CN115093484A - miPEP156a与噁霉灵偶联体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种miPEP156a与噁霉灵偶联体，包括miPEP156a单体或miPEP156a多重复单元融合蛋白、以及琥珀酰噁霉灵，miPEP156a单体或miPEP156a多重复单元融合蛋白偶联至琥珀酰噁霉灵，琥珀酰噁霉灵通过噁霉灵和琥珀酸酐反应制备而成。还提供了miPEP156a与噁霉灵偶联体的制备方法和相关应用。本发明的miPEP156a与噁霉灵偶联体既能够促进植物的发芽生长，又增强植物的抗病性，且减少miPEP156a和噁霉灵的使用量，从而减少农药对环境的污染，适于大规模推广应用。

Description

miPEP156a与噁霉灵偶联体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及农药生物技术技术领域，更具体地，涉及噁霉灵技术领域，特别是指一种miPEP156a与噁霉灵偶联体及其制备方法和应用。
背景技术
2015年4月4日，著名国际学术期刊Nature在线发表了法国科学家的一项最新研究进展 (Lauressergues D,Couzigou J M,Clemente H S,et al.Primary transcripts ofmicroRNAs encode regulatory peptides[J].Nature,2015,520(7545):90-3.)，他们发现在植物中miRNA 的初级转录本pri-miRNA含有短的开放阅读框序列，能够编码一类多肽miPEP，促进 microRNA(miRNA)的积累，调节基因表达。随后，大量研究表明miPEP能够促进植物生长发育和抗逆性，可能具有重要的农业应用价值，为物种专属活性肽抗性制剂、肥料开发提供了新思路。T.N.Erokhina研究(Erokhina T N,Ryazantsev D Y,Samochvalova LV,et al.Possible functions of the conserved peptide encoded by the RNA-precursor of miR-156a in plants of the family Brassicaceae.2020.)发现，来源于十字花科植物的miRNA 产生的小肽miPEP156a，分子量3.8KD左右，能够有效穿过十字花科某些植物幼苗的根部，然后被运输到各个部位，调控根系的生长，导致侧根减少，并刺激主根生长，从而对植物发育产生正向影响。
噁霉灵(Hymexazol，HML)，商品名为土菌消、绿佳宝等，化学名为3-羟基-5-甲基异恶唑，在酸、碱溶液中均稳定，是一种低毒、无残留的绿色内吸性绿色农用杀菌剂，同时还可作为土壤消毒剂和植物生长调节剂。噁霉灵是广普杀菌剂，对多种病原菌，包括对鞭毛菌、子囊菌、担子菌、腐霉菌、苗腐菌、镰刀菌以及丝核菌等，有较高的防治结果，因而广泛应用对农作物和蔬菜的枯萎病、立枯病、黄萎病、猝倒病、纹枯病、茎枯病、叶枯病以及连作重茬等病虫害防治领域。同时，其具有促进作物根系生长发育、生根壮苗提高成活率的作用。
因此，希望能够充分利用miPEP156a和噁霉灵，既能够促进植物的发芽生长，又增强植物的抗病性，且减少miPEP156a和噁霉灵的使用量，从而减少农药对环境的污染。
发明内容
为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种miPEP156a与噁霉灵偶联体，其既能够促进植物的发芽生长，又增强植物的抗病性，且减少miPEP156a和噁霉灵的使用量，从而减少农药对环境的污染，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种miPEP156a与噁霉灵偶联体的制备方法，其制备简便快捷，可操作性强，制备的miPEP156a与噁霉灵偶联体既能够促进植物的发芽生长，又增强植物的抗病性，且减少miPEP156a和噁霉灵的使用量，从而减少农药对环境的污染，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种miPEP156a与噁霉灵偶联体的应用，其可以应用于促进植物发芽生长和增强植物抗病性，减少miPEP156a和噁霉灵的使用量，从而减少农药对环境的污染，适于大规模推广应用。
为达到以上目的，在本发明的第一方面，提供一种miPEP156a与噁霉灵偶联体，其特点是，包括miPEP156a单体或miPEP156a多重复单元融合蛋白、以及琥珀酰噁霉灵，所述miPEP156a单体或所述miPEP156a多重复单元融合蛋白偶联至所述琥珀酰噁霉灵，所述琥珀酰噁霉灵通过噁霉灵和琥珀酸酐反应制备而成。
较佳地，所述miPEP156a多重复单元融合蛋白为miPEP156a二重复单元融合蛋白。
