CN115109133A - ZmR1-CQ01等位基因及其在提高玉米花青素水平中的应用 - Google Patents
ZmR1-CQ01等位基因及其在提高玉米花青素水平中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体公开了ZmR1‑CQ01等位基因及其在提高玉米花青素水平中的应用。本发明发现过表达来源于玉米CQ01的ZmR1基因可提升整株玉米各部位的花青素含量，进而提出了该基因在提高玉米花青素产生性能和高花青素含量种质资源创制中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地说，涉及ZmR1-CQ01等位基因及其在提高玉米花青素水平中的应用。
背景技术
花青素具有很强的抗氧化活性(是维生素E的50倍)，可有效清除人体内游离活性氧，预防心血管疾病、糖尿病和癌症等，对人体健康具有重要价值，是人体必不可缺的营养成分。植物性食物是人体花青素的主要来源。
玉米是重要的粮食和饲料作物，其总产量位居主要粮食作物之首。绝大部分玉米籽粒为黄色，茎秆和叶片为绿色。紫玉米是秘鲁特有的一个玉米品种，其玉米籽粒为紫色，茎秆和叶片也有花青素积累，是玉米中的珍品。紫玉米中的花青素已被用作食品着色剂和营养补充剂(Aoki等，2002，Foods&Food Ingredients，Journal of Japan199:41-45)。紫玉米中的花青素可抑制大鼠结直肠癌的发生、降低大鼠血压(Shindo等，2007，Journal ofNutritional Science&Vitaminology 53:90-93)；并通过提高SOD活性来缓解氧化应激反应从而增加奶牛产奶量(Hosoda等，2012，Animal Science Journal83:453-459；Yonemaru等，2018，Breeding Science 68:582-586)。
高花青素玉米品种可通过传统育种和转基因育种获得，而转基因育种具有快速、高效改良目标性状的显著优点。1989年Ludwig等人分离出玉米花青素调控关键基因ZmLc的cDNA序列后，其过表达被广泛用于增加植物花青素含量(Ludwig等，1989，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 86:7092-7096)。苹果中，由35S启动子驱动的ZmLc过表达增加了叶片和茎杆中的花青素含量(Flachowsky等，2010，Planta 231:623-635；Li等，2007，Planta226:1243-1254)；水稻中，由胚乳特异性启动子驱动ZmLc、ZmPl和六个的花青素合成结构基因的过表达创制了紫色胚乳水稻(Zhu等，2017，Molecular Plant10:918-929)；小麦中，在泛素启动子的驱动下，ZmLc过表达导致生殖组织(如小穗和种子)中花青素的积累量增加，ZmC1和ZmLc同时过表达导致所有组织中花青素沉积(Riaz等，2019，International Journal of Molecular Sciences 20:5806)。因此，克隆优良的玉米花青素调控基因并通过转基因技术来提高玉米整株花青素积累量对高花青素玉米新品种创制具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高整株玉米(玉米植株和籽粒)花青素含量的新方法。
具体地，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种ZmR1-CQ01等位基因(ZmR1CQ01)，其具有如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。
本发明提供了一种可显著增加玉米自交系和杂交种整株花青素积累量的技术方法。
本发明具体以优良骨干鲜食紫糯玉米自交系CQ01(紫色叶中脉)与普通玉米自交系B73(绿色叶中脉)为亲本构建F2分离群体，在285个F2单株中，绿色叶中脉单株和紫色叶中脉单株数量分别为75和210，符合1:3分离比(X2 1:3＝0.3，P＝0.58)，表明鲜食紫糯玉米自交系CQ01的紫色叶中脉由一个显性基因控制。从B73×CQ01的F2单株中分别取30个紫色叶中脉植株和绿色叶中脉植株的叶中脉，构建紫色叶中脉和绿色叶中脉池，并对两个混合池进行BSR-seq分析，结合滑动窗口法将紫色叶中脉控制基因定位在10号染色体132Mb-140 Mb区间(B73RefGen_v3)。以紫糯玉米自交系CQ01(紫色叶中脉)和糯玉米自交系ZN3(绿色叶中脉)为亲本构建F2分离群体，用BSR-seq定位区间内所开发13个KASP分子标记对465个绿色叶中脉的ZN3×CQ01 F2单株进行分析,将叶中脉花青素调控基因锁定在10号染色体404kb(138217924-138622195bp)区间。搜索玉米参考基因组数据库(B73RefGen_v3)发现该区间内有11个基因，最终发现CQ01遗传背景中的ZmR1基因(命名为ZmR1CQ01)具有提升玉米花青素积累的作用。实验验证表明将ZmR1CQ01的编码序列转化进优良骨干普通玉米自交系京724中进行超表达，可将京724整个植株从绿色变成深紫色：大部分组织(胚芽鞘、叶鞘(近地面处叶鞘除外)、茎秆、叶片、叶中脉、苞叶、籽粒种皮和花丝由绿色或无色变成深紫色，部分组织(近地面处叶鞘、颖壳和花药)由淡紫色变成深紫色。用超表达ZmR1CQ01的京724作为母本与京92杂交，能够获得紫色京科968，其整个植株(玉米植株及籽粒)的花青素含量显著增加。
第二方面，本发明提供ZmR1-CQ01蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高玉米整株花青素水平中的应用；所述ZmR1-CQ01蛋白的编码基因具有如SEQ IDNo：1所示的核苷酸序列。
以及，ZmR1-CQ01蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高玉米花青素含量的种质资源改良中的应用；所述ZmR1-CQ01蛋白的编码基因具有如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。
本发明中，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
第三方面，本发明提供一种改变玉米花青素含量的方法，其通过转基因、基因敲除、RNA干扰、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，控制玉米对ZmR1-CQ01等位基因的表达；所述ZmR1-CQ01等位基因具有如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。
所述转基因包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导或农杆菌介导的方法将包含所述ZmR1-CQ01等位基因的重组表达载体导入玉米，获得转基因植物株系。
所述基因敲除包括利用DNA同源重组技术、Cre/LoxP技术或CRISPR/Cas9技术将所述ZmR1-CQ01等位基因敲除，获得转基因植物株系。
第四方面，本发明还提供上述方法在提高玉米花青素含量或创制花青素含量提升的玉米种质资源中的应用。
本发明的有益效果至少在于：
本发明提供了一种新的基因和方法，其能够显著提高玉米自交系、杂交种整株(胚芽鞘、叶鞘、茎秆、叶片、叶中脉、苞叶、花丝、种皮、颖壳、花药)的花青素积累水平，属于生物营养强化技术，能够增加玉米的商品附加值。
附图说明
图1为玉米自交系CQ01叶脉表型、花青素含量及花青素调控基因定位结果图。图中，(a)为玉米自交系CQ01和B73的叶中脉颜色图，图中比例尺＝5厘米。(b)为生长30天的CQ01和B73叶中脉的花青素含量，N.D.表示检测不到。(c)为BSR-seq分析结果。
图2为ZmR1-CQ01过表达载体结构示意图和过表达ZmR1CQ01的京724在不同组织中花青素积累表型。图中，(a)为ZmR1-CQ01过表达载体结构示意图。(b)为野生型京724和五个过表达ZmR1CQ01的京724T0代株系(AJ1、AJ2、AJ3、AJ4、AJ5)的花青素积累表型。(c)-(m)为野生型京724和超表达ZmR1CQ01的京724的不同组织中的花青素积累表型。各图中比例尺＝5厘米。AJ表示ZmR1CQ01超表达的京724。
