CN115074291A - 一株能够提高发酵桔梗的活性成分及抗氧化能力的巨大芽孢杆菌、方法和应用 - Google Patents

一株能够提高发酵桔梗的活性成分及抗氧化能力的巨大芽孢杆菌、方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种能够用于发酵桔梗的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，所述巨大芽孢杆菌的名称为：ZY2104，分类名称为：巨大芽孢杆菌，保藏编号为：CGMCCNO.25062，保藏日期：2022年6月10日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明巨大芽孢杆菌ZY2104菌株分离自新鲜桔梗根部土壤，具有β‑葡萄糖苷酶活性。本发明方法可以显著提高桔梗发酵液中多酚、黄酮等活性成分，提高其抗氧化能力。

Description

一株能够提高发酵桔梗的活性成分及抗氧化能力的巨大芽孢 杆菌、方法和应用
技术领域
本发明属于微生物、桔梗发酵技术领域，尤其是一株能够提高发酵桔梗的活性成分及抗氧化能力的巨大芽孢杆菌、方法和应用。
背景技术
桔梗(Platycodonis Radix)为桔梗科(Campanulaceae)桔梗属植物桔梗(Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.)的干燥根，属于一种药食同源的中药材。桔梗始载于《神农本草经》，性微温，味甘苦辛，入肺经，具有宣肺利咽、祛痰排脓之功效。由于其含有丰富的黄酮、多酚、皂苷、多糖类物质，因此具有较强的抗氧化、抗肿瘤、抗炎、降血糖、降血脂等功效。除了富含这些药效物质外，鲜桔梗中还含有蛋白质、脂肪、碳水化合物等主要营养成分以及钙、磷、铁等矿物质。
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)是芽孢杆菌属，属于好氧革兰氏阳性杆菌，菌株表达率高、遗传稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟，是一种有益菌，具有对环境和人畜无害等特点而受到人们的关注与研究。菌株在24h内氨碳降解率达到95％以上，并且还具有硝酸还原与亚硝酸的还原能力，其中的海藻胶裂降解酶、蛋白酶、纤维素酶活性会把构成海藻大分子的物质逐渐降解为小分子和水溶性物质，保留了海藻生物活性。并且其产生的谷氨酸脱羧酶可催化谷氨酸生成γ-氨基丁酸，该氨基酸作为哺乳动物神经系统中重要的神经传递素，具有降低血压、镇静、利尿等功能。但有关巨大芽孢杆菌是否能够提高发酵桔梗的活性成分尚未见报道。
中药成分经微生物发酵转化是中药发挥药理作用的关键过程。微生物发酵中药具有提高有效成分含量、增强疗效、扩大适应证、减少毒副作用、产生新的药用资源等作用。但巨大芽孢杆菌对于中药发酵的研究较少。
因此，寻找一种可促进发酵桔梗活性成分提高且能提高抗氧化能力的菌株具有重要的意义。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一株能够提高发酵桔梗的活性成分及抗氧化能力的巨大芽孢杆菌、方法和应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一株能够提高发酵桔梗的活性成分及抗氧化能力的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，所述巨大芽孢杆菌的名称为：ZY2104，分类名称为：巨大芽孢杆菌，保藏编号为：CGMCC NO.25062，保藏日期：2022年6月10日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
