冲液A淋洗直至基线平衡，去除未结合蛋白；依次使用缓冲液A、缓冲液B进行线性梯度洗脱3-5个柱体积，洗脱速度为1mL/min，收集具有活性的目标洗脱峰的流出液，用pH 7.0、20mM磷酸钾缓冲液透析16-20h，收集截留液即为纯酶液；所述缓冲液A为pH 7.5、20mM Tris-HCl缓冲液；所述缓冲液B为含有1M氯化钠的pH 7.5、20mM Tris-HCl缓冲液。
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