图3为ZmR1CQ01超表达B104玉米自交系与ZmR1B73超表达B104玉米自交系的叶脉(第一行)和花药(第二行)颜色比较。
图4为超表达ZmR1CQ01的京724与京92杂交获得的玉米杂交种紫色京科968的植株(图中最左侧的两幅照片)及籽粒花青素积累表型(图中最右侧上下排列的两幅照片)。图中，比例尺＝1厘米。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所利用的玉米自交系均来自于北京市农林科学院玉米研究所种质资源库。
实施例1玉米花青素调控基因克隆
鲜食紫糯玉米自交系CQ01是优良的鲜食玉米杂交种京紫糯219的父本。京紫糯219具有口感好、花青素含量高等优点，深受市场欢迎，已大面积种植。其高花青素表型来源于父本玉米自交系CQ01。
CQ01的叶中脉、叶鞘、叶耳、叶舌、茎、苞叶、颖壳和种皮有花青素沉积，叶中脉表型参见图1中的(a)。用Infinity 1290-6430HPLC-MS/MS系统测定花青素含量，发现CQ01叶中脉花青素含量为0.509±0.014mg/g，参见图1中的(b)，成分为矢车菊色素。
普通玉米自交系B73的叶中脉无花青素积累，参见图1中的(a)-(b)。以紫玉米CQ01和普通玉米B73为亲本，构建F2分离群体。在285个F2单株中，绿色叶中脉单株和紫色叶中脉单株数量分别为75和210，符合1:3分离比(X2 1:3＝0.3，P＝0.58)，表明CQ01的紫色中脉由一个显性基因控制。
从B73×CQ01F2单株中分别取30个紫色叶中脉植株和绿色叶中脉植株的叶中脉，构建紫色叶中脉和绿色叶中脉池，并对两个混合池进行BSR-seq分析。BSR-seq根据Data2Bio公司的标准实验步骤进行。将紫色叶中脉控制基因(花青素调控基因)定位到10号染色体，参见图1中的(c)。用滑动窗口法(窗口为20个SNP，步长为5个SNP)将定位区间缩小到10号染色体上的132Mb-140 Mb区间(B73RefGen_v3)。
糯玉米自交系ZN3的叶中脉也为绿色，无花青素积累。以绿叶脉糯玉米ZN3和紫叶脉糯玉米CQ01为亲本构建F2群体。在10号染色体132Mb-140 Mb区间内开发13个具有单个SNP多态性的竞争性等位基因特异性PCR(KASP)分子标记，对465个绿色叶中脉的ZN3×CQ01F2单株进行分析。根据KASP标记的染色体位置及交换单株数量将叶中脉花青素调控基因锁定在10号染色体404kb(138217924-138622195bp，B73 RefGen_v3)区间，即精细定位到KASP-15和KASP-19标记之间的404kb区间。
搜索玉米参考基因组数据库(https://www.maizegdb.org/；B73RefGen_v3)发现该区间有11个基因，最终发现CQ01遗传背景中的ZmR1基因(命名为ZmR1CQ01)具有提升玉米花青素积累的作用，其DNA序列见SEQ ID No：1。
实施例2ZmR1CQ01基因功能验证及高花青素玉米自交系紫色京724创制
玉米自交系京724为优良骨干普通玉米自交系，为京科968的母本，京科968是已大面积推广的大田玉米杂交种。用ClonExpress II One step Cloing kit重组酶试剂盒(南京诺唯赞生物公司)将ZmR1CQ01基因(ZmR1CQ01的DNA序列如SEQ ID No.1所示)的编码序列连接到表达载体pZZ-T(其为记载于Du等，2017，New Phytologist214:721-733中的pCAMBIA3301载体)上，构建pZZ-T-ZmR1CQ01超表达载体。
具体步骤如下：
用TRIZOL法提取玉米自交系CQ01叶片总RNA，用反转录试剂盒(Takara)将RNA反转录成cDNA。用F:CAAACGCACTAGT ATCCCGGGACTCTTCGCAGATAGCAGGC(SEQ ID No.2)和R:CTTATGGCGCGCCTTCCCGGGATGCCCGTCGATGTCCAAAT(SEQID No.3)引物扩增cDNA。
PCR扩增条件为：94℃5min，然后94℃30s,61℃30s,72℃2min进行35个循环，最后72℃延伸10min。pZZ-T载体用SmaI酶切40min，100μl酶切体系包括质粒46μl，10×buffer10μl，SmaI酶10μl，H2O 34μl。用Zymoclean Gel DNA Recovery kit回收试剂盒(ZymoResearch)回收扩增产物和酶切产物。根据ClonExpress II One step Cloing kit重组酶试剂盒(南京诺唯赞生物公司)说明书中步骤将扩增得到的ZmR1-CQ01基因编码序列连接到表达载体pZZ-T上。
该载体携带Bar基因选择标记和泛素基因启动子，其结构示意图参见图2中的(a)。通过根癌农杆菌介导转化法将所构建的pZZ-T-ZmR1CQ01超表达载体插入玉米自交系京724的幼胚中。最终获得10个T0代超表达ZmR1CQ01的京724株系，所有转基因株系的整个植株积累了大量的花青素，示例参见图2中的(b)。野生型京724各组织颜色为：胚芽鞘：绿，无花青素积累，参见图2中的(d)，近地面叶鞘：紫，花青素含量0.503mg/g，参见图2中的(b)，其他位置叶鞘：绿，无花青素积累，参见图2中的(h)，茎秆：绿，无花青素积累，参见图2中的(h)，叶片：绿，无花青素积累，参见图2中的(g)，叶中脉：绿，无花青素积累，参见图2中的(g)，苞叶：绿，无花青素积累，参见图2中的(f)，籽粒种皮：无色，无花青素积累，参见图2中的(c)，花丝：绿，无花青素积累，参见图2中的(f)，颖壳：淡紫，花青素含量0.103mg/g，参见图2中的(i)、花药：紫，花青素含量0.481mg/g，参见图2中的(i)。而超表达ZmR1CQ01的京724中各组织颜色为：胚芽鞘：深紫，花青素含量0.736mg/g，参见图2中的(e)，近地面叶鞘：深紫，花青素含量0.973mg/g，参见图2中的(b)，其他位置叶鞘：深紫，花青素含量0.876mg/g，参见图2中的(l)，茎秆:深紫，花青素含量0.303mg/g，参见图2中的(l)，叶片：深紫，花青素含量0.763mg/g，参见图2中的(k)，叶中脉：深紫，花青素含量0.888mg/g，参见图2中的(k)，苞叶：深紫，花青素含量0.503mg/g，参见图2中的(j)，籽粒种皮：深紫，局部或者完全覆盖，花青素含量0.962mg/g，参见图2中的(c)，花丝：深紫，花青素含量1.203mg/g，参见图2中的(j)，颖壳：深紫，花青素含量0.978mg/g，参见图2中的(m)、花药：深紫,花青素含量1.103mg/g，参见图2中的(m)。该结果表明ZmR1CQ01调控叶中脉花青素的积累，并且其过表达能够将整个玉米植株及籽粒变紫。
实施例3ZmR1CQ01超表达的B104玉米自交系的叶脉和花药花青素积累量多于ZmR1B73超表达的B104玉米自交系
用上述引物及所介绍的方法将B73玉米自交系中ZmR1基因(ZmR1B73的DNA序列如SEQ ID No.4所示)的编码序列连接到pZZ-T载体上，构建pZZ-T-ZmR1B73超表达载体。通过根癌农杆菌介导转化法将所构建的pZZ-T-ZmR1B73和实施例2构建的pZZ-T-ZmR1CQ01超表达载体分别插入到玉米自交系京B104的幼胚中，分别获得超表达ZmR1CQ01和ZmR1B73的B104株系。表型分析发现ZmR1CQ01和ZmR1B73超表达均能够提高B104花青素积累量，可将B104绿色叶脉(无花青素积累)变成紫色(花青素积累)。进一步分析发现，ZmR1CQ01超表达B104株系叶脉(0.702mg/g)和花药(0.612mg/g)花青素积累量多于ZmB73超表达B104玉米株系(叶脉花青素含量为0.223mg/g，花药花青素含量为0.201mg/g)(图3)。
实施例4高花青素玉米杂交种紫色京科968创制
玉米杂交种京科968的母本为京724，父本为京92。用实施例2获得的超表达ZmR1CQ01的京724为母本与京92杂交，最终将绿色京科968变成了紫色京科968，杂交粒所长出的整个植株、果穗及籽粒的花青素含量明显提高，参见图4。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京市农林科学院
<120> ZmR1-CQ01等位基因及其在提高玉米花青素水平中的应用
<130> KHP221116080.1
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7334