进一步地，所述巨大芽孢杆菌是从新鲜桔梗根部土壤分离获得的。
进一步地，所述巨大芽孢杆菌在R2A固体培养基上菌落呈圆形、灰白色，表面光滑湿润；
或者，所述巨大芽孢杆菌的基因序列为MN473280.1。
进一步地，所述巨大芽孢杆菌具有β-葡萄糖苷酶活性。
进一步地，所述巨大芽孢杆菌能够提高发酵桔梗中活性成分含量；
或者，所述巨大芽孢杆菌能够提高发酵桔梗的总抗氧化能力；
或者，所述巨大芽孢杆菌能够提高发酵桔梗的总还原能力；
或者，所述巨大芽孢杆菌能够提高发酵桔梗的DPPH自由基清除率；
或者，所述巨大芽孢杆菌能够提高发酵桔梗的羟自由基清除率。
一种利用如上所述的巨大芽孢杆菌发酵桔梗的方法，包括步骤如下：
将巨大芽孢杆菌ZY2104的种子发酵液，按2-5％接种量接种于桔梗提取液，发酵条件为：30-42℃摇床培养，转速为50-150r/min，发酵24-72h。
进一步地，所述桔梗提取液的制备步骤如下：
将桔梗片用粉碎机粉碎后，过40目筛制成粉末，称量桔梗粉末和蒸馏水，桔梗粉末：蒸馏水的质量比为2.5：50，充分混匀后，于121℃，20min灭菌，制成桔梗提取液；
所述巨大芽孢杆菌ZY2104的种子发酵液的发酵方法为：
将冻存的巨大芽孢杆菌ZY2104菌液解冻后，接到R2A固体培养基上，于37℃培养箱倒置培养24h，挑取菌株形态最大、表面光滑湿润，边缘整齐的单菌落接种至R2A液体培养基中进行活化，再以1％的接种量接种于R2A液体培养基中37℃，150r/min培养24h。二次活化后制成种子发酵液。
如上所述的巨大芽孢杆菌在桔梗或发酵中药中的应用。
如上所述的巨大芽孢杆菌在提高桔梗发酵液中多酚、黄酮含量方面中的应用。
如上所述的巨大芽孢杆菌在提高桔梗发酵液中抗氧化活性方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明巨大芽孢杆菌ZY2104菌株分离自新鲜桔梗根部土壤，具有β-葡萄糖苷酶活性。将该菌株按2-5％接种量接种于桔梗提取液，发酵条件为：30-42℃摇床培养，转速为50-150r/min，发酵24-72h。本发明所述方法可以显著提高桔梗发酵液中多酚、黄酮等活性成分，提高其抗氧化能力。
2、本发明巨大芽孢杆菌ZY2104具有提高发酵桔梗中活性成分含量的能力。
3、本发明巨大芽孢杆菌ZY2104具有提高发酵桔梗的抗氧化能力。
4、本发明巨大芽孢杆菌ZY2104具有提高中药主要成分的效果的能力。
5、本发明巨大芽孢杆菌ZY2104有望用于提高桔梗提取物中有效物质的含量，提高其抗氧化活性，为桔梗发酵研究与应用开发提供实验基础，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明中巨大芽孢杆菌ZY2104的形态学观察图；其中，A为巨大芽孢杆菌的基本形态，B为巨大芽孢杆菌的革兰氏染色结果；
图2为本发明中巨大芽孢杆菌ZY2104的生长曲线；
图3为本发明中巨大芽孢杆菌ZY2104具有β-D-葡萄糖苷酶活性；
图4为本发明中不同微生物发酵对桔梗提取液中总多酚、黄酮、多糖含量的影响图；其中，A为不同微生物发酵对桔梗提取液中总多酚含量的影响，B为不同微生物发酵对桔梗提取液中总黄酮含量的影响，C为不同微生物发酵对桔梗提取液中总多糖含量的影响；
图5为本发明中巨大芽孢杆菌ZY2104发酵前后桔梗提取液的总抗氧化能力图；
图6为本发明中巨大芽孢杆菌ZY2104发酵前后桔梗提取液的总还原能力图；
图7为本发明中巨大芽孢杆菌发酵前后对DPPH自由基清除率的影响图；