更佳地，所述miPEP156a二重复单元的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
在本发明的第二方面，提供一种上述的miPEP156a与噁霉灵偶联体的制备方法，其特点是，包括以下步骤：
(1)将所述噁霉灵和所述琥珀酸酐反应制备成所述琥珀酰噁霉灵；
(2)将所述miPEP156a单体或所述miPEP156a多重复单元融合蛋白偶联至所述琥珀酰噁霉灵，获得所述miPEP156a与噁霉灵偶联体。
较佳地，所述步骤(1)具体为：将所述噁霉灵和所述琥珀酸酐溶于第一溶剂中，然后加入催化剂，避光搅拌反应，获得所述琥珀酰噁霉灵。
更佳地，在所述步骤(1)中，所述第一溶剂为无水吡啶，所述琥珀酸酐的摩尔量为所述噁霉灵的摩尔量的1.5倍～4倍，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶，所述避光搅拌反应的温度为40℃～60℃，所述避光搅拌反应的时间为4h～9h。
较佳地，在所述步骤(2)中，所述miPEP156a多重复单元融合蛋白通过将所述miPEP156a多重复单元融合蛋白的核苷酸序列重组于表达载体中获得重组表达载体，然后将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆菌发酵纯化制备而成。
较佳地，所述步骤(2)具体为：
(21)将所述琥珀酰噁霉灵溶于第二溶剂中，然后加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺进行活化，获得活化溶液；
(22)将所述miPEP156a单体或所述miPEP156a多重复单元融合蛋白溶于第三溶剂中，获得含肽溶液；
(23)将所述活化溶液加入到所述含肽溶液中进行偶联反应，获得所述miPEP156a与噁霉灵偶联体。
更佳地，在所述步骤(2)中，所述第二溶剂为二甲基甲酰胺，所述碳二亚胺的摩尔量和所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔量分别为所述琥珀酰噁霉灵的摩尔量的1.5倍～4倍，所述活化的温度为室温，所述活化的时间为4h～6h，所述第三溶剂为碳酸盐缓冲液，所述miPEP156a单体的摩尔量或所述miPEP156a多重复单元融合蛋白的摩尔量为所述的琥珀酰噁霉灵的摩尔量的0.1倍～0.3倍，所述偶联反应采用室温反应过夜。
在本发明的第三方面，提供上述的miPEP156a与噁霉灵偶联体在促进植物发芽生长和增强植物抗病性中的应用。
本发明的有益效果在于：
a.本发明的miPEP156a与噁霉灵偶联体包括miPEP156a单体或miPEP156a多重复单元融合蛋白、以及琥珀酰噁霉灵，miPEP156a单体或miPEP156a多重复单元融合蛋白偶联至琥珀酰噁霉灵，琥珀酰噁霉灵通过噁霉灵和琥珀酸酐反应制备而成，因此，其既能够促进植物的发芽生长，又增强植物的抗病性，且减少miPEP156a和噁霉灵的使用量，从而减少农药对环境的污染，适于大规模推广应用。
b.本发明的miPEP156a与噁霉灵偶联体的制备方法包括：(1)将噁霉灵和琥珀酸酐反应制备成琥珀酰噁霉灵；(2)将miPEP156a单体或miPEP156a多重复单元融合蛋白偶联至琥珀酰噁霉灵，获得miPEP156a与噁霉灵偶联体，因此，其制备简便快捷，可操作性强，制备的miPEP156a与噁霉灵偶联体既能够促进植物的发芽生长，又增强植物的抗病性，且减少miPEP156a和噁霉灵的使用量，从而减少农药对环境的污染，适于大规模推广应用。
c.本发明的miPEP156a与噁霉灵偶联体在促进植物发芽生长和增强植物抗病性中的应用，因此，其可以应用于促进植物发芽生长和增强植物抗性，减少miPEP156a和噁霉灵的使用量，从而减少农药对环境的污染，适于大规模推广应用。
本发明的这些和其它目的、特点和优势，通过下述的详细说明得以充分体现，并可通过说明书中特地指出的方法、手段和它们的组合得以实现。
具体实施方式
为了能够充分利用miPEP156a和噁霉灵，既能够促进植物的发芽生长，又增强植物的抗病性，且减少miPEP156a和噁霉灵的使用量，从而减少农药对环境的污染，本发明人经过大量而广泛的研究，提供一种miPEP156a与噁霉灵偶联体，包括miPEP156a单体(其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)或miPEP156a多重复单元融合蛋白、以及琥珀酰噁霉灵，所述miPEP156a单体或所述miPEP156a多重复单元融合蛋白偶联至所述琥珀酰噁霉灵，所述琥珀酰噁霉灵通过噁霉灵和琥珀酸酐反应制备而成。
所述miPEP156a多重复单元融合蛋白中miPEP156a单重复单元即miPEP156a单体的数目可以根据需要确定，较佳地，所述miPEP156a多重复单元融合蛋白为miPEP156a二重复单元融合蛋白，即含有两个miPEP156a单重复单元。
