CN115074372A - 一种重组的非洲猪瘟病毒j18l亚单位蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种重组的非洲猪瘟病毒j18l亚单位蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组的非洲猪瘟病毒跨膜蛋白J18L亚单位蛋白及其制备方法和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述制备方法如下：1)将密码子优化后的非洲猪瘟病毒J18L蛋白编码基因序列克隆到原核表达载体中，得到含有非洲猪瘟病毒J18L亚单位蛋白编码基因的重组质粒；2)再将所述含有非洲猪瘟病毒J18L亚单位蛋白编码基因的质粒重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞中，得到重组工程菌；3)中重组工程菌进行诱导表达，并从菌体裂解上清中纯化非洲猪瘟J18L亚单位蛋白。本发明能够提供一种可大规模工业化生产的非洲猪瘟跨膜蛋白J18L亚单位蛋白且制备方法简单、成本低能够达到国家现有标准。

Description

一种重组的非洲猪瘟病毒J18L亚单位蛋白及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域。涉及一种非洲猪瘟J18L蛋白制备方法和应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的猪的急性、热性、高度接触性传染病，发病率及死亡率高达100％。猪感染非洲猪瘟病毒后出现皮肤充血，内脏器官出血，高热为特征临床症状，猪是ASFV自然感染的唯一哺乳动物宿主，包括家猪和野猪，尤其是家猪，易感性极高，对畜牧业影响巨大。世界动物卫生组织将其列为A类疫病，我国也将其列为一类动物传染病。
该病最早在1921年于非洲的肯尼亚国家确认发生，对非洲乃至全球多个国家的养猪业造成极大打击。2018年8月份以来，在我国多个省份爆发，给我国养猪业带来了严重的经济损失。虽然，国内外学者对非洲猪瘟做了大量的研究工作，但研究发现：常规制备的非洲猪瘟灭活苗效果不明显，而弱毒苗保护效果也不好，且安全性差，易造成散毒。目前，世界上尚未有有效预防非洲猪瘟的疫苗和治疗该病的药物发现，迫切需要新型疫苗的研发和生产来预防非洲猪瘟。
ASFV病毒是具有囊膜的虫媒DNA病毒。病毒颗粒呈二十面体对称结构，平均直径200nm，表面有含糖脂类的囊膜覆盖。其病毒基因组为双股线性DNA，大小为170-190kb，整个基因组大约有150个ORF，编码150-200中蛋白质。J18L蛋白由E199L基因编码的富含半胱氨酸的病毒跨膜蛋白。该基因含有195个氨基酸，分子量约21.7kDa，疏水结构在C端附近，可能作为膜受体起作用，也可能是作为膜锚定蛋白或者离子通道蛋白。该蛋白与痘病毒病毒进入融合复合物中的A16、G9和J5蛋白相似，介导非洲猪瘟病毒膜融合和病毒核衣壳蛋白释放。因此，J18L对病毒粒子的侵染非常关键，有可能是一个很好的保护性抗原。在当前没有可能大规模制备灭活疫苗或弱毒疫苗的情况下，确定一种制备该病毒的免疫原性蛋白的方法，以便研究一种能够预防该疾病的疫苗或具有能够预防该疾病的亚单位蛋白具有重大的意义。
发明内容
在现有技术的基础上，本发明为了克服现有技术中存在的诸多缺陷(如昆虫杆状病毒制备成本较高、大肠杆菌中不能直接可溶性表达J18L等)，提供了一种可在大肠杆菌中直接可溶性表达J18L亚单位蛋白的大规模可溶性制备方法。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种可在大肠杆菌中表达J18L的优化后的opti-J18L的核苷酸的序列，所述OPTI-J18L核苷酸的序列如SEQ ID NO 1所示。
为了能够在大肠杆菌中高效可溶性表达J18L，本发明在opti-J18L的核苷酸的序列5’端加入TrxA伴侣蛋白的基因编码序列，得到opti-TrxA-J18L，所述OPTI-TrxA-J18L蛋白的基因编码序列如SEQ ID NO 3所示，所述TrxA伴侣蛋白的基因编码序列如SEQ ID NO 5所示。
为了后续能够去除TrxA伴侣蛋白，本发明在TrxA与J18L中间插入了一种酶的酶切位点的基因编码序列，得到opti-TrxA-酶切位点-J18L。优选地，一种酶的酶切位点的基因编码序列为TEV酶切位点的基因编码序列，即为opti-TrxA-TEV-J18L，所述的TEV酶切位点的基因编码序列如SEQ ID NO 6所示。
为了方便使用亲和层析的方法纯化融合蛋白，本发明在opti-TrxA-TEV-J18L的核苷酸序列的5’端加入6个组氨酸的基因编码序列；所述6个组氨酸的基因编码序列如SEQ IDNO 7所示。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种OPTI-TrxA-TEV-J18L融合蛋白，所述OPTI-TrxA-TEV-J18L融合蛋白的氨基酸序列是所述核苷酸序列编码的序列如SEQ ID NO4所示。优选地，在如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接有poly-His、FLAG、c-myc、HA和poly-Arg中的一种标签。
根据本发明的又一个方面，为了能够在大肠杆菌中高效可溶性表达J18L蛋白，本发明将opti-TrxA-TEV-J18L核苷酸序列克隆至原核表达载体中，得到含有J18L序列的的重组载体。优选地，所述载体为pET30a载体质粒。
根据本发明的再一个方面，为了高效可溶性表达可溶性的J18L蛋白，本发明分别将含有opti-TrxA-TEV-J18L核苷酸序列重组载体转化至感受态大肠杆菌中，得到含有opti-TrxA-TEV-J18L核苷酸序列重组载体的大肠杆菌菌株，优选地，所述感受态大肠杆菌为BL21(DE3)。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种制备可溶性表达J18L亚单位蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