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtggcatatc tgtaggcatc taccccgtct tcgtcgtccg ctcctcacta gctaccaaga 60
ggtcgccatt attgccaaca tagagtgtac gtggatgtct atatatatgc ctacttgcac 120
ccatatggca taggcgttcg atccccttag cgcggaggag agctcctccg gttcttctct 180
acccttcgca tggaagttct tgcattgctt cgttgcttct ctagtttctt ccttctacgt 240
ctttccagca tacgcatgcc cctcgtccgc cggttcacga ggcatcgtct gatgatcagt 300
agataataag caatataata ctgatctaga atcgagttgt tgtactcttc gcagataggt 360
tcgttccttc acatagaagc gagtacagac tacagaccac acagtatcag ctggcacgaa 420
acgaaaatgg ttacttgcaa attgcatgca cgagctagaa ttatattctt ctaatcttct 480
tcgttgactt tctggcttca gcaggcgcgt gatggcgctt tcagcttccc gagttcagca 540
ggcggaagaa ctgctgcaac gacctgctga gaggcagctg atgaggagcc agcttgctgc 600
agccgccagg agcatcaact ggagctacgc cctcttctgg tccatttcag acactcaacc 660
agggtaaatt aaagtcttat taattatgta cagttgatat ttggttggca gttttctgta 720
gttttgctga atgatgatca tcgtcgcatc atttgcctga gcttttatag atcccaggct 780
cccagcgcat acatatcaaa taaagagcat ttacttaaac ttttttttgc agaaaaggct 840
tgagcctttt tgtttgcaat gatgtcgcca ggttttatat ccaatttagt taatgatagt 900
actttgctac tgttcaatct cgatttaaga gagtactgga ccgattttca aatcatgcgt 960
cctgtgtggc cgcgtgtgtt ctcttctctc tacggcttgt tcggttattc ccatttcaca 1020
tgaattaaat tatattgaaa aaaaattaag aaaaaaatta atttacttga aatttaaact 1080
catatactct cactaaatcc acatagattg gaagataacc gaataagccc tacgtggtca 1140
attaaactct cctttctttg ccgttgtagt tgtagctata tgcagtgtta ccattaccaa 1200
gcccggaaac tcccattttt tatttttcca cttgtaatac cacagttatg agctgaaact 1260
atgcaagtag actagtagag tgtacttatg agcaaccgca aactaaaccc atttattatt 1320
aggctttgct atgacctatg atactcctag ctaattatag accgtcaatc tagatagaca 1380
tttttttagt ttgataaata gagaaataag caaagtttta ggtaaatgtc taccaattgg 1440
atctaacatg catgcaaccg cacggggcat gcgtctgcat gtctggttcc tttttttaaa 1500
aggtatgtat gcttggttcc taacgtgaca agtggtggtc ttttcattaa ttgttctatg 1560
tgcagctgta atttatgtat ctaaacgtga actgtattgt ttttttacaa atgcgtgaca 1620
aaagtagaag tgtgttttag ttatttattt aaattcgaat gtgaaagtgt tgggtaacga 1680
gaacatcggt acggtctaga tcgtgtttgg tatttaaact attatttgct tgctttcgtg 1740
atcatcccag cgtagtagtt ttgtgactta actaggccct gtttggtccc tttagactaa 1800
agattagttc tatcctattt ggttctagag actaaaacta ttcaaaacac attaaatgaa 1860
tcaataaagg actaaatacc ccttagcatt ctcccgctat tagtgcaact gaaataaatg 1920
agtagcaaaa tgtggaattt atatgattta gtccatttta gtcacccttt gagggaccag 1980
agacaaaaac agtttagtcc caattttagc ctcatcgttt ggcaatttag tgaataaatg 2040
gtactaaaat aggactcaaa ccaaacggga cctcatcagt attttgcaaa tgtatgttca 2100
taagggaatg ctactcagtc aatagctttt gacattgatt tattagattc gtaccaccat 2160
atatgtgttc tcacgagagt aattattaac ttagcaagat ccattgttat tctatctctc 2220
tagaaaattc ttctttcaca ttttgtagca aataacagtg attctgttct tctttgatga 2280
aactaataaa tactcaacaa caacaaaata taaaaggtga ggcccatcca gataacataa 2340
gcttgtgaaa atctagtaca cttagagttt tccaaagtat ttcctgctaa tacttatatt 2400
tcaatattat gctaatatga ataataacga ctcatagaca tgtgttccat aagtagatta 2460
aaataacata gataaagtcc tgttgcaata aagctgacgg atgcacaaca catctagcaa 2520
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ttgttttaaa tatctaggct ggctcgacca aagaacccaa atgggtcttt tatcctaaat 2640
atagagaatc aaatggttct ctacgctctc caacagcgcc ctctaaacga tcctctaaat 2700
ttagagaacg ctgctggatt ctctgtgtat agggtttctc taaacagtcc tctatccatt 2760
tgaatacttt aaataatcgg tctaacaaaa ctaaaatatg tacaatatat ttgagagtgt 2820
gacaaatacg tatatacaaa aaaaataaaa ataaaaataa aaatatctct aatataggta 2880
tttgagtata gaggacgtaa tttagaggat gttgttggag aggaaggaga tatagaggac 2940
agaatctttt agagaagact gtaaagaacg gatatagagg atgtatatag cagtgcgttt 3000
ggatgttgaa atttagactc ggaattcaga attggaattg acaaacccga attctggtgt 3060
ttggatggtc acagtatttg aaattggaaa tccaccaaat tccagccggt attcaactct 3120