所述miPEP156a二重复单元融合蛋白中两个miPEP156a单重复单元可以直接连接或者通过刚性连接肽或柔性连接肽连接，更佳地，所述miPEP156a二重复单元融合蛋白通过将两个miPEP156a单重复单元经柔性连接肽连接而成。
所述柔性连接肽可以是任何合适的柔性连接肽，所述柔性连接肽的数目可以根据需要确定，更进一步地，所述柔性连接肽为G4S(GGGGS)，所述柔性连接肽的数目为2 个～4个。优选地，所述柔性连接肽的数目为3个。
所述miPEP156a二重复单元可以具有任何合适的氨基酸序列，更佳地，所述miPEP156a二重复单元的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
编码所述miPEP156a二重复单元的核苷酸序列，可以根据需要确定，更进一步地，所述miPEP156a二重复单元的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明还提供一种上述的miPEP156a与噁霉灵偶联体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将所述噁霉灵和所述琥珀酸酐反应制备成所述琥珀酰噁霉灵；
(2)将所述miPEP156a单体或所述miPEP156a多重复单元融合蛋白偶联至所述琥珀酰噁霉灵，获得所述miPEP156a与噁霉灵偶联体。
所述步骤(1)可以采用任何合适的具体步骤，较佳地，所述步骤(1)具体为：将所述噁霉灵和所述琥珀酸酐溶于第一溶剂中，然后加入催化剂，避光搅拌反应，获得所述琥珀酰噁霉灵。
在所述步骤(1)中，所述第一溶剂可以是任何合适的溶剂，所述琥珀酸酐和所述噁霉灵的摩尔比可以根据需要确定，所述催化剂可以是任何合适的催化剂，所述避光搅拌反应可以采用任何合适的条件，更佳地，在所述步骤(1)中，所述第一溶剂为无水吡啶，所述琥珀酸酐的摩尔量为所述噁霉灵的摩尔量的1.5倍～4倍，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶，所述避光搅拌反应的温度为40℃～60℃，所述避光搅拌反应的时间为4h～9h。
在所述步骤(1)中，所述琥珀酰噁霉灵可以采用下列方法进行纯化：减压旋转蒸发所述第一溶剂，加入适量纯水溶解沉淀物，采用碱例如氢氧化钠溶液(1M)将pH调至10，采用正己烷萃取，收集所有水相，然后采用酸例如稀盐酸(6M)调pH至4，有固体析出，过滤干燥，粗品经硅胶柱层析纯化，选择合适的洗脱液例如三氯甲烷-甲醇 (CHCl3-CH3OH)混合液洗脱，获得带有羧基的琥珀酰噁霉灵。
在所述步骤(2)中，所述miPEP156a多重复单元融合蛋白可以采用任何合适的方法获得，较佳地，在所述步骤(2)中，所述miPEP156a多重复单元融合蛋白通过将所述miPEP156a多重复单元融合蛋白的核苷酸序列重组于表达载体中获得重组表达载体，然后将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆菌发酵纯化制备而成。
所述大肠杆菌感受态细胞可以采用例如大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21；所述表达载体可以是例如pET28a质粒、pET30a质粒或pBV222质粒等，优选地，所述表达载体为含有T7强启动子的pET28a(+)质粒；所述发酵纯化可以采用以下步骤：将所述阳性克隆菌接种至发酵培养基中，37℃培养OD600达到0.6～0.8，添加IPTG低温18℃～22℃诱导表达，离心收获菌体，破碎，取破碎液上清液，经Ni-NTA亲和层析纯化，从而获得所述miPEP156a 多重复单元融合蛋白。
所述步骤(2)可以采用任何合适的具体步骤，较佳地，所述步骤(2)具体为：
(21)将所述琥珀酰噁霉灵溶于第二溶剂中，然后加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺进行活化，获得活化溶液；
(22)将所述miPEP156a单体或所述miPEP156a多重复单元融合蛋白溶于第三溶剂中，获得含肽溶液；
(23)将所述活化溶液加入到所述含肽溶液中进行偶联反应，获得所述miPEP156a与噁霉灵偶联体。
在所述步骤(2)中，所述第二溶剂和所述第三溶剂可以是任何合适的溶剂，所述碳二亚胺和所述N-羟基琥珀酰亚胺分别与所述噁霉灵的摩尔比以及所述miPEP156a单体或所述miPEP156a多重复单元融合蛋白与所述琥珀酰噁霉灵的摩尔比可以根据需要确定，所述活化和所述偶联反应可以采用任何合适的条件，更佳地，在所述步骤(2)中，所述第二溶剂为二甲基甲酰胺，所述碳二亚胺的摩尔量和所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔量分别为所述琥珀酰噁霉灵的摩尔量的1.5倍～4倍，所述活化的温度为室温，所述活化的时间为4h～6h，所述第三溶剂为碳酸盐缓冲液，所述miPEP156a单体的摩尔量或所述miPEP156a 多重复单元融合蛋白的摩尔量为所述的琥珀酰噁霉灵的摩尔量的0.1倍～0.3倍，优选0.2倍，所述偶联反应采用室温反应过夜。