1)将opti-TrxA-TEV-J18L核苷酸序列克隆到原核表达载体(优选pET30a质粒)中，得到含有非洲猪瘟病毒OPTI-TrxA-TEV-J18L融合蛋白编码基因的重组质粒(优选，pET30a-opti-TrxA-TEV-J18L重组质粒)；
2)将步骤1)中的重组质粒转化大肠杆菌细胞中，得到重组表达OPTI-TrxA-TEV-J18L的大肠杆菌菌株(优选，pET30a-opti-TrxA-TEV-J18L的大肠杆菌菌株)；
3)将步骤2)得到的大肠杆菌菌株进行发酵培养，IPTG诱导后，得到含有可溶表达OPTI-TrxA-TEV-J18L融合蛋白的发酵后的大肠杆菌菌体；
4)回收步骤3)发酵后的大肠杆菌菌体破碎后的上清液，分离纯化带有标签的OPTI-TrxA-TEV-J18L融合蛋白；
5)使用TEV酶对步骤4)中的OPTI-TrxA-TEV-J18L融合蛋白进行酶切、透析后，使用镍柱亲和层析获得非洲猪瘟J18L蛋白；以及
6)将步骤5)中所得的非洲猪瘟J18L蛋白或其他蛋白和药学上可以接受的佐剂按照一定比例混合，以得到非洲猪瘟J18L亚单位蛋白疫苗。
在本发明的优选技术方案中，步骤2)中，所述大肠杆菌菌株选自BL21(DE3)、BL21star(DE3)、arcticexpress中的一种菌株。更优选地，步骤2)中所述大肠杆菌菌株使用BL21(DE3)。
在本发明的优选技术方案中，步骤4)中，在如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接有poly-His、FLAG、c-myc、HA和poly-Arg中的一种标签。所述标签是在如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接有poly-His、FLAG、c-myc、HA和poly-Arg中的一种标签。
在本发明的技术方案中，优选地，步骤3)中使用IPTG的浓度为0.5mmol/L。
在本发明的技术方案中，优选地，步骤4)中使用裂解液：20mM Tris(pH 8.7)，500mM NaCl，0.2％TritonX-114，5％甘油，1mMβ-ME。
在本发明的技术方案中，优选地，步骤4)J18L亚单位可溶性融合蛋白的纯化方法，采用镍柱做亲和层析，咪唑的浓度为0、20、50和500mM。
在本发明的技术方案中，优选地，步骤5)中使用TEV酶对融合蛋白进行酶切，所述的TEV酶的质量是融合蛋白质量的5％；所述酶切条件是在30±1℃的温度下酶切16±2小时。
本发明中所用的连接TrxA蛋白和J18L蛋白的TEV酶切位点是基于成本和使用方便的考虑，也可以使用其他的酶切位点，如Factor Xa Protease(识别序列IEGR)，HRV 3CProtease(识别序列LEVLFQGP)，Enterokinase(识别序列DDDDK)。因此，其他的技术人员在本发明的基础上更换酶切位点的技术方案也应落入本发明的保护范畴之内。
本发明中所用的pET30a质粒是最优选择的质粒，本发明人也用过其他的质粒，如、pET32a、pcold等，也选用其他伴侣蛋白如SUMO，没有取得预期的效果，不是表达量太低就是可溶性表达太差，不符合设计预期以及工业化生产的需求。
与现有技术相比，本发明公开的表达序列、表达载体以及相应的纯化制备方法克服了现有技术中的缺陷，解决了大肠杆菌中不能直接大量可溶性表达J18L蛋白且产量低的问题。本发明能够在大肠杆菌中直接可溶性表达J18L，克服了现有技术中的包涵体表达及产量低等诸多问题，且制备方法简单、表达量高、成本低。
附图说明
图1表示J18L基因序列优化前后比对结果。
图2表示pET30a-opti-TrxA-TEV-J18L质粒图谱。
图3表示pET30a-opti-TrxA-TEV-J18L双酶切鉴定结果：M是DNA Marker：DL10000Marker；1-2号质粒NdeI/PvuI双酶切，条带大小分别为4194bp,2023bp，酶切鉴定构建正确。
图4表示小量诱导表达重组TrxA-J18L蛋白SDS-PAGE检测结果，其中M是Marker，1是诱导前上清，2是诱导前沉淀，3是诱导后上清，箭头指向为TrxA-J18L蛋白。4是诱导后沉淀，从图中可以看出，目的蛋白90％为可溶性表达。
图5表示酶切纯化重组J18L的SDS-PAGE纯化检测结果：M是蛋白Marker，1是纯化后的J18L蛋白。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。
本发明实施例中所使用的菌株、质粒和试剂均为市售产品。
实施例1 J18L蛋白表达及制备
1.1非洲猪瘟J18L蛋白的选择
非洲猪瘟结构蛋白J18L是由E199L基因编码的跨膜蛋白，已有研究表明，主要在病毒感染后期表达，参与病毒粒子的组装，是内层囊膜的主要蛋白。因此，J18L对病毒粒子的复制非常关键，有可能是一个很好的保护性抗原。因此，利用J18L蛋白作为抗原具有很好的防控非洲猪瘟的感染，尽管J18L蛋白报道在原核表达系统中存在表达，但是，目前还没有报道在原核表达系统中能可溶性表达及纯化得到该蛋白，这也是本发明所要解决的一个重要的技术问题。
为了能够很好的表达可溶性表达J18L，我们对常用的伴侣蛋白(如TF,SUMO,Nus)进行了筛选，没有取得预期的效果，不是表达量太低就是可溶性表达太差，不符合设计预期以及工业化生产的需求
为了后续能够去除TrxA伴侣蛋白，本发明在TrxA与J18L中间插入了一种酶的酶切位点的基因编码序列，连接TrxA蛋白和J18L蛋白的TEV酶切位点是基于成本和使用方便的考虑，也可以使用其他的酶切位点，如Factor Xa Protease(识别序列IEGR)，HRV 3CProtease(识别序列LEVLFQGP)，Enterokinase(识别序列DDDDK)。因此，其他的技术人员在本发明的基础上更换酶切位点的技术方案也应落入本发明的保护范畴之内。