acacacgcct ccactctcca attccgaccc tccaccctct gatttgctcg gaattgaact 3180
ggatttggta ttggatccga tttccaaagc caggctgatt tggtattgga tccaattcaa 3240
ttccaccatc tccaattcca acatccaaac ggagcataga ggatattgct ggagacagta 3300
aggctctact cgctccaggt ctaaattata atttgtttag gacgacacgg tctcaaacaa 3360
tttagttttg actatttttc tgctataata taaatgaatt attaatatat ttatattttt 3420
gtaaaaaata tttttaagac aaattggtgc atgtgactac taggtttcaa actaaataac 3480
aaaacagtta tttatttata ctcaatgttt tataagtttg actcaaattt tgtccaaaat 3540
gacttatagt ttagacccga ggggagtagg tgctaataag aaatcatgtt gttggtggaa 3600
aaatctacgc agaggggaaa aactgagaaa ttaagatatg gttttatcat ttcacccacc 3660
ttttaaagtt agacttttaa tctaatggac aaaaggtgat atatttcatt atcataagat 3720
ttcaacgcac acgtgtgtgt atataaaaat ctacacgtca ttatgattaa gatagaatag 3780
ttttatacaa acaacatgtt cctcacgagc ccccctcccc aaaaaaacaa aaaaaaagag 3840
gtctacagtg cccgttgggg ctggaacgtc ctgacacacg ggatttaatt ttgatattac 3900
ataaataatt gacaaccgac gaaccaacct acaaagtaag ggcggatcca ggggatgttt 3960
gtcggggtca gtcaatcccg ataaaattta tatatccttt agaaaaacat cgttaaagtt 4020
caaaaacttt atatcatata gcaaatctga tcttactgac ctgacaatat ttttggctag 4080
attcaccact gctacaaagt gggattgtgt ctgtgaatgt gttgtgagct ccaaattccg 4140
atgtccagaa aaagtggttc caacactcga agcattccac ctagcctcgt agagcttcat 4200
aggctgtgtc cacactacaa cggatagtat gtatatatat atgaccgggt aaaatattat 4260
tttacaggag cggatacagg gttataggtc aagccacctg atccatggac taggacgtga 4320
tcaatatatc tatgtataac ttaattgtat ttagattaaa atacattaca actccagtag 4380
attaaataga tgggtctggg gacgtgacta aatcctggat ccgtcgtgct attttgtact 4440
atctatatta atattttttt atatagtgaa gtttaaaata atagataaga ttggagagca 4500
tctagaacta gcttataggc cttctttttc gtcgcactta gcatagacag accttcacag 4560
acctgtggct agaatccgcc ctatgattag ggcgttacct cgcttgaaag cgggcactcg 4620
aaagaggctc ttggcctcct ctgtagtaac tgaggcctaa tcttccggcc cggttctggc 4680
tgagacggac ggctcctctg cagtaacgtc ggcggctgcc gtgtggagcc agatcatagc 4740
agacgtccat ggctgcatgc cccctccctc tctccgcatt ggggttcacg aaaccagtgt 4800
ccctgaggcc gcgggtcaca aaccacgacg gatgatctca aaaccgtgtt gagggatggg 4860
tgcagtgcag tcgagaagga catcaaataa aatatggtcg ttgcagggtg ctgacgtgga 4920
cggacgggtt ctacaacggc gaggtgaaga cgcggaagat ctccaactcc gtggagctga 4980
catccgacca gctcgtcatg cagaggagcg accagctccg ggagctctac gaggccctcc 5040
tgtcgggcga gggcgaccgc cgcgctgcgc ctgcgcggcc ggccggctct ctgtcgccgg 5100
aggacctcgg cgacaccgag tggtactacg tcgtctccat gacctacgcc ttccggccag 5160
gccaagggta atcgatcgat tcggcgtttt tttttttttg ttcgtgacgt acgcccttta 5220
gtttgttcct ggctgtggcc tttctcctct cggtggctgt cgtcactcgg ttgcattgca 5280
tgcatgcgtc gccacaggtt gcccggcagg agtttcgcga gcgacgagca tgtctggctg 5340
tgcaacgcgc acctcgccgg cagcaaagcc ttcccccgcg cgctcctggc caaggtatgc 5400
acgtttctca cttgttcttt ctggacgtgt actgttgcct tccgtacgtg catggttttc 5460
actagtcggt tgcgatcttt gttgaaatcg tgaactacgt ctacgtgcat gcgtgaacga 5520
ccttgtcgta cctcctggcc tccggtcaag cagagcgcgt ccattcaggt aattaaaaag 5580
cgatttccat gcttcgtctc gtctgaaaca catgtcactt cagagttctg actgggatcg 5640
tgcttgattt ctgcagtcaa tcctctgcat cccggttatg ggcggcgtgc ttgagcttgg 5700
tacaactgac acggtacgtt cagctcgagc ttccgaatta aatggccagc cgagcttcgt 5760
ctcctgacga tcaggtacgt actagtattt aaccaaaact gtaaatgcca ttgccaggtg 5820
ccggaggccc cggacttggt cagccgagca accgcggctt tctgggagcc gcagtgcccg 5880
acgtactcgg aagagccgag ctccagcccg tcaggacgag caaacgagac cggcgaggcc 5940
gcagcagacg acggcacgtt tgcgttcgag gaactcgacc acaataatgg catggacgac 6000
atagaggcga tgaccgccgc cgggggacac gggcaggagg aggagctaag actaagagaa 6060
gccgaggccc tgtcagacga cgcaagcctg gagcacatca ccaaggagat cgaggagttc 6120
tacagcctct gcgacgaaat ggacctgcag gcgctaccac taccgctaga ggacggctgg 6180
accgtggacg cgtccaattt cgaggtcccc tgctcttccc cgcagccagc gccgcctccg 6240