经过所述偶联反应后，可以用磷酸盐缓冲液透析，再获得所述miPEP156a与噁霉灵偶联体。
本发明还提供上述的miPEP156a与噁霉灵偶联体在促进植物发芽生长和增强植物抗病性中的应用。
所述植物可以是任何合适的植物，较佳地，所述植物为白菜、萝卜、黄瓜或樱桃。
所述抗病性可以是任何合适的抗病性，较佳地，所述抗病性是抗枯萎病或抗茎腐病。
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 miRNA前体产生小肽miPEP156a二重复单元(miPEP156a)2与绿色农药噁霉灵偶联体制备
(1)将噁霉灵溶解于无水吡啶溶剂中，加入摩尔量为噁霉灵的摩尔量2倍的琥珀酸酐，同时加入催化剂4-二甲氨基吡啶，40℃反应时间6h。
(2)反应结束后，减压旋干蒸发无水吡啶，加入纯水溶解沉淀物，采用氢氧化钠溶液(1M)将pH调至10，采用正己烷萃取，收集所有水相，然后采用稀盐酸(6M)调pH 至4，有固体析出，过滤干燥，粗品经硅胶柱层析纯化，选择合适的洗脱液三氯甲烷-甲醇混合液洗脱，获得带有羧基的琥珀酰噁霉灵。
(3)将含有miPEP156a二重复单元的核苷酸序列(如SEQ ID NO：3所示)的成功重组菌E.coli BL21/(miPEP156a)2，接种至发酵培养基中，37℃培养至OD600达到0.8，添加 IPTG低温20℃诱导表达，离心收获菌体，破碎，取破碎液上清液，经Ni-NTA亲和层析纯化获得miPEP156a二重复单元(miPEP156a)2。
(4)将琥珀酰噁霉灵溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，加入摩尔量均为琥珀酰噁霉灵的摩尔量的2.5倍的碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下活化6h。同时称取摩尔比为琥珀酰噁霉灵的摩尔量的0.2倍的miPEP156a二重复单元(miPEP156a)2，溶解于碳酸盐缓冲液(CBS)中，将活化好的琥珀酰噁霉灵加入到含有小肽的CBS缓冲液中，室温反应过夜，反应结束后，用0.01M磷酸盐缓冲液透析三次，8小时更换一次，获得miRNA前体产生小肽miPEP156a二重复单元(miPEP156a)2与噁霉灵偶联体 (miPEP156a)2-HML。
本发明采用接种率衡量噁霉灵对miPEP156a二重复单元(miPEP156a)2的偶联程度，具体公式为：接枝率＝噁霉灵质量/(miPEP156a)2质量。
采用高效液相色谱法对未偶联的琥珀酰噁霉灵进行测定，然后计算出噁霉灵对miPEP156a二重复单元(miPEP156a)2的接枝率，结果显示，接枝率为6.48％。
实施例2 miRNA前体产生小肽miPEP156a二重复单元(miPEP156a)2与绿色农药噁霉灵偶联体制备
(1)将噁霉灵溶解于无水吡啶溶剂中，加入摩尔量为噁霉灵的摩尔量1.5倍的琥珀酸酐，同时加入催化剂4-二甲氨基吡啶，50℃反应时间9h。
(2)反应结束后，减压旋干蒸发无水吡啶，加入纯水溶解沉淀物，采用氢氧化钠溶液(1M)将pH调至10，采用正己烷萃取，收集所有水相，然后采用稀盐酸(6M)调pH 至4，有固体析出，过滤干燥，粗品经硅胶柱层析纯化，选择合适的洗脱液三氯甲烷-甲醇混合液洗脱，获得带有羧基的琥珀酰噁霉灵。
(3)将含有miPEP156a二重复单元的核苷酸序列(如SEQ ID NO：3所示)的成功重组菌E.coli BL21/(miPEP156a)2，接种至发酵培养基中，37℃培养至OD600达到0.7，添加 IPTG低温18℃诱导表达，离心收获菌体，破碎，取破碎液上清液，经Ni-NTA亲和层析纯化获得miPEP156a二重复单元(miPEP156a)2。
(4)将琥珀酰噁霉灵溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，加入摩尔量均为琥珀酰噁霉灵的摩尔量的4倍的碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下活化4h。同时称取摩尔比为琥珀酰噁霉灵的摩尔量的0.3倍的miPEP156a二重复单元(miPEP156a)2，溶解于碳酸盐缓冲液(CBS)中，将活化好的琥珀酰噁霉灵加入到含有小肽的CBS缓冲液中，室温反应过夜，反应结束后，用0.01M磷酸盐缓冲液透析三次，8小时更换一次，获得 miRNA前体产生小肽miPEP156a二重复单元(miPEP156a)2与噁霉灵偶联体 (miPEP156a)2-HML。