为了使所述亚单位TrxA-J18L蛋白便于纯化，可在如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接如表一所示的标签，本实施例中具体以在羧基端添加Poly-His为例，将其连接于如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的羧基末端处。
表一标签及其氨基酸序列
Figure BDA0002970807990000051
1.2非洲猪瘟J18L蛋白密码子优化
本实验室以2018年在中国报道流行的非洲猪瘟毒株亚型，参考Georgia 2007/1全基因序列(GenBank：FR682468.1)为模板，对编码非洲猪瘟J18L蛋白的E199L的胞外区核苷酸序列(如SEQ ID NO.2所示)进行密码子优化，得到OPTI-J18L序列，如SEQ ID NO.1所示，该序列合成工作委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。如图1所示，优化前后有24.9％的核苷酸序列不同。
1.3 pET30a-opti-TrxA-TEV-J18L重组质粒构建
1.3.1 PCR扩增目的片段opti-TrxA-TEV-J18L
1.3.1.1 J18L PCR反应
(1)引物设计及合成
上游引物1:5’-GTGCTCGAGTTAGGTGTTAATAACGCTGTTG-3’
下游引物1:5’-GCCGGTTCTGGTTCTGGCCATGAGAACCTGTACTTCCAGGGTAGCTGCATGCCGGTTAGC-3’
上游引物2：5’-ATGGCCAGAACCAGAACCGGCC-3’
下游引物2：
5’-ATACATATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACGGCAGCGGCAGCGATAAAATTATTCACCTG-3’
(2)加样体系50μL，如下表所示：
Figure BDA0002970807990000061
PCR扩增程序：
Figure BDA0002970807990000062
1.3.1.2 PCR产物进行胶回收
(1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管；
(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值；
(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中；
(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μL PC buffer，50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；
(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL平衡液BL，离心12,000rpm/min，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置2min，10,000rpm/min，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2放入收集管中；
(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW buffer，静置3min，离心10,000rpm/min，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；
(8)重复步骤(7)；
(9)空吸附柱离心，12,000rpm/min，2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干；
(10)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL Elutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm/min，2min；
(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱CB2，盖上离心管盖子，保留离心管中的DNA样品；
(12)将步骤11中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收DNA片段。
1.3.2 PCR扩增伴侣蛋白片段TrxA
利用上游引物2和下游引物2，以pET32a质粒为模板，采用1.3.1的方法，克隆回收得到TrxA片段。
1.3.3 PCR扩增目的蛋白片段opti-TrxA-TEV-J18L
利用上游引物1和下游引物2，以1.3.1亚克隆得到的J18L为模板，以1.3.2亚克隆得到的TrxA为模板，采用1.3.1的方法，克隆回收得到opti-TrxA-TEV-J18L。
1.3.4 PCR产物及载体双酶切反应
(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，在1.5mL EP管中按照下表进行加样、混匀：50μL反应体系
Figure BDA0002970807990000071
Figure BDA0002970807990000081
(2)将步骤(1)中的1.5mL EP管置于酶最适温度25℃恒温水浴锅中，水浴3h。
双酶切产物胶回收：取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段，方法同1.2.1中PCR产物胶回收。
1.3.5连接反应
(1)准备洁净的1.5mL EP管若干，做好标记，置于EP管架上待用。
(2)在1.5mL EP管按照下表进行加样、混匀。
Figure BDA0002970807990000082
(3)按照步骤(2)中表格完成加样后，将每个10μl反应体系置于16℃低温冷却液循环机中，水浴10-16h；
(4)取出步骤(3)中EP管，将其置于65℃水浴锅中，水浴15min；
(5)取出步骤(4)中的EP管，置于4℃保存。