图8为本发明中巨大芽孢杆菌发酵前后桔梗提取液对羟自由基清除率的影响图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。
一株能够提高发酵桔梗的活性成分及抗氧化能力的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，所述巨大芽孢杆菌的名称为：ZY2104，分类名称为：巨大芽孢杆菌，保藏编号为：CGMCC NO.25062，保藏日期：2022年6月10日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
较优地，所述巨大芽孢杆菌是从新鲜桔梗根部土壤分离获得的。
较优地，所述巨大芽孢杆菌在R2A固体培养基上菌落呈圆形、灰白色，表面光滑湿润；
或者，所述巨大芽孢杆菌的基因序列为MN473280.1。
较优地，所述巨大芽孢杆菌具有β-葡萄糖苷酶活性。
较优地，所述巨大芽孢杆菌能够提高发酵桔梗中活性成分含量；
或者，所述巨大芽孢杆菌能够提高发酵桔梗的总抗氧化能力；
或者，所述巨大芽孢杆菌能够提高发酵桔梗的总还原能力；
或者，所述巨大芽孢杆菌能够提高发酵桔梗的DPPH自由基清除率；
或者，所述巨大芽孢杆菌能够提高发酵桔梗的羟自由基清除率。
一种利用如上所述的巨大芽孢杆菌发酵桔梗的方法，包括步骤如下：
将巨大芽孢杆菌ZY2104的种子发酵液，按2-5％接种量接种于桔梗提取液，发酵条件为：30-42℃摇床培养，转速为50-150r/min，发酵24-72h。
较优地，所述桔梗提取液的制备步骤如下：
将桔梗片用粉碎机粉碎后，过40目筛制成粉末，称量桔梗粉末和蒸馏水，桔梗粉末：蒸馏水的质量比为2.5：50，充分混匀后，于121℃，20min灭菌，制成桔梗提取液；
所述巨大芽孢杆菌ZY2104的种子发酵液的发酵方法为：
将冻存的巨大芽孢杆菌ZY2104菌液解冻后，接到R2A固体培养基上，于37℃培养箱倒置培养24h，挑取菌株形态最大、表面光滑湿润，边缘整齐的单菌落接种至R2A液体培养基中进行活化，再以1％的接种量接种于R2A液体培养基中37℃，150r/min培养24h。二次活化后制成种子发酵液。
如上所述的巨大芽孢杆菌在桔梗或发酵中药中的应用。
如上所述的巨大芽孢杆菌在提高桔梗发酵液中多酚、黄酮含量方面中的应用。
如上所述的巨大芽孢杆菌在提高桔梗发酵液中抗氧化活性方面中的应用。
具体地，相关制备及检测步骤如下：
实施例1
取新鲜桔梗根部土壤，采用稀释涂布平板法进行分离，具体方法如下：称取10g土壤样品于90mL灭菌生理盐水中充分混匀，采用10倍系列稀释方法，依次取不同梯度的土壤悬液100μL涂布于含有添加质量百分数0.05％柠檬酸铁和质量百分数0.1％七叶苷的R2A固体培养基(胰蛋白胨0.25g、酸水解酪蛋白0.5g、酵母浸粉0.5g、可溶性淀粉0.5g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸镁0.1g、丙酮酸钠0.3g、蛋白胨0.25g、葡萄糖0.5g)上，37℃倒置培养48h。利用七叶苷显色原理，根据颜色变化(变黑)进行筛选产β-葡萄糖苷酶的内生菌。将筛选的菌进行划线纯化后，接入R2A液体培养基中培养；分别取不同微生物采用三区划线方法接种于含有E-R2A固体培养基上，革兰氏染色镜检：菌株ZY2104为革兰氏阳性菌株，显微镜下呈杆状，在R2A平板培养基上生长，可形成表面灰白色，表面光滑湿润，边缘整齐的菌落，如图1所示。在R2A液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