本发明采用接种率衡量噁霉灵对miPEP156a二重复单元(miPEP156a)2的偶联程度，具体公式为：接枝率＝噁霉灵质量/(miPEP156a)2质量。
采用高效液相色谱法对未偶联的琥珀酰噁霉灵进行测定，然后计算出噁霉灵对miPEP156a二重复单元(miPEP156a)2的接枝率，结果显示，接枝率为4.56％。
实施例3 miRNA前体产生小肽miPEP156a二重复单元(miPEP156a)2与绿色农药噁霉灵偶联体制备
(1)将噁霉灵溶解于无水吡啶溶剂中，加入摩尔量为噁霉灵的摩尔量4倍的琥珀酸酐，同时加入催化剂4-二甲氨基吡啶，60℃反应时间4h。
(2)反应结束后，减压旋干蒸发无水吡啶，加入纯水溶解沉淀物，采用氢氧化钠溶液(1M)将pH调至10，采用正己烷萃取，收集所有水相，然后采用稀盐酸(6M)调pH 至4，有固体析出，过滤干燥，粗品经硅胶柱层析纯化，选择合适的洗脱液三氯甲烷-甲醇混合液洗脱，获得带有羧基的琥珀酰噁霉灵。
(3)将含有miPEP156a二重复单元的核苷酸序列(如SEQ ID NO：3所示)的成功重组菌E.coli BL21/(miPEP156a)2，接种至发酵培养基中，37℃培养至OD600达到0.6，添加 IPTG低温22℃诱导表达，离心收获菌体，破碎，取破碎液上清液，经Ni-NTA亲和层析纯化获得miPEP156a二重复单元(miPEP156a)2。
(4)将琥珀酰噁霉灵溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，加入摩尔量均为琥珀酰噁霉灵的摩尔量的1.5倍的碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下活化5h。同时称取摩尔比为琥珀酰噁霉灵的摩尔量的0.1倍的miPEP156a二重复单元(miPEP156a)2，溶解于碳酸盐缓冲液(CBS)中，将活化好的琥珀酰噁霉灵加入到含有小肽的CBS缓冲液中，室温反应过夜，反应结束后，用0.01M磷酸盐缓冲液透析三次，8小时更换一次，获得miRNA前体产生小肽miPEP156a二重复单元(miPEP156a)2与噁霉灵偶联体 (miPEP156a)2-HML。
本发明采用接种率衡量噁霉灵对miPEP156a二重复单元(miPEP156a)2的偶联程度，具体公式为：接枝率＝噁霉灵质量/(miPEP156a)2质量。
采用高效液相色谱法对未偶联的琥珀酰噁霉灵进行测定，然后计算出噁霉灵对miPEP156a二重复单元(miPEP156a)2的接枝率，结果显示，接枝率为10.32％。
实施例4偶联体(miPEP156a)2-HML对白菜种子的发芽生长试验
将白菜种子置入50％次氯酸钙溶液中消毒，然后加入终浓度0.5％Tween-20搅拌10分钟，再用无菌蒸馏水洗涤3次。种子先被放入摇瓶中，里面含有30g/L蔗糖的MS培养基(Serva，德国)，光照条件80rpm下摇动24个小时促使其发芽。然后将萌发的种子转移到无菌培养皿中，每个培养皿50粒种子，加入无菌MS培养基，然后添加miRNA前体产生小肽miPEP156a即miPEP156a单体(多肽合成，终浓度10mg/L)，或miPEP156a二重复单元(miPEP156a)2(终浓度10mg/L)，或噁霉灵(HML含量与偶联体(miPEP156a)2-HML 中HML组分含量一致)，或(miPEP156a)2与HML混合物((miPEP156a)2终浓度10mg/L， HML含量与偶联体(miPEP156a)2-HML中HML组分含量一致)，或(miPEP156a)2-HML ((miPEP156a)2终浓度为10mg/L)为实验组，不加样品的作为空白对照组。样品处理4天后，检测种子发芽长度。
结果如表1所示，与其它任何样品相比，实施例1～3的偶联体(miPEP156a)2-HML促进白菜种子发芽生长效果最为显著，且随着噁霉灵对(miPEP156a)2接枝率的提升，发芽长度也会提高，实施例3的长度为对照的2.52倍。同时，结果表明(miPEP156a)2与miPEP156a样品对白菜种子发芽生长几乎没有明显差别，说明将两个miPEP156a通过柔性链接(G4S)3融合并没有对miPEP156a的功能产生影响。而将miPEP156a二重复单元(miPEP156a)2与噁霉灵偶联，效果显著提高的原因主要应该为：1.miRNA前体产生小肽miPEP156a与噁霉灵都可以被植物吸收，但从根部进入植物方式不同，因此两者偶联显著提高了各自进入植物体内的效率；2.miRNA前体产生小肽miPEP156a与噁霉灵都能够促进植物发芽生长，两者偶联起到了明显的功能协同性和效果促进。因此，偶联体(miPEP156a)2-HML具有潜在的促进植物发芽生长的功能。