1.3.6转化反应
(1)将10μL连接反应液快速加入100μL感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min；
(2)取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min；
(3)取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μL液体LB培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养1h；
(4)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm/min，2min，去掉600μL上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。
(5)将转化步骤(4)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h；
(6)观察转化结果。
1.3.7质粒抽提与双酶切鉴定
1.3.7.1质粒抽提
(1)用10μL移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5mL含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm/min摇菌过夜；
(2)将菌液移至1.5mL EP管中，室温离心，12,000rpm/min，2min，弃上清；
(3)向步骤(2)的EP管中加入250μL质粒提取试剂P1 buffer，彻底悬浮菌体；
(4)向步骤(3)溶液中加入250μL P2 buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4min；
(5)向步骤(4)溶液中加入350μL P3 buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀；室温静置2-4min；
(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm/min，10min；
(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；
(8)向吸附柱中心加入500μL Buffer DW1，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；
(9)向吸附柱中心加入500μL wash solution，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体，重复一次；
(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。
(11)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜中心加入30μL Elutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min。保存管中DNA溶液。
1.3.7.2双酶切鉴定
(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，按照下表进行加样：20μL反应体系
Figure BDA0002970807990000091
Figure BDA0002970807990000101
(2)将步骤(1)中的EP管20μL反应体系置于37℃恒温水浴锅中，水浴2h。
(3)将步骤(2)中的双酶切体系样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查插入片段大小是否正确；实验结果见图3：1-2号质粒NdeI/PvuI双酶切，条带大小分别为4194bp,2023bp，酶切鉴定构建正确。
(4)选择插入片段正确的克隆送测序公司测序。将测序结果正确的质粒保存备用。
1.4非洲猪瘟J18L蛋白表达
1.4.1转化大肠杆菌BL21(DE3)
吸取1μL质粒(1.3.7.1中提取的质粒)加入100μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min；42℃热激90s；冰浴2min；在超净台内加入500μL无抗性的LB培养液；37℃220rpm摇1h；吸取100μL菌液涂卡那抗性LB平板，37℃过夜培养，挑取单克隆(E.coliBL21pET30a-opti-TrxA-TEV-J18L)并加入甘油于-80℃保存备用。
1.4.2小量诱导表达
(1)甘油管保藏管菌株活化：取E.coli BL21 pET30a-opti-TrxA-TEV-J18L菌株甘油保藏管解冻，用接种环挑取甘油管中菌悬液于卡那霉素抗性平板(50μg/mL)上划线，37℃培养过夜。
(2)挑菌活化：于培养好的平板上挑取单克隆至3mL卡那抗性LB培养基中，37℃220r/min摇床培养5～6h，至OD600达到0.5～0.8；
(3)发酵接种：将活化好的菌悬液取150μL接种至15mL卡那抗性LB培养基中，37℃，220r/min培养；
(4)降温诱导：当OD 600达到0.6-0.8时，取出5mL菌液，12,000rpm离心5min，将菌体置于-20℃保存，即为“诱导前”。剩余菌液置于冰水浴10min，加入2μL 1M IPTG，终浓度0.5mM IPTG。将摇床温度降至20℃，诱导16h；
(5)菌体收集：发酵结束后，测量OD 600，收集与“诱导前”等量菌体，12,000r/min离心5min，收集菌体置于-20℃保存，即为“诱导后”。
诱导表达SDS-PAGE检测结果如图4所示，其中M是Marker，1是诱导前上清，2是诱导前沉淀，3是诱导后上清，箭头指向为TrxA-J18L蛋白。4是诱导后沉淀，从图中可以看出，目的蛋白90％为可溶性表达。
1.4.3大量诱导表达