gtggacaggg ctaccgctaa cgtcgccgcc gacgcctcaa gggcacccgt ctacggctct 6300
cgcgcgacga gtttcatggc ttggacgagg tcctcgcagc agtcgtcgtg ctccgacgac 6360
gcggcgcccg cagcagtagt gccggccatc gaggagccgc agagattgct gaagaaagtg 6420
gtggccggcg gcggtgcttg ggagagctgt ggcggcgcga cgggagcagc acaggaaatg 6480
agtggcactg gcaccaagaa gcacgtcatg tcggagcgaa agcgacgaga gaagctcaac 6540
gagatgttcc tcgtcctcaa gtcactgctt ccgtccattc acagggtaat gaacaagata 6600
cgtaccatcg acttttcatt tttttaatcc tttcgtcgtg ttgatttgaa aacttaattg 6660
gagacaattt tttcccccaa tttggcaggt gaacaaagcg tcgatcctcg ccgaaacgat 6720
agcctacctc aaggagcttc agagaagggt gcaagagctg gagtccagta gggaacctgc 6780
gtcgcgccca tccgaaacga cgacaaggct aataacaagg ccctcccgtg gcaataatga 6840
gagtgtgagg aaggaggtct gcgcgggctc caagaggaag agcccagagc tcggcagaga 6900
cgacgtggag cgccccccgg tcctcaccat ggacgccggc accagcaacg tcaccgtcac 6960
cgtctcggac aaggacgtgc tcctggaggt gcagtgccgg tgggaggagc tcctgatgac 7020
gcgagtgttc gacgccatca agagcctcca tttggacgtc ctctcggttc aggcttcagc 7080
gccagatggc ttcatggggc ttaagatacg agctcaggta tatatcacca gcaaactaag 7140
ggacatccat ggcgattgca atactgctct ggttaattag actctttggt tggagagttt 7200
gttttttact gacgcagttg tttaacttat gctcaattcc tatgcagttt gctggctccg 7260
gtgccgtcgt gccctggatg atcagcgagg ctcttcgcaa agctataggg aagcggtgaa 7320
ggggcagctg gaaa 7334
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caaacgcact agtatcccgg gactcttcgc agatagcagg c 41
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cttatggcgc gccttcccgg gatgcccgtc gatgtccaaa t 41
<210> 4
<211> 8914
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtggcatatc tgtaggcatc taccccgtct tcgtcgtccg ctcctcacta gctaccaaga 60
ggtcgccatt attgccaaca tagagtgtac gtggatgtct atatatatgc ctacttgcac 120
ccatatggca taggcgttcg atccccttag cgcggaggag agctcctccg gttcttctct 180
acccttcgca tggaagttct tgcattgctt cgttgcttct ctagtttctt ccttctacgt 240
ctttccagca tacgcatgcc cctcgtccgc cggttcacga ggcatcgtct gatgatcagt 300
agataataag caatataata ctgatctaga atcgagttgt tgtactcttc gcagataggt 360
tcgttccttc acatagaagc gagtacagac tacagaccac acagtatcag ctggcacaaa 420
acgaaaatgg ttacttgcaa attgcatgca cgagctagaa ttatattctt ctaatcttct 480
tcgttgactt tctggcttca gcaggcgcgt gatggcgctt tcagcttccc gagttcagca 540
ggcggaagaa ctgctgcaac gacctgctga gaggcagctg atgaggagcc agcttgctgc 600
agccgccagg agcatcaact ggagctacgc cctcttctgg tccatttcag acactcaacc 660
agggtaaatt aaagtcttat taattatgta cagttgatat ttggttggca gttttctgta 720
gttttgctga atgatgatca tcgtcgcatc atttgcctga gcttttatag atcccaggct 780
cccagcgcat acatatcaaa taaagagcat ttacttaaac ttttttttgc agaaaaggct 840
tgagcctttt tgtttgcaat gatgtcgcca ggttttatat ccaatttagt taatgatagt 900
actttgctac tgttcaatct cgatttaaga gagtactgga ccgattttca aatcatgcgt 960
cctgtgtggc cgcgtgtgtt ctcttctctc tacggcttgt tcggttattc ccatttcaca 1020
tgaattaaat tatattgaaa aaaaattaag aaaaaaatta atttacttga aatttaaact 1080
catatactct cactaaatcc acatagattg gaagataacc gaataagccc tacgtggtca 1140
attaaactct cctttctttg ccgttgtagt tgtagctata tgcagtgtta ccattaccaa 1200
gcccggaaac tcccattttt tatttttcca cttgtaatac cacagttatg agctgaaact 1260
atgcaagtag actagtagag tgtacgtatg agcaaccgga aactaaaccc atttattatt 1320
aggctttgct atgacctatg atactcctag ctaattatag accgtcaatc tagatagaca 1380
tttttttagt ttgataaata gagaaataag caaagtttta ggtaaatgtc taccaattgg 1440
atctaacatg catgcaaccg cacggggcat gcgtctgcat gtctggttcc tttttttaaa 1500
aggtatgtat gcttggttcc taacgtgaca agtggtggtc ttttcattaa ttgttctatg 1560
tgcagctgta atttatgtat ctaaacgtga actgtattgt ttttttacaa atgcgtgaca 1620
aaagtagaag tgtgttttag ttatttattt aaattcgaat gtgaaagtgt tgggtaacga 1680
gaacatcggt acggtctaga tcgtgtttgg tatttaaact attatttgct tgctttcgtg 1740
atcatcccag cgtagtagtt ttgtgactta actaggccct gtttggtccc tttagactaa 1800