表1.偶联体(miPEP156a)2-HML对白菜的发芽生长试验
Figure BDA0003716198780000101
*1,2噁霉灵HML含量与实施例3中(miPEP156a)2-HML中HML组分含量一致。
实施例5偶联体(miPEP156a)2-HML对萝卜发芽生长试验
选择萝卜种子进行实验，具体操作步骤和样品用量参考实施例4。
结果如表2所示，与其它样品相比，实施例1和例3的偶联体(miPEP156a)2-HML显著促进了萝卜种子发芽生长，实施例3芽长度比对照提高了132.2％，比(miPEP156a)2&HML 混合物提高了26.7％。因此，偶联体(miPEP156a)2-HML具有应用于植物发芽生长的潜力。
表2偶联体(miPEP156a)2-HML对萝卜的发芽生长试验
Figure BDA0003716198780000102
Figure BDA0003716198780000111
*1,2噁霉灵HML含量与实施例3中(miPEP156a)2-HML中HML组分含量一致。
实施例6偶联体(miPEP156a)2-HML抑制黄瓜枯萎病试验
选择前茬黄瓜枯萎病中等偏重，植株初花期开始发病的区域进行实验。试验设置如下8个处理：(1)对照组，不加农药；(2)miRNA前体产生小肽miPEP156a(多肽合成，终浓300mg/L)；(3)miPEP156a二重复单元(miPEP156a)2(终浓度300mg/L)，(4) 噁霉灵(浓度30mg/L)，(5)300mg/L(miPEP156a)2与30mg/L HML混合物，(6)实施例1制备的(miPEP156a)2-HML((miPEP156a)2浓度为463mg/L，HML浓度为30mg/L)， (7)实施例2制备的(miPEP156a)2-HML((miPEP156a)2浓度为658mg/L，HML浓度为 30mg/L)；(8)实施例3制备的(miPEP156a)2-HML((miPEP156a)2浓度为291mg/L，HML 浓度为30mg/L)。每个处理4次重复，每个重复面积30m2，黄瓜100株，每株浇灌药液0.5kg，每隔7天一次，共浇施3次。用药结束15d后观察植株枯萎病发病情况，记录病株率和防治效果：
病株率＝(病株数/调查总数)×100％；
防治效果＝[(对照区病株率-处理区病株率)/对照区病株率]×100％
结果如表3所示，miPEP156a和(miPEP156a)2对黄瓜枯萎病抑制效果和对照一致，几乎没有抑制效果。而噁霉灵或含噁霉灵的组合物或者偶联体对黄瓜枯萎病能够产生明显的抑制作用。但偶联体(miPEP156a)2-HML对黄瓜枯萎病的抑制率最高，防治率超过65％。药效提高可能如下两个主要原因：一者，miPEP156a与HML偶联增加了HML进入植物体内的效率，因为HML也是内吸型绿色农药；二者，miPEP156a与HML偶联，对HML起到了缓释和结构稳定的作用，延长了噁霉灵的作用时间。因此，(miPEP156a)2-HML是抑制某些植物病害的较佳选择之一。
表3.偶联体(miPEP156a)2-HML防治黄瓜枯萎病防治效果
Figure BDA0003716198780000112
Figure BDA0003716198780000121
实施例7偶联体(miPEP156a)2-HML抑制樱桃茎腐病试验
樱桃茎腐病频发的区域进行大田实验。设置如下8个处理：(1)对照组，不加农药；(2)miRNA前体产生小肽miPEP156a(多肽合成，终浓度300mg/L)；(3)二重复单元miRNA前体产生小肽(miPEP156a)2(终浓度300mg/L)，(4)噁霉灵(浓度30mg/L)， (5)300mg/L(miPEP156a)2与30mg/L HML混合物，(6)实施例1制备的 (miPEP156a)2-HML((miPEP156a)2浓度为463mg/L，HML浓度30mg/L)，(7)实施例 2制备的(miPEP156a)2-HML((miPEP156a)2浓度为658mg/L，HML浓度30mg/L)，(8) 实施例3制备的(miPEP156a)2-HML((miPEP156a)2浓度为291mg/L，HML浓度30mg/L)。在频发7-8月之前的5月和6月份，采取灌根方法，对幼苗期施用上述样品3次，每隔7天一次，共浇施3次。用药结束15d后观察植株发病情况，记录病株率和防治效果：
对照组和实验组每个区域随机抽查四个角和中心5个点，每个点查5株，计算病情指数和防治效果。具体计算方法如下：
0级：全株无病；
1级：茎部病斑不超过茎围的三分之一，个别叶片萎蔫；
3级：茎部病斑不超过茎围的二分之一；
5级：茎部病斑超过茎围的二分之一；
7级：茎部病斑环绕茎围；
9级：病株枯死。
病情指数＝(∑各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶数×9)×100％；