(1)甘油管保藏管菌株活化：取菌株甘油保藏管解冻，用接种环挑取甘油管中菌悬液于卡那霉素抗性平板上划线，37℃培养过夜。
(2)挑菌活化：于培养好的平板上挑取单克隆至3mL卡那霉素抗性LB培养基中，37℃220r/min摇床培养5～6h，至OD600达到0.5～0.8；
(3)种子液培养：将活化好的菌悬液取150μL接种至150mL卡那霉素抗性LB培养基中，37℃220r/min培养9～10h；
(4)发酵培养基配制：按照发酵培养基配方配制发酵培养基组分1于3L发酵罐中，安装组联发酵罐，发酵培养基组分2及补料培养基配制于蓝口瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min。
(5)发酵参数设置：Agit 400r/min；Tempreture 37℃；pH 7.00；DO 40；Air100％；Gasflow2.0；
(6)发酵接种：于接种口将450mL发酵培养基组分2，1mL发酵培养基组分3，200μL消泡剂，3mL卡那抗生素(50mg/mL)补加到发酵罐中；将培养好的150mL种子液接种至3L发酵培养基中进行发酵罐放大培养，培养5～6h至OD 600值到12～14；
(7)降温诱导：设置温度参数，将发酵罐温度降至20℃，取样，加入0.9mL IPTG(1M)至IPTG终浓度为0.5mM，20℃诱导培养8h；
(8)发酵补料：待发酵培养至OD600达到17～19时，按5％的速度连续补加补料培养基(先将补料培养基组分1和2混匀)。
(9)菌体收集：发酵结束后，收集发酵液在8000r/min离心10min，收集菌体置于-20℃保存。
其中，上述过程中所用培养基如下：
发酵培养基组分1:酵母粉10g/L，胰蛋白胨20g/L，KH2PO4 1.14g/L，K2HPO4 0.9g/L，(NH4)2SO4 3.0g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0；(按3L的量称取培养基各组分，加dd H2O定容至2.4L)；
发酵培养基组分2：甘油30g/L；(按3L的量称取培养基各组分，加dd H2O定容至450mL)；
发酵培养基组分3：VB1 2mg/L；(配制6mg/mL的VB1 0.22μm过滤除菌)；
补料培养基组分1：酵母粉16.67g/L；胰蛋白胨33.33g/L；(按450mL的量称取培养基各组分，加dd H2O定容至300mL)；
补料培养基组分2：甘油100g/L；(按450mL的量称取培养基各组分，加dd H2O定容至150mL)。
1.5融合蛋白TrxA-J18L蛋白纯化
1.5.1菌体重悬及破碎
称取一定量的菌体，裂解液重悬后均质仪破碎，离心收集上清。上样前破菌的菌体上清和沉淀分别取样80μL用于SDS-PAGE分析。
1.5.2镍柱纯化
(1)柱平衡：用超纯水平衡2～3CV(column volume柱体积)，排出乙醇保存液；然后用BufferA平衡2～3CV。
(2)上样：将上清用蠕动泵进行上样，根据镍柱体积设定合适的流速，流穿并收集流穿液。混合后取80μL流穿液用于SDS-PAGE分析。
(3)Wash：用30倍柱体积(CV)wash buffer冲洗内毒素。
(4)冲洗：用10倍柱体积(CV)BufferA冲洗，减少Triton X-114的残留。
(5)洗脱：
20mM咪唑洗脱液(bufferA：bufferB＝24:1混合)洗杂：20mM咪唑洗脱液10倍柱体积洗脱杂蛋白，混合后取80μL用于SDS-PAGE分析；
50mM咪唑洗脱(bufferA：bufferB＝9:1混合)洗杂：50mM咪唑洗脱液2倍柱体积进一步洗脱杂蛋白，混合后取80μL用于SDS-PAGE分析；
Buffer B洗脱目的蛋白：含500mM咪唑的bufferB洗脱目的蛋白并收集，混合后分别取80μL用于SDS-PAGE分析。
1.5.3透析换液
将含有目的蛋白的咪唑洗脱液倒入透析袋内，用bufferA透析至少1,000倍，取80μl留样检测。
1.5.4除菌过滤
在生物安全柜中，过0.22μm低蛋白结合针头滤器，或大量蛋白溶液过灭菌的0.22μm滤膜的Nalgene的滤器，过滤好的蛋白溶液样品存放于-80℃冰箱。
其中上述所用纯化溶液如下：
(1)裂解液：50mM NaH2PO4，500mM NaCl，0.2％Triton X-114，0.05％Tween 20，pH8.0；
(2)wash buffer：50mM NaH2PO4，500mM NaCl，0.4％Triton X-114，0.05％Tween20，pH 7.4；
(3)Buffer A：50mM NaH2PO4，500mM NaCl，0.05％Tween 20，pH 7.4；
(4)Buffer B：50mM NaH2PO4，500mM NaCl，500mM咪唑，0.05％Tween 20，pH 7.4。
1.6非洲猪瘟J18L蛋白的纯化
1.6.1 TEV酶制备：具体制备方法参见文献(Tropea JE1,Cherry S,Waugh DS，Expression and Purification of Soluble His6-Tagged TEV Protease.Methods MolBiol.2009；498:297-307)。
1.6.2酶切
收集步骤1.5获得TrxA-J18L融合蛋白，根据融合蛋白的质量5％的TEV酶(w/w)，混合后在30±1℃酶切16±2h小时，酶切产物透析后(50mM NaH2PO4，200mM NaCl，5mMβ-巯基乙醇，pH 8.0)进行下一步镍柱纯化。
1.7酶切后样品纯化
镍柱平衡：用超纯水平衡2～3柱体积(CV)，排出20％的乙醇保存液；然后用平衡缓冲液(50mM磷酸缓冲液，pH8.0,0.5M NaCl)平衡2～3柱体积(CV)。上样：取透析样品与镍柱填料摇柱混匀后进行流穿，并收集流穿液。去除TrxA标签蛋白：用5倍柱体积(CV)的清洗缓冲液1(50mM磷酸缓冲液，pH7.4,0.5M NaCl)洗柱，至考马斯亮蓝G250检测无蓝色。洗脱：用10倍柱体积(CV)的5mM咪唑清洗缓冲液2(50mM磷酸缓冲液，5mM咪唑，pH8.0,0.5M NaCl)洗杂；10mM或20mM咪唑洗脱缓冲液(50mM磷酸缓冲液，10mM或20mM咪唑，pH8.0,0.5M NaCl)洗脱目的蛋白，至考马斯亮蓝G250检测无蓝色，收集目的蛋白透析后待用。