该菌株与NCBI中GenBank的Bacillus megaterium菌种的同源性达99％。结果显示该菌种为巨大芽孢杆菌，命名为巨大芽孢杆菌ZY2104。
实施例2
巨大芽孢杆菌ZY2104的菌株的形态特征和生理生化特征：
(1)菌株的形态特征：菌株菌体呈球状；革兰氏染色呈阳性，有芽孢。R2A平板培养基上菌落光滑，菌体较大，呈圆形或近圆形，凸起，平铺，呈灰白色，不透明。
(2)菌株的生理生化特征：不产生苯丙氨酸脱氨酶，能水解明胶、淀粉；吲哚和V-P反应为阴性；不利用柠檬酸盐；可利用葡萄糖产酸；利用甘露醇产弱酸；不能利用阿拉伯糖、蔗糖产酸；在糖类中生长不产气。
实施例3
将实施例1中的巨大芽孢杆菌接入R2A固体培养基上于37℃培养48h。挑取生长状态良好的单菌落接种至R2A液体培养基中进行活化，再以1％的接种量接种于R2A液体培养基中,静置培养24h，每隔2小时取一次菌悬液测定OD 600，并绘制巨大芽孢杆菌的生长曲线。如图2所示，从图2可以看出，培养至18小时时，菌体生长进入稳定期。
实施例4
将实施例1中的巨大芽孢杆菌采用三区划线方法接种于添加七叶苷和柠檬酸铁的R2A固体培养基上，37℃倒置培养48h。利用七叶苷显色原理，根据颜色变化(变黑)评估其β-葡萄糖苷酶的活性。如图3所示，从图3可以看出，发现其中巨大芽孢杆菌ZY2104可以在七叶苷培养基中产黑色水解斑，并且颜色较深，说明其产生β-葡萄糖苷酶。
实施例5
将桔梗片用粉碎机粉碎后，过40目筛制成粉末，将锥形瓶中称量2.5g桔梗粉末和50mL蒸馏水，充分混匀后，于121℃，20min灭菌，制成桔梗提取液。按2％的接种量分别向桔梗提取液中接入不同菌株，未发酵组加入等量蒸馏水做对照。发酵72h后将发酵液转入离心管中8000r/min离心20min，取上清于121℃，灭菌20min。测量发酵液中多酚、黄酮、多糖含量。如图4所示，从图4A可以看出，其中巨大芽孢杆菌ZY2104发酵组总多酚含量最高，为5.06％±0.05mg/mL；从图4B可以看出其中巨大芽孢杆菌ZY2104发酵组的总黄酮含量最高，为5.83±0.06mg/mL；其中鼠李糖杆菌sw01发酵组的多糖含量最高，巨大芽孢杆菌ZY2104发酵组多糖含量为8.96±0.14mg/mL，也显著高于未发酵组5.55±0.43mg/mL。总之，相对于发酵组和其他微生物发酵组，巨大芽孢杆菌ZY2104发酵组总多酚、总黄酮含量均最高，总多糖含量也处于较高水平。
实施例6
将桔梗片用粉碎机粉碎后，过40目筛制成粉末，将锥形瓶中称量2.5g桔梗粉末和50mL蒸馏水，充分混匀后，于121℃，20min灭菌，制成桔梗提取液。按5％的接种量分别向桔梗提取液中接入巨大芽孢杆菌，未发酵组加入等量蒸馏水做对照。发酵72h后将发酵液转入离心管中8000r/min离心20min，取上清于121℃，灭菌20min。测量发酵液中多酚、黄酮含量。与未发酵组4.10±0.28mg/mL相比，巨大芽孢杆菌发酵之后，多酚含量提高到5.13±0.05mg/mL，黄酮含量由5.18±0.01mg/mL提高到6.11±0.06mg/mL。如表1所示。
表1巨大芽孢杆菌发酵桔梗前后多酚、黄酮的含量变化
多酚 黄酮
未发酵 4.10±0.28mg/mL 5.18±0.01mg/mL
巨大芽孢杆菌 5.13±0.05mg/mL 6.11±0.06mg/mL
实施例7