防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/(对照病情指数)×100％。
结果表明，miPEP156a和(miPEP156a)2对樱桃茎腐病抑制效果和对照一致，几乎没有抑制效果。噁霉灵或含噁霉灵的组合物(miPEP156a)2&HML抑制效果对樱桃茎腐病的抑制率约40％左右。而实施例1～3的偶联体(miPEP156a)2-HML对樱桃茎腐病的抑制率都在约60％左右。因此，本发明的偶联体(miPEP156a)2-HML是抑制某些水果病害的较佳选择之一。
因此，本发明的miPEP156a与噁霉灵偶联体通过噁霉灵先和琥珀酸酐反应以提供羧基，然后通过基因工程菌E.coli BL21制备miPEP156a二重复单元(miPEP156a)2，最后通过碳二亚胺(EDC)法/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)法将琥珀酰噁霉灵与小肽(miPEP156a)2偶联制备而成。本发明的噁霉灵和小肽(miPEP156a)2共价偶联体(miPEP156a)2-HML显著提高了噁霉灵和miPEP156a进入植物体内效率、两组分的协同性和活性，从而高效促进植物种子的发芽生长以及植物的抗病性，降低miPEP156a和噁霉灵的使用量，产生客观的经济效益和环境效益，具有广阔的市场应用前景。
综上所述，本发明的miPEP156a与噁霉灵偶联体既能够促进植物的发芽生长，又增强植物的抗病性，且减少miPEP156a和噁霉灵的使用量，从而减少农药对环境的污染，适于大规模推广应用。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。
Figure BDA0003716198780000141
Figure BDA0003716198780000151
序列表
<110> 苏州乙水茉生物科技有限公司
<120> miPEP156a与噁霉灵偶联体及其制备方法和应用
<160> 4
<210> 1
<211> 99
<212> DNA
<213> 十字花科植物（Brassicaceae family）
<220>
<221> mat_peptide
<222> (1)...(99)
<223> 编码十字花科植物的miRNA前体产生小肽miPEP156a的核苷酸序列
<400> 1
atgttttgca gcattcagtg cctggcgcgc catctgtttc cgctgcatgt gcgcgaaatt 60
aaaaaagcga ccaaagcgat taaaaaagat aaaaccctg 99
<210> 2
<211> 33
<212> PRT
<213> 十字花科植物（Brassicaceae family）
<220>
<221> peptide
<222> (1)...(33)
<223> 十字花科植物的miRNA前体产生小肽miPEP156a的氨基酸序列
<400> 2
Met Phe Cys Ser Ile Gln Cys Leu Ala Arg His Leu Phe Pro Leu His
1 5 10 15
Val Arg Glu Ile Lys Lys Ala Thr Lys Ala Ile Lys Lys Asp Lys Thr
20 25 30
Leu
33
<210> 3
<211> 240
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(240)
<223> 编码miPEP156a二重复单元的核苷酸序列
<400> 3
atgttttgca gcattcagtg cctggcgcgc catctgtttc cgctgcatgt gcgcgaaatt 60
aaaaaagcga ccaaagcgat taaaaaagat aaaaccctgg gcggcggcgg cagcggcggc 120
ggcggcagcg gcggcggcgg cagcttttgc agcattcagt gcctggcgcg ccatctgttt 180
ccgctgcatg tgcgcgaaat taaaaaagcg accaaagcga ttaaaaaaga taaaaccctg 240
<210> 4
<211> 80
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> peptide
<222> (1)...(80)
<223> miPEP156a二重复单元的氨基酸序列
<400> 4
Met Phe Cys Ser Ile Gln Cys Leu Ala Arg His Leu Phe Pro Leu His
1 5 10 15