1.8非洲猪瘟J18L蛋白的鉴定
将实施例1纯化后的蛋白进行SDS-PAGE检测，所用样品中J18L蛋白浓度为2μg/孔，结果如图5所示：从图中可以计算出，纯化后的J18L蛋白SDS-PAGE纯度为90％，分子量约为16kD。
1.9非洲猪瘟J18L蛋白稳定性验证
将实施例1纯化后的蛋白用PBS稀释到0.9mg/ml，分成20份，每份0.5ml；十份置于4℃冰箱中，每周取样一份，连续取样10次；十份置于-20℃冰箱中，每周取样一份，连续取样10次；每次取样后用BCA检测蛋白浓度，结果如下表所示：
Figure BDA0002970807990000141
从蛋白浓度的变化来看，两组实验过程中蛋白基本保持稳定。
1.8重组J18L蛋白免疫原性实验
1.8.1疫苗制备
1.8.1.1按油佐剂：水相(v:v)＝54:46的比例配比。
1.8.1.2抗原准备：将纯化后的重组非洲猪瘟J18L蛋白经过0.22μm滤膜更除菌过滤，检测浓度及纯度，备用。
1.8.1.3水相配制：根据疫苗中J18L蛋白的含量，用1XPBS将J18L蛋白稀释至适当浓度，搅拌10min，使之充分混匀。
1.8.1.4油相准备：按照1.8.1.1的水油比例，量取适量ISA 201VG佐剂。
1.8.1.5乳化：乳化要求油相温度为33±1℃，开启搅拌器，搅拌转速为350rpm/min，在搅拌条件下将水相匀速加入至油相，并持续搅拌10min，使水相和油相充分混合，乳化成双向油乳剂疫苗。
1.8.1.6稳定：乳化结束后，关闭搅拌器，将乳化好的疫苗放入20℃稳定1h。
1.8.1.7分装、贮存：根据免疫需求进行分装，检验合格后于2-8℃进行保存备用。
1.8.2免疫原性实验
1.8.2.1小鼠免疫实验
取16-18g左右健康雌性BALB/c小鼠10只，随机分成2组，每组5只，用1.8.1中制备疫苗进行免一实验。分别于面前，二免后14天进行采血，分离血清进行ELISA检测抗体。
1.8.2.2 ELISA检测实验
(1)包被：用包被液(50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.5)将纯化的J18L蛋白稀释至0.5μg/ml，于96孔板加入100μl/孔，封口膜封好后4℃冰箱放置过夜；
(2)洗涤：从冰箱取出酶标板后，用PBST洗板5次；
(3)封闭：每孔加入200μl封闭液(5％脱脂奶)，封口膜封好后37℃孵育2h；
(4)血清稀释：将用J18L蛋白免疫后的小鼠的免前血清、二免14天血清用封闭液稀释5000倍(如495μl稀释液中加入5μl血清，混匀即可)；
(5)洗涤：同(2)；
(6)加样：加入稀释血清，同时用封闭液做阴性对照，37℃孵育1h；
(7)洗涤：同(2)；
(8)加二抗：每孔加入稀释(稀释比为1:5000)的HRP标记的兔抗鼠IgG二抗100μl，37℃孵育0.5h；
(9)洗涤：同(2)；
(10)显色：避光条件下每孔加入100μl的TMB显色液，37℃孵育10min；
(11)终止：每孔加入50μl终止液(2M H2SO4)，终止反应；
(12)检测：于450nm波长测定样品OD值，分析数据；
(13)结果如下表所示：包被的J18L蛋白的能与J18L蛋白免疫后血清特异性结合，OD450均值为2.044；包被J18L蛋白与小鼠免前血清均没有特异性结合，OD450均值为0.066。这说明，J18L蛋白可以作为Elisa试剂盒的抗原，且免疫后的血清能与J18L蛋白特异性结合，为后期开发一种检测非洲猪瘟感染和免疫的诊断试剂盒及作为亚单位疫苗候选抗原奠定基础。
Figure BDA0002970807990000151
Figure BDA0002970807990000161
本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。
Figure BDA0002970807990000171
Figure BDA0002970807990000181
Figure BDA0002970807990000191
序列表
<110> 浙江海隆生物科技有限公司
<120> 一种重组的非洲猪瘟病毒J18L亚单位蛋白及其制备方法和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 4
<211> 441
<212> DNA
<213> 密码子优化后的J18L蛋白核苷酸序列(DNA)
<400> 4
atgagctgca tgccggttag caccaagtgc aacgacatct gggttgattt tagctgcacc 60
ggcccgagca ttagcgagct gcaaaagaaa gaaccgaaag cgtgggcggc gatcctgcgt 120
agccacacca accagcaaac cgcggaggac gataacatca ttggtagcat ttgcgacaag 180
cagggcctgt gcagcaaaga tgaatacgcg tatagccaat actgcgcgtg cgtgaacagc 240
ggtaccctgt gggcggagtg cgcgtttgcg ccgtgcaacg gcaacaagaa cgcgtataaa 300
accaccgaac agcgtaacat cctgaccaac aagcaatgcc cgagcggtct gaccatctgc 360
cagaacattg cggaatacgg tggcagcggc aacatcagcg acctgtatca aaactttaac 420
tgcaacagcg ttattaacac c 441
<210> 4
<211> 441
<212> DNA
<213> 密码子优化前的J18L蛋白核苷酸序列(DNA)
<400> 4
atgtcttgca tgccagtttc cacgaaatgc aatgatattt gggtcgactt tagctgtaca 60