将桔梗片用粉碎机粉碎后，过40目筛制成粉末，将锥形瓶中称量2.5g桔梗粉末和50mL蒸馏水，充分混匀后，于121℃，20min灭菌，制成桔梗提取液。按5％的接种量分别向桔梗提取液中接入2％巨大芽孢杆菌和0.15g安琪酵母，未发酵组加入等量蒸馏水做对照。发酵72h后将发酵液转入离心管中8000r/min离心20min，取上清于121℃，灭菌20min。测量发酵液中多酚、黄酮、多糖含量。与未发酵组4.10±0.28mg/mL相比，巨大芽孢杆菌发酵之后，多酚含量提高到5.30±0.05mg/mL，黄酮含量由5.18±0.01mg/mL提高到5.85±0.06mg/mL。如表2所示。
表2巨大芽孢杆菌、安琪酵母发酵桔梗前后多酚、黄酮的含量变化
多酚 黄酮
未发酵 4.10±0.28mg/mL 5.18±0.01mg/mL
巨大芽孢杆菌、0.15g安琪酵母 5.30±0.05mg/mL 5.85±0.06mg/mL
实施例8
将桔梗片用粉碎机粉碎后，过40目筛制成粉末，将锥形瓶中称量2.5g桔梗粉末和50mL蒸馏水，充分混匀后，于121℃，20min灭菌，制成桔梗提取液。按2％的接种量分别向桔梗提取液中接入巨大芽孢杆菌，未发酵组加入等量蒸馏水做对照。发酵72h后将发酵液转入离心管中8000r/min离心20min，取上清于121℃，灭菌20min。如图5所示，在发酵液浓度为1ml/mL(即未稀释)时，未发酵的桔梗提取液总抗氧化活性为7.00±0.01μmol/mL，而经巨大芽孢杆菌发酵之后，桔梗提取物的总抗氧化能力达到9.63±0.34μmol/mL，相比于未发酵组提高了约37.5％，这些结果说明巨大芽孢杆菌ZY2104发酵显著提高了桔梗的总抗氧化能力。
实施例9
将桔梗片用粉碎机粉碎后，过40目筛制成粉末，将锥形瓶中称量2.5g桔梗粉末和50mL蒸馏水，充分混匀后，于121℃，20min灭菌，制成桔梗提取液。按2％的接种量分别向桔梗提取液中接入巨大芽孢杆菌，未发酵组加入等量蒸馏水做对照。发酵72h后将发酵液转入离心管中8000r/min离心20min，取上清于121℃，灭菌20min。如图6所示，在发酵液浓度为1ml/mL(即未稀释)时，巨大芽孢杆菌发酵组的还原能力是未发酵组的1.43倍。巨大芽孢杆菌ZY2104发酵提高了桔梗提取发酵液的还原能力。
实施例10
将桔梗片用粉碎机粉碎后，过40目筛制成粉末，将锥形瓶中称量2.5g桔梗粉末和50mL蒸馏水，充分混匀后，于121℃，20min灭菌，制成桔梗提取液。按2％的接种量分别向桔梗提取液中接入巨大芽孢杆菌，未发酵组加入等量蒸馏水做对照。发酵72h后将发酵液转入离心管中8000r/min离心20min，取上清于121℃，灭菌20min。巨大芽孢杆菌发酵对DPPH自由基清除率的影响如图7所示，在稀释不同倍数的情况下，未发酵桔梗提取液和经巨大芽孢杆菌发酵后的桔梗发酵液对DPPH自由基的清除率都具有随浓度增大而增大的趋势，且发酵之后对DPPH自由基的清除率都要高于未发酵组。在发酵液浓度为1ml/mL(即未稀释)时，巨大芽孢杆菌发酵之后的发酵液对自由基的清除率高达94.72％±3.23％，而未发酵组的清除率为87.31％±2.12％，可见巨大芽孢杆菌发酵后显著提高了桔梗发酵液对DPPH自由基的清除能力。
实施例11
将桔梗片用粉碎机粉碎后，过40目筛制成粉末，将锥形瓶中称量2.5g桔梗粉末和50mL蒸馏水，充分混匀后，于121℃，20min灭菌，制成桔梗提取液。按2％的接种量分别向桔梗提取液中接入巨大芽孢杆菌，未发酵组加入等量蒸馏水做对照。发酵72h后将发酵液转入离心管中8000r/min离心20min，取上清于121℃，灭菌20min。巨大芽孢杆菌发酵对羟自由基清除率的影响如图8所示，在发酵液浓度为0.125ml/mL(即稀释8倍)时，未发酵组羟自由基清除率为55.21％±0.69％，巨大芽孢杆菌ZY2104发酵之后的羟自由基清除率为62.43％±2.12％；在发酵液浓度为1ml/mL(即未稀释)时，未发酵组羟自由基清除率为93.81％±0.98％，发酵之后的羟自由基清除率高达97.17％±0.24％。这些结果说明巨大芽孢杆菌发酵显著提高了桔梗提取物的羟自由基清除能力。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (10)