agattagttc tatcctattt ggttctagag actaaaacta ttcaaaacac attaaatgaa 1860
tcaataaagg actaaatacc ccttagcatt ctcccgctat tagtgcaact gaaataaatg 1920
agtagcaaaa tgtggaattt atatgattta gtccatttta gtcacccttt gagggaccag 1980
agacaaaaac agtttagtcc caattttagc ctcatcgttt ggcaatttag tgaataaatg 2040
gtactaaaat aggactcaaa ccaaacggga cctcatcagt attttgcaaa tgtatgttca 2100
taagggaatg ctactcagtc aatagctttt gacattgatt tattagattc gtaccaccat 2160
atatgtgttc tcacgagagt aattattaac ttagcaagat ccattgttat tctatctctc 2220
tagaaaattc ttctttcaca ttttgtagca aataacagtg attctgttct tctttgatga 2280
aactaataaa tactcaacaa caacaaaata taaaaggtga ggcccatcca gataacataa 2340
gcttgtgaaa atctagtaca cttagagttt tccaaagtat ttcctgctaa tacttatatt 2400
tcaatattat gctaatatga ataataacga ctcatagaca tgtgttccat aagtagatta 2460
aaataacata gataaagtcc tgttgcaata aagctgacgg atgcacaaca catctagcaa 2520
taaagatcga tgtcgcatgc aataaaaaaa gagcactaat tatctgtcgg catatctatt 2580
ttgttttaaa tatctaggct ggctcgacca aagaacccaa atgggtcttt tatcctaaat 2640
atagagaatc aaatggttct ctacgctctc caacagcgcc ctctaaacga tcctctaaat 2700
ttagagaacg ctgctggatt ctctgtgtat agggtttctc taaacagtcc tctatccatt 2760
tgaatacttt aaataatcgg tctaacaaaa ctaaaatatg tacaatatat ttgagagtgt 2820
gacaaatacg tatatacaaa aaaaataaaa atatctctaa tataggtatt tgagtataga 2880
ggacgtaatt tagaggatgt tgttggagag gaaggagata tagaggacag aatcttttag 2940
agaagactgt aaagaacgga tatagaggat gtatatagca gtgcgtttgg atgttgaaat 3000
ttagactcgg aattcagaat tggaattgac aaacccgaat tctggtgttt ggatggtcac 3060
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actctccaat tccgaccctc caccctctga tttgctcgga attgaactgg atttggtatt 3180
ggatccgatt tccaaagcca ggctgatttg gtattggatc caattcaatt ccaccatctc 3240
caattccaac atccaaacgg agcatagagg atattgctgg agacagtaag gctctactcg 3300
ctccaggtct aaattataat ttgtttagga cgacacggtc tcaaacaatt tagttttgac 3360
tatttttctg ctataatata aatgaattat taatatattt atatttttgt aaaaaatatt 3420
tttaagacaa attggtgcat gtgactacta ggtttcaaac taaataacaa aacagttatt 3480
tatttatact caatgtttta taagtttgac tcaaattttg tccaaaatga cttatagttt 3540
agacccgagg ggagtaggtg ctaataagaa atcatgttgt tggtggaaaa atctacgcag 3600
aggggaaaaa ctgagaaatt aagatatggt tttatcattt cacccacctt ttaaagttag 3660
acttttaatc taatggacaa aaggtgatat atttcattat cataagattt caacgcacac 3720
gtgtgtgtat aaaaatctac acgtcattat cattaagata gaatagtttt atacaaaaca 3780
acatgttcct cacgagcccc cctcccccaa aaaacaaaaa aaaaggtcta cagtgcccgt 3840
tgttggggct ggaacgtcct gacacacggg atttaatttt gatattacat aaataattga 3900
caatggacga accaacctac aaagtagggg cggatctagg ggtgtttgtc ggggtcagct 3960
aatcccgata aaatttatat atcctttaga aaaacatcgt taaagttcaa aaactttata 4020
tcatatagca aatctgatct tactgacccg acaatatttt tagctagatt catcactgct 4080
acaaagtggg attgtgtctg tgatgtgttt gtgaattgtg agctccaatt ccgatgtcca 4140
gaaaaaagtg gttccaacac tcgaagcatt ccacctagcc tcgtagagct tcataggctg 4200
tgtccacact acaacagata gtatatatat atatatatat atatatatat atatatatat 4260
atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatgacc gggtaaaata 4320
ttattttaca ggagcggata cagggttatg ggtcaagcca cctgatccat ggactaggac 4380
gtgatcaata tatctatgta taacttaatt gtatttagat taaaatacat tacaactcca 4440
gtagattaaa tagatgggtc tggggacgtg actaaatcct ggattcgtcg tgctattttg 4500
tactatctat attagtattt tttatatagt aaagtttaaa ataatagata agattggaga 4560
gcatctagaa ctagcttata tgccttcttt ttcgtcgtac ttagcataga cagacctgtg 4620
gctagaatcc gttgtatgat tagggtgtta cctcgcttga aagcgggcac tctagagagg 4680
ctcttggcaa gggtggatcc aggccctttt gtggtgtcct acggcactaa tgaatttagt 4740
aattttcatt agaatgtatg tttggtagca cttaaatgag ttgatgattt tataatttaa 4800
tggagatgac atcaataatt attttgtcta gatacgctta tggctcttgg ctgctaaaag 4860
cttgctccgc agcgggaaaa acattcttta taggatatag caacttagag caactccaac 4920