ggcccttcga tttccgagct gcaaaaaaag gagcccaagg cctgggccgc tattttacgc 120
tcgcatacaa atcaacaaac ggcggaggat gacaatatta ttgggagcat atgcgataaa 180
cagggattgt gctcaaagga tgagtatgcg tatagccagt attgtgcctg tgtgaactcc 240
ggcaccctat gggctgaatg tgcgtttgct ccgtgtaatg gaaataaaaa tgcctataaa 300
acaacggagc aaagaaatat tttgaccaac aagcagtgcc cctccggact caccatatgt 360
cagaacattg cagaatacgg aggctcgggc aatatttccg acctatacca aaatttcaac 420
tgcaacagcg ttataaatac g 441
<210> 4
<211> 843
<212> DNA
<213> TrxA-J18L蛋白核苷酸序列(DNA)
<400> 4
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac ggcagcggca gcgataaaat tattcacctg 60
actgacgaca gttttgacac ggatgtactc aaagcggacg gggcgatcct cgtcgatttc 120
tgggcagagt ggtgcggtcc gtgcaaaatg atcgccccga ttctggatga aatcgctgac 180
gaatatcagg gcaaactgac cgttgcaaaa ctgaacatcg atcaaaaccc tggcactgcg 240
ccgaaatatg gcatccgtgg tatcccgact ctgctgctgt tcaaaaacgg tgaagtggcg 300
gcaaccaaag tgggtgcact gtctaaaggt cagttgaaag agttcctcga cgctaacctg 360
gccggttctg gttctggcca tgagaacctg tacttccagg gtagctgcat gccggttagc 420
accaagtgca acgacatctg ggttgatttt agctgcaccg gcccgagcat tagcgagctg 480
caaaagaaag aaccgaaagc gtgggcggcg atcctgcgta gccacaccaa ccagcaaacc 540
gcggaggacg ataacatcat tggtagcatt tgcgacaagc agggcctgtg cagcaaagat 600
gaatacgcgt atagccaata ctgcgcgtgc gtgaacagcg gtaccctgtg ggcggagtgc 660
gcgtttgcgc cgtgcaacgg caacaagaac gcgtataaaa ccaccgaaca gcgtaacatc 720
ctgaccaaca agcaatgccc gagcggtctg accatctgcc agaacattgc ggaatacggt 780
ggcagcggca acatcagcga cctgtatcaa aactttaact gcaacagcgt tattaacacc 840
taa 843
<210> 4
<211> 280
<212> PRT
<213> TrxA-J18L蛋白的氨基酸序列(PRT)
<400> 4
Met Gly Ser Ser His His His His His His Gly Ser Gly Ser Asp Lys
1 5 10 15
Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala
20 25 30
Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys
35 40 45
Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly
50 55 60
Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala
65 70 75 80
Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn
85 90 95
Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu
100 105 110
Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Glu
115 120 125
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Cys Met Pro Val Ser Thr Lys Cys Asn
130 135 140
Asp Ile Trp Val Asp Phe Ser Cys Thr Gly Pro Ser Ile Ser Glu Leu
145 150 155 160
Gln Lys Lys Glu Pro Lys Ala Trp Ala Ala Ile Leu Arg Ser His Thr
165 170 175
Asn Gln Gln Thr Ala Glu Asp Asp Asn Ile Ile Gly Ser Ile Cys Asp
180 185 190
Lys Gln Gly Leu Cys Ser Lys Asp Glu Tyr Ala Tyr Ser Gln Tyr Cys
195 200 205
Ala Cys Val Asn Ser Gly Thr Leu Trp Ala Glu Cys Ala Phe Ala Pro
210 215 220