1.一株能够提高发酵桔梗的活性成分及抗氧化能力的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌的名称为：ZY2104，分类名称为：巨大芽孢杆菌，保藏编号为：CGMCC NO.25062，保藏日期：2022年6月10日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的能够提高发酵桔梗的活性成分及抗氧化能力的巨大芽孢杆菌，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌是从新鲜桔梗根部土壤分离获得的。
3.根据权利要求1所述的能够提高发酵桔梗的活性成分及抗氧化能力的巨大芽孢杆菌，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌在R2A固体培养基上菌落呈圆形、灰白色，表面光滑湿润；
或者，所述巨大芽孢杆菌的基因序列为MN473280.1。
4.根据权利要求1所述的能够提高发酵桔梗的活性成分及抗氧化能力的巨大芽孢杆菌，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌具有β-葡萄糖苷酶活性。
5.根据权利要求1至4任一项所述的能够提高发酵桔梗的活性成分及抗氧化能力的巨大芽孢杆菌，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌能够提高发酵桔梗中活性成分含量；
或者，所述巨大芽孢杆菌能够提高发酵桔梗的总抗氧化能力；
或者，所述巨大芽孢杆菌能够提高发酵桔梗的总还原能力；
或者，所述巨大芽孢杆菌能够提高发酵桔梗的DPPH自由基清除率；
或者，所述巨大芽孢杆菌能够提高发酵桔梗的羟自由基清除率。
6.一种利用如权利要求1至5任一项所述的巨大芽孢杆菌发酵桔梗的方法，其特征在于：包括步骤如下：
将巨大芽孢杆菌ZY2104的种子发酵液，按2-5％接种量接种于桔梗提取液，发酵条件为：30-42℃摇床培养，转速为50-150r/min，发酵24-72h。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述桔梗提取液的制备步骤如下：
将桔梗片用粉碎机粉碎后，过40目筛制成粉末，称量桔梗粉末和蒸馏水，桔梗粉末：蒸馏水的质量比为2.5：50，充分混匀后，于121℃，20min灭菌，制成桔梗提取液；
所述巨大芽孢杆菌ZY2104的种子发酵液的发酵方法为：
将冻存的巨大芽孢杆菌ZY2104菌液解冻后，接到R2A固体培养基上，于37℃培养箱倒置培养24h，挑取菌株形态最大、表面光滑湿润，边缘整齐的单菌落接种至R2A液体培养基中进行活化，再以1％的接种量接种于R2A液体培养基中37℃，150r/min培养24h。二次活化后制成种子发酵液。
8.如权利要求1至5任一项所述的巨大芽孢杆菌在桔梗或发酵中药中的应用。
9.如权利要求1至5任一项所述的巨大芽孢杆菌在提高桔梗发酵液中多酚、黄酮含量方面中的应用。
10.如权利要求1至5任一项所述的巨大芽孢杆菌在提高桔梗发酵液中抗氧化活性方面中的应用。
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