agactaaaaa tggtgtactc ggtaaaagaa aagaaaataa cgacaaaagc atgttccaac 4980
agactcgcca tcttctttgc ctcttcatct cgctcggcat tagcttcact ccgctcggta 5040
tctttgccga ggttgtggca ctcgccatct ctccactccc gctctccgct accatgcttc 5100
gtgcgcgctc tccgtccccc gctgccacgg tttgctcgtg ctctccggcc atcgagctct 5160
ctcgatctcg acagcatcta cgtgtgcttt ttctcgagca tctcccagta ccggtgcctg 5220
ctctaggcgt tcatggtggt cggcaagttt ttggagcgca tcgtccaaat ggctcgaatg 5280
tcctcaaggt acttgttgaa atgtcaaaaa caagtttatt ttgtctgcta ccttttcctc 5340
cgtacgtgag tacgtgaccc ttccatcaca tccactggtc agctctcgtt gcaactgtgg 5400
cggtggaaga agaggtgagg agcggagatg accagttttc ctacggtttg tttgggcaga 5460
aagacgagtt ggaggaggga agaaaataag atttagagag tctgttggtt tatcttaccg 5520
tttgagaagc tttctatttt ttagagacct cataaaagtc taaatttagc taagattata 5580
cctagacttt tggagttgct cttaggtggc tccagagttg caaatctcgc tcgggaagga 5640
gcgagaaggt ccggtgcgag ataaaaaacc ggccggtcca gttttgtgta tttcggttta 5700
gaatttgaaa aatatagagt caaactttgg tcaacgaaac ggttttctaa aattccaaaa 5760
caaaaatgga atccctgggt ggctcacaaa ttagcgggga ggttggcctt ctgcagcagc 5820
gcttggagaa gaagttgtca aggtggagga gtcattggcc agggatttgg gaatccgttg 5880
tgagctcgtc gaccacactg aagcctagcc tgctgactgg taggtggtag cctcctctgt 5940
agtaaccggg gcctaatctt ccggccgggt tctggctgag acggacggct cctctgtagt 6000
aacgtcggcg gctgccgtgt ggagccagat catagcagac gtccatggct gcaaccgcaa 6060
gccccctccc tctctccgca ctggggttca cgaaaccact caaaccagtg tccctgaggc 6120
cgcgggtcac aaaccacgac ggatgatctc aaaaccgtgt tgagggatgg gtgcagtcga 6180
gaaggtcatc aaataaaaga aaacatatct ggtgcacata gaagatttat gtacatggtg 6240
cacatattaa atcatcaccg ctcattttag atctaacgtc tttagttgtt tggtatattt 6300
tgctaagcac atcctctaat gtggtggtgt gtattggtgg aaggtgctat ttgtaaattg 6360
aatgatcaac aagaaacgtt atatctaaaa tgagtggtga tgatttaata tgtgcatcat 6420
atgcattaat ctttcatgtg catcagatat gtccaccaaa taaaagacag atgtggccta 6480
actcacgacg agagtaaaat atggtcgttg cagggtgctg acgtggacgg acgggttcta 6540
caacggcgag gtgaagacgc ggaagatctc caactccgtg gagctgacat ccgaccacct 6600
cgtcatgcag aggagcgacc agctccggga gctctacgag gccctgctgt cgggcgaggg 6660
cgaccgccgc gctgcgcctg cgcggccggc cggctcgctg tcgccggagg acctcgggga 6720
caccgagtgg tattacgtgg tctccatgac ctacgccttc cggccaggcc aagggtaatc 6780
gatcgattcg tttttttttt cgtgacgccc tttagtttgt tcttgctggc ctttctcctc 6840
tcggtgtctg tcgtcactcg ggtgcattgc atgcatgcgt cgccacaggt tgcccggcag 6900
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cttcccccgc gcgctcctgg ccaaggtatg cacgtttctc acttgttctt tctggacgtg 7020
tactgttgcc ttccgtacgt gcatggtttt cactagtcgg ttgcgatctt tgttgaaatc 7080
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gagctaagac taagagaagc cgaggccctg tcagacgacg caagcctgga gcacatcacc 7680
aaggagatcg aggagttcta cagcctctgc gacgaaatgg acctgcaggc gctaccacta 7740
ccgctagagg acggctggac cgtggacgcg tccaatttcg aggtcccctg ctcttccccg 7800
cagccagcgc cgcctccggt ggacagggct accgctaacg tcgccgccga cgcctcaagg 7860
gcacccgtct acggctctcg cgcgacgagt ttcatggctt ggacgaggtc ctcgcagcag 7920
tcgtcgtgct ccgacgacgc ggcgcccgca gcagtagtgc cggccatcga ggagccgcag 7980
agattgctga agaaagtggt ggccggcggc ggtgcttggg agagctgtgg cggcgcgacg 8040
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agggtaatga acaagatacg taccatcgac ttttcatttt tttaatcctt tcgtcgtgtt 8220
gatttgaaaa cttaattgga gacaattttt tcccccaatt tggcaggtga acaaagcgtc 8280
gatcctcgcc gaaacgatag cctacctcaa ggagcttcag agaagggtgc aagagctgga 8340
gtccagtagg gaacctgcgt cgcgcccatc cgaaacgacg acaaggctaa taacaaggcc 8400
ctcccgtggc aataatgaga gtgtgaggaa ggaggtctgc gcgggctcca agaggaagag 8460
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ggaggagctc ctgatgacgc gagtgttcga cgccatcaag agcctccatt tggacgtcct 8640
ctcggttcag gcttcagcgc cagatggctt catggggctt aagatacgag ctcaggtata 8700