Cys Asn Gly Asn Lys Asn Ala Tyr Lys Thr Thr Glu Gln Arg Asn Ile
225 230 235 240
Leu Thr Asn Lys Gln Cys Pro Ser Gly Leu Thr Ile Cys Gln Asn Ile
245 250 255
Ala Glu Tyr Gly Gly Ser Gly Asn Ile Ser Asp Leu Tyr Gln Asn Phe
260 265 270
Asn Cys Asn Ser Val Ile Asn Thr
275 280
<210> 4
<211> 381
<212> DNA
<213> TrxA蛋白核苷酸序列(DNA)
<400> 4
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac ggcagcggca gcgataaaat tattcacctg 60
actgacgaca gttttgacac ggatgtactc aaagcggacg gggcgatcct cgtcgatttc 120
tgggcagagt ggtgcggtcc gtgcaaaatg atcgccccga ttctggatga aatcgctgac 180
gaatatcagg gcaaactgac cgttgcaaaa ctgaacatcg atcaaaaccc tggcactgcg 240
ccgaaatatg gcatccgtgg tatcccgact ctgctgctgt tcaaaaacgg tgaagtggcg 300
gcaaccaaag tgggtgcact gtctaaaggt cagttgaaag agttcctcga cgctaacctg 360
gccggttctg gttctggcca t 381
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成的核苷酸序列(DNA)
<400> 4
gagaacctgt acttccaggg t 21
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成的核苷酸序列(DNA)
<400> 4
caccaccacc accaccac 18

Claims (11)

1.一种OPTI-J18L核苷酸，其特征在于，所述OPTI-J18L核苷酸的序列如SEQ ID NO 1所示。
2.一种OPTI-TrxA-J18L核苷酸，其特征在于，所述OPTI-TrxA-J18L核苷酸的序列是在权利要求1所述的核苷酸序列的5’端插入TrxA伴侣蛋白的基因编码序列，所述OPTI-TrxA-J18L蛋白的基因编码序列如SEQ ID NO 3所示，所述TrxA伴侣蛋白的基因编码序列如SEQID NO 5所示。
3.一种OPTI-TrxA-酶切位点-J18L核苷酸，其特征在于，所述OPTI-TrxA-酶切位点-J18L核苷酸的序列是在权利要求2所述的TrxA蛋白的基因编码序列和权利要求1所述的OPTI-J18L核苷酸序列之间插入一种酶的酶切位点的基因编码序列。
4.根据权利要求3所述的OPTI-TrxA-酶切位点-J18L核苷酸，其特征在于，所述酶的酶切位点的基因编码序列为TEV酶的酶切位点的基因编码序列，所述TEV酶的酶切位点的基因编码序列如SEQ ID NO 6所示。
5.根据权利要求4所述的OPTI-TrxA-酶切位点-J18L核苷酸，其特征在于，在OPTI-TrxA-TEV-J18L的核苷酸序列的5’端加入6个组氨酸的基因编码序列；所述6个组氨酸的基因编码序列如SEQ ID NO 7所示。
6.一种OPTI-TrxA-TEV-J18L融合蛋白，其特征在于，所述OPTI-TrxA-TEV-J18L融合蛋白的氨基酸序列是如权利要求2-5任一所述的核苷酸序列编码的序列如SEQ ID NO 4所示。
7.根据权利要求6所述的OPTI-TrxA-TEV-J18L融合蛋白，其特征在于，在如SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接有poly-His、FLAG、c-myc、HA和poly-Arg中的一种标签。
8.一种可溶性表达非洲猪瘟J18L蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
1)将权利要求6-7任一所述的OPTI-TrxA-TEV-J18L融合蛋白基因克隆到原核表达载体中，得到含有非洲猪瘟病毒OPTI-TrxA-TEV-J18L融合蛋白编码基因的重组质粒；
2)再将所述重组质粒转化至大肠杆菌细胞中，得到重组表达OPTI-TrxA-TEV-J18L的大肠杆菌菌株；
3)将步骤2)得到的所述大肠杆菌菌株进行发酵培养，IPTG诱导后，得到含有可溶表达OPTI-TrxA-TEV-J18L融合蛋白的发酵后的大肠杆菌菌体；
4)回收步骤3)发酵后的大肠杆菌菌体破碎后的上清液，分离纯化带有标签的OPTI-TrxA-TEV-J18L融合蛋白；
5)使用TEV酶对步骤4)中所述OPTI-TrxA-TEV-J18L融合蛋白进行酶切、透析后，使用镍柱亲和层析获得非洲猪瘟得到J18L蛋白；以及
6)将步骤5)中所得的J18L蛋白和药学上可以接受的佐剂按照一定比例混合，以得到非洲猪瘟J18L亚单位蛋白疫苗。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述原核表达载体选自pET30a、pBAD、pcold、pQE、pKK载体中的一种。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌菌株选自BL21(DE3)、BL21 star(DE3)、arcticexpress、C41(DE3)、C43(DE3)菌株中的一种。
11.一种如权利要求1-10任一权利要求所述的制备非洲猪瘟J18L蛋白和非洲猪瘟J18L亚单位疫苗的诊断试剂中的应用。
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