Val Arg Glu Ile Lys Lys Ala Thr Lys Ala Ile Lys Lys Asp Lys Thr
20 25 30
Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Phe Cys Ser Ile Gln Cys Leu Ala Arg His Leu Phe Pro Leu His Val
50 55 60
Arg Glu Ile Lys Lys Ala Thr Lys Ala Ile Lys Lys Asp Lys Thr Leu
65 70 75 80

Claims (10)

1.一种miPEP156a与噁霉灵偶联体，其特征在于，包括miPEP156a单体或miPEP156a多重复单元融合蛋白、以及琥珀酰噁霉灵，所述miPEP156a单体或所述miPEP156a多重复单元融合蛋白偶联至所述琥珀酰噁霉灵，所述琥珀酰噁霉灵通过噁霉灵和琥珀酸酐反应制备而成。
2.根据权利要求1所述的miPEP156a与噁霉灵偶联体，其特征在于，所述miPEP156a多重复单元融合蛋白为miPEP156a二重复单元融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的miPEP156a与噁霉灵偶联体，其特征在于，所述miPEP156a二重复单元的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
4.一种根据权利要求1所述的miPEP156a与噁霉灵偶联体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将所述噁霉灵和所述琥珀酸酐反应制备成所述琥珀酰噁霉灵；
(2)将所述miPEP156a单体或所述miPEP156a多重复单元融合蛋白偶联至所述琥珀酰噁霉灵，获得所述miPEP156a与噁霉灵偶联体。
5.根据权利要求4所述的miPEP156a与噁霉灵偶联体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：将所述噁霉灵和所述琥珀酸酐溶于第一溶剂中，然后加入催化剂，避光搅拌反应，获得所述琥珀酰噁霉灵。
6.根据权利要求5所述的miPEP156a与噁霉灵偶联体的制备方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述第一溶剂为无水吡啶，所述琥珀酸酐的摩尔量为所述噁霉灵的摩尔量的1.5倍～4倍，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶，所述避光搅拌反应的温度为40℃～60℃，所述避光搅拌反应的时间为4h～9h。
7.根据权利要求4所述的miPEP156a与噁霉灵偶联体的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述miPEP156a多重复单元融合蛋白通过将所述miPEP156a多重复单元融合蛋白的核苷酸序列重组于表达载体中获得重组表达载体，然后将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆菌发酵纯化制备而成。
8.根据权利要求4所述的miPEP156a与噁霉灵偶联体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：
(21)将所述琥珀酰噁霉灵溶于第二溶剂中，然后加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺进行活化，获得活化溶液；
(22)将所述miPEP156a单体或所述miPEP156a多重复单元融合蛋白溶于第三溶剂中，获得含肽溶液；
(23)将所述活化溶液加入到所述含肽溶液中进行偶联反应，获得所述miPEP156a与噁霉灵偶联体。
9.根据权利要求8所述的miPEP156a与噁霉灵偶联体的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述第二溶剂为二甲基甲酰胺，所述碳二亚胺的摩尔量和所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔量分别为所述琥珀酰噁霉灵的摩尔量的1.5倍～4倍，所述活化的温度为室温，所述活化的时间为4h-6h，所述第三溶剂为碳酸盐缓冲液，所述miPEP156a单体的摩尔量或所述miPEP156a多重复单元融合蛋白的摩尔量为所述的琥珀酰噁霉灵的摩尔量的0.1倍～0.3倍，所述偶联反应采用室温反应过夜。
10.根据权利要求1～权利要求3中任一项所述的miPEP156a与噁霉灵偶联体在促进植物发芽生长和增强植物抗病性中的应用。
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