tatcaccagc aaactaagag acatgcatgg cgattgcaat actgctctgg ttaattagac 8760
tctttggttg gagagtttgt tttttactga cgcggttgtt taacttatat gctcaatttc 8820
tatgcagttt gctggctccg gtgccgtcgt gccctggatg atcagcgagg ctcttcgcaa 8880
agctataggg aagcggtgaa ggggcagctg gaaa 8914
Claims (8)
1.一种ZmR1-CQ01等位基因，其特征在于，具有如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。
2.ZmR1-CQ01蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高玉米整株花青素水平中的应用；所述ZmR1-CQ01蛋白的编码基因具有如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。
3.ZmR1-CQ01蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高玉米花青素含量的种质资源改良中的应用；所述ZmR1-CQ01蛋白的编码基因具有如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
5.改变玉米花青素含量的方法，其特征在于，通过转基因、基因敲除、RNA干扰、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，控制玉米对ZmR1-CQ01等位基因的表达；所述ZmR1-CQ01等位基因具有如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转基因包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导或农杆菌介导的方法将包含所述ZmR1-CQ01等位基因的重组表达载体导入玉米，获得转基因植物株系。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基因敲除包括利用DNA同源重组技术、Cre/LoxP技术或CRISPR/Cas9技术将所述ZmR1-CQ01等位基因敲除，获得转基因植物株系。
8.权利要求6所述的方法在提高玉米花青素含量或创制花青素含量提升的玉米种质资源中的应用。
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Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002045486A1 (en) * | 2000-12-08 | 2002-06-13 | The University Of Queensland | Method for modifying a plant phenotype |
| WO2004096994A2 (en) * | 2003-04-25 | 2004-11-11 | Exelixis Plant Sciences, Inc. | Genes upregulated in a tomato plant having an increased anthocyanin content phenotype |
| CN101935663A (zh) * | 2010-04-28 | 2011-01-05 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 调控花青素合成与代谢的小麦新基因TaMYB3 |
| CN103221543A (zh) * | 2010-08-30 | 2013-07-24 | 陶氏益农公司 | 用于玉米的激活标签化平台和所得的带标签的群体和植物 |
| CN103966234A (zh) * | 2014-05-13 | 2014-08-06 | 福建农林大学 | 一种甘蔗花青素调节基因ScRS及其应用 |
| CN107278881A (zh) * | 2017-08-16 | 2017-10-24 | 安徽省农业科学院烟草研究所 | 一种糊粉层花青素合成型鲜食玉米参考系及其选育方法和应用 |
| CN110178721A (zh) * | 2019-06-10 | 2019-08-30 | 中国农业大学 | 形态标记法扩繁植物核雄性不育系 |
| CN110862444A (zh) * | 2019-12-18 | 2020-03-06 | 北京市农林科学院 | 一种玉米bm1基因突变体及该基因的分子标记和应用 |
| CN113317197A (zh) * | 2021-08-03 | 2021-08-31 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种快速显色孤雌生殖诱导系及其在鉴别玉米单倍体中的应用 |
-
2022
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Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002045486A1 (en) * | 2000-12-08 | 2002-06-13 | The University Of Queensland | Method for modifying a plant phenotype |
| WO2004096994A2 (en) * | 2003-04-25 | 2004-11-11 | Exelixis Plant Sciences, Inc. | Genes upregulated in a tomato plant having an increased anthocyanin content phenotype |
| CN101935663A (zh) * | 2010-04-28 | 2011-01-05 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 调控花青素合成与代谢的小麦新基因TaMYB3 |
| CN103221543A (zh) * | 2010-08-30 | 2013-07-24 | 陶氏益农公司 | 用于玉米的激活标签化平台和所得的带标签的群体和植物 |
| CN103966234A (zh) * | 2014-05-13 | 2014-08-06 | 福建农林大学 | 一种甘蔗花青素调节基因ScRS及其应用 |
| CN107278881A (zh) * | 2017-08-16 | 2017-10-24 | 安徽省农业科学院烟草研究所 | 一种糊粉层花青素合成型鲜食玉米参考系及其选育方法和应用 |
| CN110178721A (zh) * | 2019-06-10 | 2019-08-30 | 中国农业大学 | 形态标记法扩繁植物核雄性不育系 |
| CN110862444A (zh) * | 2019-12-18 | 2020-03-06 | 北京市农林科学院 | 一种玉米bm1基因突变体及该基因的分子标记和应用 |
| CN113317197A (zh) * | 2021-08-03 | 2021-08-31 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种快速显色孤雌生殖诱导系及其在鉴别玉米单倍体中的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MEIJIE LUO等: "A newly characterized allele of ZmR1 increases anthocyanin content in whole maize plant and the regulation mechanism of different ZmR1 alleles", THEORETICAL AND APPLIED GENETICS, vol. 135, no. 9, 5 July 2022 (2022-07-05), pages 3039 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| GR01 | Patent grant |